本发明属于生物制药
技术领域：
，具体涉及硫化氢作用脂多糖诱导l6细胞在膈肌功能障碍中的应用。
背景技术：
膈肌位于胸腹腔之间，是主要的呼吸肌，呼吸功能的60％～80％由膈肌完成，故其收缩性能显著影响着呼吸效率。膈肌功能障碍是全球面临的重要临床问题，但其发病率和影响往往被忽视，且防治措施较少。感染是危重病人膈肌功能障碍的主要危险因素，脓毒症可诱导膈肌功能障碍。近年来，硫化氢(hydrogensulfide，h2s)被认为是继no和co之后的第三种气体信号分子，参与机体多个系统的生理病理调节。在呼吸系统中，h2s对调节肺循环、气道张力、纤维化、细胞增殖或凋亡、氧化应激及炎症等有重要功能。h2s对平滑肌收缩性的影响在全身不同器官中都有明确的研究和报道，如血管、胃肠道、气管、膀胱、输卵管和子宫等。然而，h2s对横纹肌收缩性的影响和对脓毒症诱导的膈肌功能障碍的研究机理却鲜有报道。技术实现要素：基于现有技术中脓毒症诱导发生膈肌功能障碍的研究的局限性，本发明的目的在于提供硫化氢作用脂多糖诱导l6细胞在膈肌功能障碍中的应用；本发明的目的还在于提供一种非治疗目的的脓毒症大鼠膈肌功能障碍模型的构建方法和构建获得的脓毒症大鼠膈肌功能障碍模型。通过给予h2s供体nahs时可促进细菌内毒素脂多糖lps诱导的l6细胞的增殖并抑制其凋亡，且具有抗炎、抗氧化等作用，显著改善膈肌功能障碍，降低脓毒症大鼠的膈肌炎症。本发明的目的通过以下技术方案得以实现：一方面，本发明提供硫化氢作用脂多糖诱导l6细胞在膈肌功能障碍中的应用。上述的应用中，优选地，其包括以下步骤：培养大鼠成肌细胞l6细胞，待l6细胞生长至对数期更换无血清培养基，然后加入细菌内毒素脂多糖(lps)，并快速加入硫化氢供体继续培养；通过实验检测获取的指标用于阐明脓毒症诱导的膈肌功能障碍的机制。上述的应用中，优选地，实验检测可以包括蛋白免疫印迹法、酶联免疫吸附法、edu法、mts法、荧光法、分光光度法、tunel法和elisa法等中的一种或多种的组合。上述的应用中，优选地，所述细菌内毒素脂多糖的用量可以为250μg/ml。上述的应用中，优选地，所述硫化氢供体为nahs。上述的应用中，优选地，所述硫化氢供体的用量可以为100μmol/l。上述的应用中，优选地，通过蛋白免疫印迹法检测获取硫化氢合成酶cse、cbs和3-mst蛋白表达量的指标，用于阐明硫化氢作用脂多糖诱导l6细胞对l6细胞硫化氢合成酶表达量的影响。通过该检测发现l6细胞中硫化氢合成酶的表达水平明显降低，且l6细胞及细胞上清液中硫化氢的含量也明显降低；此应用能够阐明lps导致的细胞活力的下降可能与内源性硫化氢的降低有关。上述的应用中，优选地，通过mts法检测获取l6细胞活力的指标，用于阐明硫化氢作用脂多糖诱导l6细胞对l6细胞活力的影响。该应用能够阐明硫化氢作用脂多糖诱导l6细胞能够提高l6细胞的活力。上述的应用中，优选地，通过edu法检测获取l6细胞增殖率的指标，用于阐明硫化氢作用脂多糖诱导l6细胞对l6细胞增殖能力的影响。该应用能够阐明硫化氢作用脂多糖诱导l6细胞能够提高l6细胞的增殖能力。上述的应用中，优选地，通过tunel法和蛋白免疫印迹法检测获取l6细胞凋亡率和凋亡信号通路蛋白的表达量的指标，用于阐明硫化氢作用脂多糖诱导l6细胞对l6细胞凋亡的影响。该应用能够阐明硫化氢作用脂多糖诱导l6细胞能够降低l6细胞的凋亡水平。上述的应用中，优选地，通过荧光法、分光光度法和蛋白免疫印迹法检测获取l6细胞活性氧含量、cat活性、sod活性、gsh-px活性和mapk信号通路蛋白erk、p38和jnk的表达量的指标，用于阐明硫化氢作用脂多糖诱导l6细胞对l6细胞抗氧化能力的影响。该应用能够阐明硫化氢作用脂多糖诱导l6细胞能够介导l6细胞中ros/mapk途径从而减少l6细胞的凋亡。上述的应用中，优选地，通过elisa法和蛋白免疫印迹法检测获取l6细胞的mcp-1、tnf-α、il-1β、il-6、il-10、il-18表达水平的指标，以及p50、p-p65表达水平的指标和p-p65/p65比率的指标，用于阐明硫化氢作用脂多糖诱导l6细胞对l6细胞分泌炎性因子的水平和tlr4/nf-κb信号通路蛋白的影响。该应用能够阐明硫化氢作用脂多糖诱导l6细胞能够抑制tlr4/nf-κb信号转导途径来缓解lps诱导的炎症。另一方面，本发明还提供一种非治疗目的的脓毒症大鼠膈肌功能障碍模型的构建方法，其包括以下步骤：向大鼠腹腔中注入细菌内毒素脂多糖，随后立即向腹腔中注入硫化氢供体；培养大鼠构建获得脓毒症大鼠膈肌功能障碍模型。上述的方法中，优选地，所述细菌内毒素脂多糖的注入量为5mg/kg。上述的方法中，优选地，所述硫化氢供体为nahs。上述的方法中，优选地，所述硫化氢供体的注入量为5mg/kg。再一方面，本发明还提供上述的构建方法获得的脓毒症大鼠膈肌功能障碍模型。通过构建的脓毒症大鼠膈肌功能障碍模型的大鼠的检测指标能够阐明硫化氢作用脂多糖诱导膈肌功能障碍能够阻止lps诱导的脓毒症大鼠膈肌中mhcslow和mhcfastcsa的减少，同时硫化氢能够起到一定的保护作用，显著降低炎性细胞因子，改善由lps诱导的膈肌损伤，构建的脓毒症大鼠膈肌功能障碍模型对膈肌功能障碍研究和预防起到指导性作用。本发明的硫化氢作用脂多糖诱导l6细胞在膈肌功能障碍中的应用通过给予h2s供体nahs时可促进lps诱导的l6细胞的增殖并抑制其凋亡，且具有抗炎、抗氧化等作用，显著改善膈肌功能障碍，降低脓毒症大鼠的膈肌炎症；构建的脓毒症大鼠膈肌功能障碍模型对膈肌功能障碍研究和预防起到指导性作用。附图说明图1为本发明实施例2中蛋白质免疫印迹检测细胞中h2s合成酶的表达量；图2为本发明实施例2中elisa法检测细胞内及上清液中h2s的浓度；图3为本发明实施例3中edu法检测各组细胞增殖率；图4为本发明实施例4中采用mts法时h2s对lps诱导的l6细胞活力的影响；图5为本发明实施例5中tunel法检测各组细胞凋亡率；图6为本发明实施例5中蛋白免疫印迹检测凋亡蛋白表达水平；图7为本发明实施例6中活性氧水平对比实验数据图；图8为本发明实施例6中分光光度法检测细胞内的抗氧化酶活性数据图；图9为本发明实施例6中mapk信号通路蛋白的表达水平实验数据图；图10为本发明实施例7中细胞上清中炎性因子水平实验数据图；图11为本发明实施例7中tlr4/nf-κb信号通路蛋白的表达水平实验数据图；图12为本发明实施例8中各组大鼠给药前后0-24h后的体重；图13为本发明实施例8中各组大鼠24h后的肌条质量；图14为本发明实施例8中各频率刺激下的各组大鼠膈肌收缩张力-频率曲线图；图15为本发明实施例8中各组大鼠最大强直收缩力测试数据图；图16为本发明实施例8中各组大鼠单收缩张力测试数据图；图17为本发明实施例8中各频率刺激下的各组大鼠肌条疲劳指数图；图18为本发明实施例8中膈肌肌条张力最大上升速率及张力最大下降速率的测试数据；图19为本发明实施例8中快肌纤维和慢肌纤维的免疫组化数据图；图20为本发明实施例8中快肌纤维和慢肌纤维的横截面积的统计数据图；图21为本发明实施例9中qrt-pcr检测膈肌组织中炎性因子的mrna表达水平；图22为本发明实施例9中膈肌组织的he染色、组织细胞增殖和凋亡免疫组化数据图。具体实施方式为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。本发明所用到的主要实验试剂及仪器设备简要介绍如下。主要试剂、药品及样品：大鼠成肌细胞l6细胞购自上海生命科学研究院；lps(escherichiacoli055：b5)购自美国sigma公司；mts购自美国sigma公司；细胞增殖检测试剂盒购自锐博生物科技有限公司；细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；活性氧检测及抗氧化酶试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；动物实验用麦氏浴槽、l型通气沟、蛙心夹等均为蚌埠医学院提供；其余未说明试剂、药品等均为实验室常用分析纯类制品，不再赘述。主要仪器设备：实时定量pcr仪(型号：abi7500fast)，为美国appliedbiosystems公司产品；荧光倒置显微镜(型号：eclipseti)，购自nikon公司；张力换能器(型号：jz100)，购自上海欣曼科教设备有限公司；微调固定器(型号：med2d1a)，购自南京美易科技有限公司；生物信号采集处理系统(型号：medlab-u/4c)，购自南京美易科技有限公司。实施例1本实施例提供硫化氢作用脂多糖诱导l6细胞在膈肌功能障碍中的应用，其包括以下步骤：培养大鼠成肌细胞l6细胞，待l6细胞生长至对数期更换无血清培养基，然后加入250μg/ml的细菌内毒素脂多糖(lps)，并快速加入硫化氢供体nahs100μmol/l继续培养；通过蛋白免疫印迹法、酶联免疫吸附法、edu法、mts法、荧光法、分光光度法、tunel法和elisa法等实验检测获取的指标用于阐明脓毒症诱导的膈肌功能障碍的机制。同时培养对照组大鼠成肌细胞l6细胞和培养lps组(仅添加250μg/ml的细菌内毒素脂多糖)。实施例2h2s合成酶蛋白水平检测及h2s浓度检测分别提取对照组、lps组的总蛋白，对其浓度进行测定后，进行westernblotting检测，以确定细胞中h2s合成酶cse、cbs及3-mst的蛋白表达水平；elisa进一步检测细胞中及细胞上清中h2s的浓度。如图1和图2所示，图1中的a-d为蛋白质免疫印迹检测细胞中h2s合成酶的表达量；图2中的a-b为elisa法检测细胞内及上清液中h2s的浓度。由图1和图2表明：在lps刺激l6细胞24h后，细胞中h2s合成酶cse、cbs及3-mst的蛋白表达降低，且细胞内及细胞上清中h2s的浓度也明显下降。因此，我们推测，lps导致的细胞活力下降可能与内源性h2s的降低有关。实施例3采用edu法检测h2s对lps诱导的l6细胞增殖的影响具体过程如下：edu标记(12孔板操作)：用细胞培养基按1000∶1的比例稀释edu溶液(试剂a)，制备适量50μmedu培养基；每孔加入300μl50μmedu培养基孵育2h，弃培养基；pbs清洗细胞2次，每次5min。细胞固定化：每孔加入150μl细胞固定液(即含4％多聚甲醛的pbs)室温孵育30min，弃固定液；每孔加入150μl2mg/ml甘氨酸，脱色摇床孵育5min，弃甘氨酸溶液；每孔加入300μlpbs，清洗1次，5min，弃pbs；(加强)每孔加入100μl渗透剂(0.5％triton-x100的pbs)脱色摇床孵育10min，pbs清洗1次，5min。apollo染色：每孔加入300μl的1×apollo染色反应液(一定要按顺序配，现用现配，30min用完)，避光，室温，脱色摇床孵育30min，弃染色反应液；apollo染色反应液配制：1.5ml(具体成分如表1所示)表1：去离子水1407μlapollo反应缓冲液(b)75μlapollo催化剂溶液(c)15μlapollo荧光染料溶液(d)4.5μlapollo缓冲添加剂(e)13.5mg加入300μl渗透剂(0.5％triton-x100的pbs)脱色摇床清洗2次，每次10min，弃渗透剂；(加强)每孔每次加入300μl甲醇清洗1-2次，每次5min，pbs洗1次，每次5min。dna染色：用去离子水按100∶1的比例稀释试剂f(hoechst33342)，制备适量1×hoechst33342反应液，避光保存；每孔加入300μl1×hoechst33342反应液，避光，室温，脱色摇床孵育30min，弃染色反应液；每孔每次加入300μlpbs洗3次，每次5min；每孔加300μlpbs保存，拍照，计数细胞增值率。结果如图3所示，图3为edu法检测h2s合成酶的表达量；由图3可以看出：lps组的细胞增殖能力明显下降，而100μm的h2s则逆转了该现象。实施例4采用mts法确定h2s对lps诱导的l6细胞活力的影响具体过程如下：正常全培养基培养细胞，待细胞生长至80％-90％，消化收集细胞并计数，然后接种至96孔板中，每孔接种4000个细胞。加入200μl培养基，正常培养过夜。次日，弃上清，pbs洗1次，每孔加入100μl无血清的dmem培养基，其中lps组加入250μg/mllps，lps+h2s组在加入250μg/mllps后随及快速加入100μmol/lh2s供体nahs。每组设6个复孔并放入细胞培养箱培养24h。24h后，取出细胞，避光，每孔加入20μl的mts试剂，置入37℃恒温箱继续避光孵育2h，结束后，在490nm条件下检测吸光度，计算细胞活力：细胞活力(％ofcontrol)＝(药物组a值-调零孔a值)/(对照孔a值-调零孔a值)×100％结果如图4所示，图4为采用mts法时h2s对lps诱导的l6细胞活力的影响；由图4可知：与lps组相比，h2s供体对lps所造成的细胞活力下降有逆转作用。实施例5为检测h2s对lps诱导的l6细胞凋亡的影响，进行了tunel实验，相关过程介绍如下。(1)采用tunel法确定h2s对lps诱导的l6细胞凋亡的影响具体过程如下：培养细胞24h后，用pbs将细胞清洗1次；用4％多聚甲醛固定30min；pbs清洗1次；加入含0.1％triton-x100的pbs，冰浴孵育2min；pbs洗2次，配250μltunel检测液：10μltdt酶+240μl荧光标记液；在样品上加50μltunel检测液，37℃避光孵育60min；pbs洗3次；dapi染色：5％bsa1∶1000稀释，孵育3min，pbs洗3次；每孔加200μlpbs保存，荧光显微镜下观察，拍照，计数并统计细胞凋亡率。结果如图5所示，图5中的a-b为tunel法检测各组细胞凋亡率；由图5可以看出：lps组细胞的凋亡水平明显增加，而lps+h2s组的细胞凋亡水平则明显降低。我们推测lps可能诱导l6细胞的凋亡，而100μm的h2s对lps诱导的凋亡有逆转作用。(2)凋亡蛋白水平的检测westernblot实验检测凋亡信号通路相关蛋白的表达情况，结果如图6所示，图6中的a-h为蛋白免疫印迹检测凋亡蛋白表达水平；由图6结果表明：lps会诱导l6细胞凋亡蛋白水平的增加，外源性给予h2s可以降低其凋亡水平。实施例6为检测h2s对lps诱导的l6细胞抗氧化能力的影响，进行了活性氧水平及抗氧化酶活力的检测，相关过程介绍如下。(1)活性氧水平及抗氧化酶的检测收集细胞并计数，以每孔1.0×106细胞数接种于6孔板中，加入无血清培养基培养24小时至密度为80％-90％；原位装载探针：用无血清培养液按照1∶1000稀释dcfh-da，使终浓度为10μmol/l；去除细胞培养液，每孔加入1ml稀释好的dcfh-da，37℃细胞培养箱孵育20min；用无血清细胞培养基洗涤细胞3次，以去除未进入细胞内的dcfh-da；倒置荧光显微镜下观察拍照。结果如图7-图8所示，图7中的a-b为活性氧水平对比实验数据图：由图7可以看出：lps组的ros水平显著升高，在应用外源性h2s后，ros的产生水平明显下降。图8中的a-c为分光光度法检测细胞内的抗氧化酶活性数据图；由图8可以看出：lps组的过氧化氢酶(catalase，cat)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，sod)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase，gsh-px)的活性显著降低，而这些都在给予h2s后得到逆转。(2)mapk信号通路蛋白的表达水平采用westernblot检测细胞中mapk信号通路蛋白的表达水平实验数据图，结果如图9所示，图9中的a-c分别为mapk信号通路蛋白erk、p38和jnk表达水平实验数据图；由图9可以看出：在lps诱导的l6细胞中，发现p38，jnk和erk的蛋白磷酸化水平升高，用h2s处理后显著降低了这些蛋白激酶的磷酸化。这些结果表明h2s可能通过介导l6细胞中ros/mapk途径从而减少细胞的凋亡。实施例7为检测细胞分泌炎性因子的水平及tlr4/nf-κb信号通路蛋白的影响，进行了elisa及westernblot实验，相关过程介绍如下。(1)elisa法检测各组细胞上清中炎性因子的表达水平收集细胞上清，300g离心10min去除沉淀物；按照试剂盒说明书准备好所需试剂及工作浓度标准品；加入300μl1×洗液静置30秒；弃掉洗液，在吸水滤纸上将微孔板拍干；复孔加入100μl倍比稀释的标准品；空白孔加入100μl标准品稀释液；样本孔加入100μl细胞上清；每孔加入50μl检测抗体，封板膜封板，300转/分钟振荡，室温孵育2h；弃去液体，每孔加入300μl洗液洗板4次，拍干。然后加入100μl标记二抗，使用新的封板膜封板，300转/分钟振荡，室温孵育40min；弃去液体，加入300μl洗液洗板4次，拍干。加入100μl显色底物tmb，室温避光孵育15min；每孔加入100μl终止液，颜色由蓝色变为黄色，酶标仪测定450nm下的od值。结果如图10所示，图10中的a-f分别为细胞上清中炎性因子mpc-1、tnf-α、il-1β、il-6、il-10和il-18水平实验数据图；由图10结果看出：lps组mcp-1、tnf-α、il-1β、il-6、il-10和il-18的表达水平均显著升高；外源性h2s治疗后显著降低了这些炎性因子的水平，表明h2s可以有效缓解lps诱导的l6细胞的炎症。(2)westernblot检测细胞中tlr4/nf-κb信号通路蛋白的表达水平结果如图11所示，图11中的a-f分别为tlr4、tak1、ikkα/β、iκbα、p50和p-p65的磷酸化水平数据图；由图11可以看出：lps刺激后显著增加了tak1，ikkα/β和iκbα的磷酸化水平，然而，这些效应在给予h2s后显著逆转。与对照组相比，lps处理增加了p50和p-p65的蛋白表达以及p-p65/p65比率；给予外源性h2s则降低了p50和p-p65的表达水平以及p-p65/p65的比率。上述结果表明h2s可能通过抑制tlr4/nf-κb信号转导途径来缓解lps诱导的炎症。实施例8为证明h2s能否提高脓毒症大鼠的膈肌张力，我们构建了脓毒症大鼠膈肌功能障碍模型，并进行了膈肌力学指标的检测，相关过程介绍如下。(1)膈肌力学指标测定采用腹腔注射lps的方法构建脓毒症大鼠膈肌功能障碍模型。随机将大鼠分为3组：对照组、lps组、h2s+lps组，每组6只。给药方法：对照组大鼠给予腹腔注射生理盐水；lps组给予腹腔注射lps(5mg/kg，生理盐水溶解)以构建膈肌无力模型；h2s+lps组在给予腹腔注射lps(5mg/kg)后，随及腹腔注射nahs(100μmol/kg，生理盐水溶解)。所有大鼠均在注射24h后处死，并检测给药前后的体重变化，取膈肌组织，具体过程如下：2％戊巴比妥钠(0.3ml/100g)麻醉大鼠后，迅速开胸取膈肌组织(包括中心腱和部分肋骨)。将膈肌组织浸于玻璃皿中，皿中盛满kreb’s液，持续匀速通入95％o2和5％co2的混合气体。沿中心腱将膈肌剪成两部分，左侧去除中心腱、肋骨，一半迅速放入-80℃冰箱保存，以备分子生化检测及切片制作，另一半浸入4％pfa固定，用于石蜡切片制作；右侧组织剪取长方形大小的肌条(保留一根肋骨及部分中心腱)进行膈肌张力测定。结果如图12-18所示，图12为各组大鼠给药前后0-24h后的体重；图13为各组大鼠24h后的肌条质量；图14为各频率刺激下的各组大鼠膈肌收缩张力-频率曲线图；图15为各组大鼠最大强直收缩力测试数据图；图16为各组大鼠单收缩张力测试数据图；图17为各频率刺激下的各组大鼠肌条疲劳指数图；图18中的a和b分别为膈肌肌条张力最大上升速率及张力最大下降速率的测试数据；由图12-18实验数据看出：lps组大鼠的膈肌各项力学指标均显著低于对照组，h2s+lps组较lps组则显著提高。(2)膈肌组织肌球蛋白免疫组化通过对膈肌组织快肌纤维肌球蛋白(mhcfast)和慢肌纤维肌球蛋白(mhcslow)进行免疫组织化学染色，结果如图19-图20所示，图19为快肌纤维(fastmhc)和慢肌纤维(slowmhc)的免疫组化数据图；图20中的a和b分别为快肌纤维(fastmhc)和慢肌纤维(slowmhc)的横截面积的统计数据图。由图19和图20可以看出：lps处理后的mhcfast和mhcslow的横截面积(csa)较对照组明显降低，而lps+h2s组较lps组其csa明显增加。由此说明h2s可以阻止lps诱导的脓毒症大鼠膈肌中mhcslow和mhcfast的csa的减少。实施例9为检测膈肌组织中各炎性因子的mrna表达水平及组织中细胞的增殖和凋亡实验，我们进行了qrt-pcr实验和免疫组化，相关过程介绍如下。(1)qrt-pcr检测膈肌组织中炎性因子的mrna表达水平具体过程如下：首先设计大鼠引物如下表2所示：表2：分别提取各组细胞的总rna，反转录成cdna，进行实时荧光定量pcr检测，检测时以gapdh作为参考对照。结果如图21所示，图21中的a-f分别为qrt-pcr检测膈肌组织中炎性因子mcp-1、tnf-α、il-1β、il-6、il-10和il-18的mrna表达水平；由图21可以看出：lps组中mcp-1、tnf-α、il-1β、il-6、il-10和il-18的基因表达增加，给予h2s显著降低了这些炎性细胞因子的基因表达。(2)膈肌组织he染色及细胞增殖和凋亡情况结果如图22所示，图22中的a-c分别为膈肌组织的he染色、组织细胞增殖和凋亡免疫组化数据图；由图22可以看出：对照组大鼠的膈肌肌纤维走向规则，lps组的膈肌组织则破坏明显，走向紊乱，组织水肿，肌纤维之间出现溶解断裂；lps+h2s组肌纤维较lps组排列规则，这说明h2s具有一定的保护作用，可以改善由lps诱导的膈肌损伤。ki67免疫组化结果显示：lps抑制了膈肌细胞的增殖，并在给予h2s后得到有效逆转；活化的caspase-3免疫组化则与此趋势相反。以上结果共同表明，h2s可以降低脓毒症大鼠的膈肌炎症并抑制其细胞的凋亡。综上所述，本发明的硫化氢作用脂多糖诱导l6细胞在膈肌功能障碍中的应用通过给予h2s供体nahs时可促进lps诱导的l6细胞的增殖并抑制其凋亡，且具有抗炎、抗氧化等作用，显著改善膈肌功能障碍，降低脓毒症大鼠的膈肌炎症；构建的脓毒症大鼠膈肌功能障碍模型对膈肌功能障碍研究和预防起到指导性作用。当前第1页12