一种吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的制备方法与流程

本发明涉及纳米医药技术领域，更具体的是涉及一种吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的制备方法。

背景技术

反式茴香脑是茴香油的主要成分，是天然的抗氧化剂，具有抗菌，抗真菌和麻醉特性。研究表明茴香脑可能通过抑制tnf信号、通过对pge2和no的产生和/或释放的抑制作用等机制有效控制一些非免疫性急性炎症相关疾病，表现出抗炎特性。在小鼠急性和持续性炎症模型中发现，反式茴香脑可降低tnf-α等细胞因子的浓度；在脂多糖(lps)诱导的急性肺部炎症模型中，反式茴香脑也表现出对总蛋白质浓度，炎症细胞和炎症介质等的抑制作用。

虽然反式茴香脑具有良好的抗炎效果，但其极强的疏水性很大程度上限制了反式茴香脑在体内的直接应用。其在目前的实验中只能溶解在二甲基亚砜、二氯甲烷、吐温-20等有机溶剂中使用，这类有机溶剂具有一定的毒性、溶解度不高，并且不能大剂量的给药使用。有学者研究尝试应用毒性较小的peg高分子来作为反式茴香脑的助溶剂，但peg的量超过10％小鼠就会出现溶血现象。同时反式茴香脑在肺炎的治疗中常通过灌肺给药，过程痛苦并且需要多次给药，给实验动物带来了巨大的痛苦。

为了克服疏水性药物的缺点，减少有机溶剂的毒副作用并降低给药频率，人们选择采用纳米药剂来解决上述难题。纳米药剂指纳米药物颗粒是指粒径在10～1000纳米的颗粒颗粒,它可以将药物或者其他功能性分子包裹在纳米颗粒之中或修饰在其表面，并将其运输到目的部位。纳米颗粒具有载药量高、制备方法简单、毒性低并可以在体内循环长时间循环并缓慢释放药物等优点。但是目前并没有关于反式茴香脑的纳米颗粒的研究报道。

白蛋白纳米颗粒作为一种绿色可降解的安全性较好纳米颗粒，可用于负载脂溶性药物。将白蛋白水溶液与溶解药物的油性溶剂高速搅拌混合形成乳液，之后加入戊二醛进行交联，最终旋转蒸发除去油相得到稳定的纳米粒。这种方法可以大量连续生产载药的白蛋白纳米颗粒。制备完成的白蛋白纳米颗粒具备可生物降解、制备容易且可重复性好等特点。

为了赋予纳米颗粒示踪的效果，验证纳米颗粒可以被巨噬细胞吞噬从而发挥验证调节作用，我们还可以在颗粒制备过程中来添加有机染料来进行荧光成像。因此，研制出一种颗粒均匀、成球性好、避免有机溶剂的毒性、具有良好的缓释作用，可以有效提高反式茴香脑药物的使用效率，增强治疗效果并且可以实时跟踪纳米颗粒等优势的药物颗粒具有重大的意义，在生物技术和医药技术领域具有重要的科研和临床应用前景。

技术实现要素：

本发明提出了一种具有粒径小，细胞毒性小，载药量相对较高并且可以实时示踪的纳米颗粒等优势的新型白蛋白颗粒的制备方法。

本发明的技术方案包括：利用白蛋白为原料，通过调整包载的吲哚箐绿荧光染料以及反式茴香脑药物的比例及溶剂，充分控制颗粒粒径的大小，制备出粒径在20-50纳米的颗粒；将吲哚箐绿荧光染料以及反式茴香脑同时包载于白蛋白纳米颗粒中，使其兼具治疗和成像功能。用高效液相色谱测定体外药物释放，在磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)中，缓释96h释放度仅达到31％，具有明显的缓释作用。

具体说明如下：

一种吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的制备方法；其步骤如下：

1)载药白蛋白纳米颗粒的制备：配置10～20mg/ml白蛋白水溶液2～2.5ml；

2)加入用二氯甲烷、乙醇或者二甲基亚砜配置的40～60mg/ml、反式茴香脑溶液10～15μl，以及80～100mg/ml的吲哚箐绿溶液1～3μl；

3)搅拌之后加入70～100μl的戊二醛交联剂水溶液，5～50℃条件下搅拌反应；

4)待反应结束,用水系滤膜过滤；

5)滤液离心分离，去离子水洗涤，得到吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒。

优选步骤3)5～50℃条件下于600～800rpm/min搅拌反应2～6小时。

优选步骤4)用220nm水系滤膜过滤。

优选步骤5)滤液以6000～8,000rpm/min、离心3～6分钟。

优选步骤5)去离子水洗3～6遍。

本发明制备的包载反式茴香脑以及吲哚箐绿的白蛋白纳米颗粒，直径为20～50纳米，载药率为5～8％。

优选白蛋白为牛血清白蛋白或人血清白蛋白。

将颗粒体外释药采用高效液相色谱法考察反式茴香脑一牛血清白蛋白纳米颗粒的体外释药规律,磷酸盐缓冲液作为释药介质,将原液分成多份，同时在摇床上37℃恒速摇晃,定时取样,计算释药率。

本发明的优势在于：1)合成过程简便，快捷，无毒无污染。2)本发明制备出的吲哚箐绿反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的直径为20～50纳米，载药率为5～8％，细胞存活率为80％～95％。比原有技术载药量提高了4％，且粒径缩小了几百纳米，更便于在细胞以及动物体内应用。3)本发明制备出的颗粒可通过观察纳米载细胞内吲哚箐绿荧光染料的分布情况来实时跟踪颗粒所到达的位置。4)通过高效液相色谱hplc测定体外药物释放，在ph＝6.5的pbs中，96小时内释放度仅达到31％，说明该颗粒具有缓释作用。

附图说明

图1-1：实施例1制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜照片。

图1-2：实施例2制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜照片。

图1-3：实施例3制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜照片。

图1-4：实施例4制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜照片。

图1-5：实施例5制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜照片。

图1-6：实施例6制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜照片。

图1-7：实施例7制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜照片。

图1-8：实施例8制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜照片。

图2：吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒体外药物释放与时间关系图。

图3：吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒细胞毒性分析柱状图。

图4-1：为细胞核dapi染色荧光成像。

图4-2：为吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒内吞荧光成像。

图4-3：为两张荧光图片merge之后的成像结果图片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明不限于此。

实施例1：

1)载药牛血清白蛋白纳米颗粒的制备：取10mg/ml牛血清白蛋白水溶液2ml，超声使其均匀。

2)用移液枪缓慢地加入用二氯甲烷配置的40mg/ml反式茴香脑溶液15μl，以及80mg/ml的吲哚箐绿溶液2μl。

3)搅拌均匀之后迅速加入100μl的戊二醛交联剂水溶液，在最后于700rpm/min，20℃条件下搅拌反应3小时。

4)待反应结束,用220nm水系滤膜过滤。

5)滤液以8,000rpm/min，离心4分钟，去离子水洗5遍，得到包载反式茴香脑以及吲哚箐绿的牛血清白蛋白纳米颗粒。

制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜观察形貌(图1-1)。

实施例2：

1)载药牛血清白蛋白纳米颗粒的制备：取15mg/ml牛血清白蛋白水溶液2ml，超声使其均匀。

2)用移液枪缓慢地加入用二氯甲烷配置的40mg/ml反式茴香脑溶液12μl，以及80mg/ml的吲哚箐绿溶液1μl。

3)搅拌均匀之后迅速加入80μl的戊二醛交联剂水溶液，在最后于800rpm/min，20℃条件下搅拌反应4小时。

4)待反应结束,用220nm水系滤膜过滤。

5)滤液以8,000rpm/min，离心4分钟，去离子水洗5遍，得到包载反式茴香脑以及吲哚箐绿的牛血清白蛋白纳米颗粒。

制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜观察形貌(图1-2)。

实施例3：

1)载药牛血清白蛋白纳米颗粒的制备：取15mg/ml的牛血清白蛋白水溶液2ml，超声使其均匀。

2)用移液枪缓慢地加入用二甲基亚砜配置的50mg/ml反式茴香脑溶液12μl，以及90mg/ml的吲哚箐绿溶液1μl。

3)搅拌均匀之后迅速加入100μl的戊二醛交联剂水溶液，在最后于700rpm/min，20℃条件下搅拌反应3小时。

4)待反应结束,用220nm水系滤膜过滤。

5)滤液以7,000rpm/min，离心5分钟，去离子水洗6遍，得到包载反式茴香脑以及吲哚箐绿的牛血清白蛋白纳米颗粒。

制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜观察形貌(图1-3)。

实施例4：

1)载药牛血清白蛋白纳米颗粒的制备：取20mg/ml牛血清白蛋白水溶液2ml，超声使其均匀。

2)用移液枪缓慢地加入用二甲基亚砜配置的50mg/ml反式茴香脑溶液15μl，以及80mg/ml2μl的吲哚箐绿溶液。

3)搅拌均匀之后迅速加入100μl的戊二醛交联剂水溶液，在最后于700rpm/min，20℃条件下搅拌反应3小时。

4)待反应结束,用220nm水系滤膜过滤。

5)滤液以8,000rpm/min，离心4分钟，去离子水洗3遍，得到包载反式茴香脑以及吲哚箐绿的牛血清白蛋白纳米颗粒。

制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜观察形貌(图1-4)。

实施例5：

1)载药牛血清白蛋白纳米颗粒的制备：取10mg/ml牛血清白蛋白水溶液3ml，超声使其均匀。

2)用移液枪缓慢地加入用乙醇配置的60mg/ml反式茴香脑溶液10μl，以及80mg/ml的吲哚箐绿溶液1.5μl。

3)搅拌均匀之后迅速加入70μl的戊二醛交联剂水溶液，在最后于700rpm/min，20℃条件下搅拌反应3小时。

4)待反应结束,用220nm水系滤膜过滤。

5)滤液以7,000rpm/min，离心6分钟，去离子水洗3遍，得到包载反式茴香脑以及吲哚箐绿的牛血清白蛋白纳米颗粒。

制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜观察形貌(图1-5)。

实施例6：

1)载药牛血清白蛋白纳米颗粒的制备：取15mg/ml牛血清白蛋白水溶液3ml，超声使其均匀。

2)用移液枪缓慢地加入用乙醇配置的50mg/ml反式茴香脑溶液10μl，以及的90mg/ml吲哚箐绿溶液3μl。

3)搅拌均匀之后迅速加入70μl的戊二醛交联剂水溶液，在最后于700rpm/min，20℃条件下搅拌反应2小时。

4)待反应结束,用220nm水系滤膜过滤。

5)滤液以6,000rpm/min，离心6分钟，去离子水洗4遍，得到包载反式茴香脑以及吲哚箐绿的牛血清白蛋白纳米颗粒。

制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜观察形貌(图1-6)。

实施例7：

1)载药人血清白蛋白纳米颗粒的制备：取20mg/ml人血清白蛋白水溶液2ml，超声使其均匀。

2)用移液枪缓慢地加入用二氯甲烷配置的40mg/ml反式茴香脑溶液15μl，以及80mg/ml的吲哚箐绿溶液2μl。

3)搅拌均匀之后迅速加入100μl的戊二醛交联剂水溶液，在最后于700rpm/min，20℃条件下搅拌反应3小时。

4)待反应结束,用220nm水系滤膜过滤。

5)滤液以8,000rpm/min，离心4分钟，去离子水洗5遍，得到包载反式茴香脑以及吲哚箐绿的人血清白蛋白纳米颗粒。

制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜观察形貌(图1-7)。

实施例8：

1)载药人血清白蛋白纳米颗粒的制备：取20mg/ml人血清白蛋白水溶液2ml，超声使其均匀。

2)用移液枪缓慢地加入用二氯甲烷配置的40mg/ml反式茴香脑溶液15μl，以及80mg/ml的吲哚箐绿溶液2μl。

3)搅拌均匀之后迅速加入100μl的戊二醛交联剂水溶液，在最后于700rpm/min，20℃条件下搅拌反应3小时。

4)待反应结束,用220nm水系滤膜过滤。

5)滤液以8,000rpm/min，离心4分钟，去离子水洗5遍，得到包载反式茴香脑以及吲哚箐绿的人血清白蛋白纳米颗粒。

制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜观察形貌(图1-8)。

从上述实例中，我们已经成功制备出了成球性好、颗粒均匀的、直径为20～50纳米的吲哚箐绿反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒。

实施例9

1)以ph7.4磷酸盐缓冲液作为释药介质,将以上述方法制备的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒原液分成多份，同时在摇床上37℃恒速摇晃,定时取样，做体外缓释实验。用100k的超滤管，8,000rpm/min，离心4分钟，取离心液。

2)颗粒体外释药采用高效液相色谱法考察反式茴香脑一白蛋白纳米颗粒的体外释药规律，计算释药率。

取100μl的茴香脑颗粒原液，加入50μl的dmso便于充分溶解释放出来的茴香脑,超声探头超声3分钟使颗粒充分破裂释放包载的茴香脑。高效液相色谱法测定颗粒原液中反式茴香脑的吸收峰面积以及缓释离心液中茴香脑的吸收峰面积，每次上样50μl。由药物吸收峰面积比值的关系从而求出药物的释药率，则

原液的吸收峰面积s0，之后每天缓释的离心液吸收峰面积记为s1、s2、s3、s4、s5。

原液的吸收峰面积s0为380.79(每50μl)，s(1...5)吸收峰面积为9.9-43.5(每50μl),计算所得的释药率分别为2.6％、4.2％、4.5％、11.65％、31％，作缓释曲线(图2)。

实施例10

mtt法测试反式茴香脑一白蛋白纳米颗粒的细胞毒性：

1)取处于对数生长期的小鼠单核巨噬细胞，0.125％胰蛋白酶消化后充分吹打成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度为5×104/m1。

2)向96孔板的每孔中加入100μl细胞悬液，在37℃，5％co2培养箱中培养24h。

3)将100μl含有不同浓度(0.03mg/ml、0.01mg/ml、0.003mg/ml、0.001mg/ml、0.0003mg/ml、0.0001mg/ml)的反式茴香脑一白蛋白纳米颗粒溶液加入到新鲜培养基中，并在37℃，5％co2培养箱中通细胞共培养24h。

4)24h后取出培养板，向每个孔中加入10μlmtt溶液，在37℃，5％co2培养箱中继续培养4h后，小心吸取培养孔中的培养基，向每个孔中加入200μl二甲基亚砜(dmso)溶液，在摇床上摇动20min，使dmso溶液充分地溶解formazan晶体。

5)用酶联免疫检测仪在570nm波长处，以空白孔调零，测定各孔的吸光值a，按下式计算细胞存活率。每组设8个平行，计算其平均值。

细胞存活率(％)＝实验细胞组吸光值(a2)/空白细胞组吸光值(a1)*100％

空白组吸光值为0.6368，实验组细胞吸光值为0.4805-0.5993，计算所得细胞存活率分别为75.45％、86.90％、88.69％、93％、93.79％、94％。根据不同浓度细胞组计算的存活率做反式茴香脑一白蛋白纳米颗粒细胞毒性分析柱状图(图3)。

实施例11

在小鼠单核巨噬细胞中做反式茴香脑一白蛋白纳米颗粒内吞实验：

1)将一24孔板或48孔板的小鼠单核巨噬细胞的培养基换位无血清培养基，在37℃，5％二氧化碳培养箱中饥饿处理培养2小时。

2)再将含有吲哚箐绿染料的反式茴香脑一白蛋白纳米颗粒加入小鼠单核巨噬细胞中，培养4小时后吸走培养基。

3)用pbs将细胞洗3遍，然后用4％多聚甲醛固定细胞10min，pbs洗3遍。用0.5μg/ml的dapi染液进行细胞核的染色，10min后pbs洗三遍于荧光显微镜观察并拍摄反式茴香脑一白蛋白纳米颗粒细胞内吞荧光成像照片。图4-1为细胞核dapi染色荧光成像，图4-2为反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒内吞荧光成像，图4-3为两张荧光图片merge之后的成像结果图片。

从细胞内吞的荧光成像结果可以发现反式茴香脑一白蛋白纳米颗粒大量的内吞到小鼠单核巨噬细胞中，成功表征了反式茴香脑一白蛋白纳米颗粒的成像示踪功能。

本发明公开和提出的吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的制备方法，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现颗粒的制备。尽管本发明的方法和制备技术在过去的研究中也有过研究，但有关于同时包裹反式茴香脑和荧光染料的白蛋白颗粒还未有过报道。相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。