5-氨基酮戊酸己酯醇质体和光动力疗法在治疗银屑病中的应用的制作方法

本发明属于经皮动力药物领域，特别涉及5-氨基酮戊酸己酯醇质体光动力疗法在治疗银屑病中的应用。

背景技术

银屑病是慢性免疫性皮肤病，病程迁延。病因尚不明确，主要包括遗传因素、免疫调节、精神和环境等多种因素。目前银屑病治疗方案主要包括系统用药如甲氨喋呤、维a酸类、环孢素等；局部外用药如维生素d衍生物、糖皮质激素和他克莫司等；物理疗法(如窄谱中波紫外线照射治疗和补骨脂素联合长波紫外线疗法)；生物制剂治疗(如肿瘤坏死因子-α抑制剂-英利昔单抗)等。然而系统用药副作用明显，长期外用糖皮质激素药膏可导致感染、表皮萎缩等，长期的紫外光照射可导致皮肤癌，免疫生物学治疗方法不仅价格昂贵且副作用大。而光动力疗法是一种无创、对病变组织高度选择性的治疗方法，采用一定波长的激光与光敏剂作用可以生成大量的单线态氧，损伤组织，造成靶细胞的死亡。

5-氨基酮戊酸己酯(hla)是ala的酯类衍生物，其脂溶性更高，可自由扩散进入细胞，拥有更良好的经皮渗透性，并且在以相对低的浓度下可产生与ala相同的荧光强度。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于提供5-氨基酮戊酸己酯醇质体和光动力疗法在治疗银屑病中的应用。

本发明的另一目的在于提供5-氨基酮戊酸己酯醇质体在制备降低白细胞介素6表达的药物中的应用。

本发明的再一目的在于提供5-氨基酮戊酸己酯醇质体在制备治疗银屑病药物中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种5-氨基酮戊酸己酯醇质体联合光动力治疗银屑病的方法，包括以下步骤：

1)在皮肤避光湿敷5-氨基酮戊酸己酯醇质体，使用光照射于皮肤；

2)数天后进行第二次光照射。

本方法不适用于疾病诊断与治疗。

进一步的，步骤1)醇质体避光湿敷2～4小时。

进一步的，步骤1)醇质体的用量为0.5～2ml。

进一步的，步骤1)所述的光照波长为570～660nm。

进一步的，步骤1)所述的光输出功率为20～50mw/cm²。

进一步的，步骤1)光垂直照射10～30min。

进一步的，步骤2)所述天数为7～9天。

5-氨基酮戊酸己酯醇质体在制备降低白细胞介素6表达的药物中的应用。

5-氨基酮戊酸己酯醇质体在制备治疗银屑病药物中的应用。

进一步的，所述银屑病为与il-6表达水平升高相关的银屑病。

进一步的，所述5-氨基酮戊酸己酯醇质体的制备方法为：

1)将大豆磷脂加入到乙醇中，搅拌制成醇相；

2)将5-氨基酮戊酸己酯盐酸盐加入水中，搅拌制成水相；

3)将醇相注入水相，搅拌得混合相；

4)将混合相冰浴超声，过滤即得醇质体。

进一步的，步骤1)中所述的大豆磷脂为1～5％w/v，乙醇25～35％v/v。

进一步的，步骤3)中所述的搅拌的时间为4～6min，转速为600～800rpm。

进一步的，步骤4)中，所述的超声功率为90～105w，超声4～6s，停2～3s；总超声时间为1～3min。

本发明的有益效果是：

本发明包封率高、渗透皮肤速度快、，不仅在皮肤内产生更充足的ppⅸ，从而减少副作用的发生；并且还具有疼痛轻、所需药量少的优点，更能深入皮肤组织，使白细胞介素6的表达量减少，有利于在临床上得到应用。

附图说明

图1：正常小鼠皮肤(a)和银屑病模型小鼠皮肤(b)的he染色图(200×)，其中黄色箭头指的是表皮层；

图2：正常小鼠皮肤(a)和银屑病模型小鼠皮肤(b)的平均荧光强度柱形图(200×)，*代表的是有显著差异；

图3：正常小鼠皮肤组织和银屑病模型小鼠皮肤组织的平均荧光强度比较柱形图(*表示正常的皮肤相对于银屑病模型的皮肤的平均荧光强度具有显著性差异)；

图4：0.5％hla醇质体(a)、0.5％ala溶液(b)、5％ala溶液(c)和空白醇质体(d)作用于银屑病小鼠模型并进行2次光动力后he染色图(200×)，其中黄色箭头指的是表皮层；

图5：0.5％hla醇质体(a)、0.5％ala溶液(b)、5％ala溶液(c)和空白醇质体(d)作用于银屑病小鼠模型并进行2次光动力后免疫组化图(200×)

图6：0.5％hla醇质体、0.5％ala溶液、5％ala溶液和空白醇质体经皮后平均荧光强度的柱状统计图。(注：#表示0.5％hla醇质体与0.5％ala溶液相比有显著性差异，+表示0.5％hla醇质体与5％ala溶液相比有显著性差异，*表示0.5％hla醇质体与空白醇质体有显著性差异)；

具体实施方式

一种5-氨基酮戊酸己酯醇质体联合光动力治疗银屑病的方法，包括以下步骤：

1)在皮肤避光湿敷5-氨基酮戊酸己酯醇质体，使用光照射于皮肤；

2)数天后进行第二次光照射。

本方法不适用于疾病诊断与治疗。

优选的，步骤1)醇质体避光湿敷2～4小时。

优选的，步骤1)醇质体的用量为0.5～2ml。

优选的，步骤1)所述的光照波长为570～660nm。

优选的，步骤1)所述的光输出功率为20～50mw/cm²。

优选的，步骤1)光垂直照射10～30min。

优选的，步骤2)所述天数为7～9天。

5-氨基酮戊酸己酯醇质体在制备降低白细胞介素6表达的药物中的应用。

5-氨基酮戊酸己酯醇质体在制备治疗银屑病药物中的应用。

优选的，所述银屑病为与il-6表达水平升高相关的银屑病。

优选的，所述5-氨基酮戊酸己酯醇质体的制备方法为：

1)将大豆磷脂加入到乙醇中，搅拌制成醇相；

2)将5-氨基酮戊酸己酯盐酸盐加入水中，搅拌制成水相；

3)将醇相注入水相，搅拌得混合相；

4)将混合相冰浴超声，过滤即得醇质体。

优选的，步骤1)中所述的大豆磷脂为1～5％w/v，乙醇25～35％v/v。

优选的，步骤3)中所述的搅拌的时间为4～6min，转速为600～800rpm。

优选的，步骤4)中，所述的超声功率为90～105w，超声4～6s，停2～3s；总超声时间为1～3min。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

1.制备0.5％hla醇质体和空白醇质体

将处方量(乙醇体积分数31.31％，大豆磷脂质量体积比为3％)的大豆磷脂加入乙醇，置于玻璃瓶中密封后在室温下磁力搅拌形成淡黄色透明液体，制成醇相。将处方量hla和蒸馏水置于玻璃瓶中，密封后磁力搅拌形成透明液体，制成水相。密封条件下缓慢地将醇相注入水相中(200μl.min^-1)，搅拌5min，磁力搅拌器稳定维持700rpm的转速。冰浴条件下超声细胞粉碎仪(97.5w，超5s，停3s)超声处理3min，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得hla醇质体，4℃密封保存。整个实验过程注意密封和避光。同理，制备不含hla的空白醇质体。

2.光动力

建立银屑病模型成功后的第二天，小鼠被随机分成0.5％hla醇质体组、0.5％ala组、5％ala组和空白醇质体组(每组3只小鼠)，在试验区皮肤分别用大小相等的纱布避光湿敷(1ml)0.5％hla醇质体、0.5％ala、5％ala和空白醇质体3小时后，用led治疗仪(武汉雅格光电技术股份有限公司)垂直照射20min(光波长630nm，输出功率30mw/cm²)，光斑覆盖试验区，局部避光48h。7天后，进行第二次同样的方法，操作同上。

实施例2

1.制备0.5％hla醇质体和空白醇质体

将处方量(乙醇体积分数25％，大豆磷脂质量体积比为1％)的大豆磷脂加入乙醇，置于玻璃瓶中密封后在室温下磁力搅拌形成淡黄色透明液体，制成醇相。将处方量hla和蒸馏水置于玻璃瓶中，密封后磁力搅拌形成透明液体，制成水相。密封条件下缓慢地将醇相注入水相中(200μl.min^-1)，搅拌4min，磁力搅拌器稳定维持600rpm的转速。冰浴条件下超声细胞粉碎仪(90w，超4s，停2s)超声处理1min，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得hla醇质体，4℃密封保存。整个实验过程注意密封和避光。同理，制备不含hla的空白醇质体。

2.光动力

建立银屑病模型成功后的第二天，小鼠被随机分成0.5％hla醇质体组、0.5％ala组、5％ala组和空白醇质体组(每组3只小鼠)，在试验区皮肤分别用大小相等的纱布避光湿敷(1ml)0.5％hla醇质体、0.5％ala、5％ala和空白醇质体3小时后，用led治疗仪(武汉雅格光电技术股份有限公司)垂直照射10min(光波长570nm，输出功率20mw/cm²)，光斑覆盖试验区，局部避光48h。7天后，进行第二次同样的方法，操作同上。

实施例3

1.制备0.5％hla醇质体和空白醇质体

将处方量(乙醇体积分数35％，大豆磷脂质量体积比为5％)的大豆磷脂加入乙醇，置于玻璃瓶中密封后在室温下磁力搅拌形成淡黄色透明液体，制成醇相。将处方量hla和蒸馏水置于玻璃瓶中，密封后磁力搅拌形成透明液体，制成水相。密封条件下缓慢地将醇相注入水相中(200μl.min^-1)，搅拌6min，磁力搅拌器稳定维持800rpm的转速。冰浴条件下超声细胞粉碎仪(105w，超6s，停3s)超声处理3min，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得hla醇质体，4℃密封保存。整个实验过程注意密封和避光。同理，制备不含hla的空白醇质体。

2.光动力

建立银屑病模型成功后的第二天，小鼠被随机分成0.5％hla醇质体组、0.5％ala组、5％ala组和空白醇质体组(每组3只小鼠)，在试验区皮肤分别用大小相等的纱布避光湿敷(1ml)0.5％hla醇质体、0.5％ala、5％ala和空白醇质体3小时后，用led治疗仪(武汉雅格光电技术股份有限公司)垂直照射30min(光波长660nm，输出功率50mw/cm²)，光斑覆盖试验区，局部避光48h。7天后，进行第二次同样的方法，操作同上。

制备5％ala溶液0.5％ala溶液

将适量ala溶于生理盐水中，使用超声震荡3min，使其充分溶解，即可得5％ala溶液和0.5％ala溶液，放置4℃备用。

对本发明进一步的效果检测。

1.银屑病小鼠模型

结果：he染色正常小鼠表皮和真皮的交界规则、无炎性细胞浸润，银屑病模型小鼠表皮增厚和角化过度伴角化不全、棘层细胞肥厚向下突出和炎性浸润，可见muro脓肿，结果见图1。图2的免疫组化可看出银屑病小鼠模型(图2的b)的棕黄色染色区域较正常小鼠(图2的a)皮肤大、颜色深，银屑病模型组小鼠的平均荧光强度(38341.28±5995.67au)明显高于正常组小鼠平均荧光强度(16845.97±2496.02au)(t＝-9.883，p＝0.000)，如图3所示。

2.氨基酮戊酸己酯醇质体联合光动力后的效果

方法：在两次光动力疗法后，小鼠颈椎脱臼处死，用手术刀切取试验区皮肤，将试验区皮肤立即置于10％福尔马林固定液中，用于he染色和免疫组化染色。采用image-proplus6.0软件分析图片的平均荧光强度，绘制统计图。

he染色方法：修剪固定液固定的皮肤组织，酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋后行切片机切片，热水中展平，烤箱烘干，二甲苯脱蜡，酒精至水，最后行苏木精、伊红染色，显微镜下观察。

免疫组化方法：取固定液固定的皮肤组织固定包埋，切片并烘干，脱蜡后入水，修复，自然冷却,磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤,封闭液封闭，滴加一抗(il-6抗体)，pbs洗涤，滴加二抗，pbs洗涤，滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，pbs洗涤，二氨基联苯胺法染色，苏木素复染，脱水，封片镜检。

结果：(1)he染色

he染色见图4，hla醇质体组(图4的a组)的表皮厚度(图中使用黄色的小箭头所示，表皮表示为最上层的深紫色部分)显著薄于0.5％ala组、5％ala组和空白醇质组，0.5％ala组和5％ala组之间未见明显差异，空白醇质体组的表皮厚度明显厚于其它组别。

(2)免疫组化

白细胞介素6(interleukin-6，il-6)是一种多功能的细胞因子，在银屑病患者皮损和血清中il-6的含量明显升高，且il-6的表达水平和银屑病炎症反应轻重程度呈正相关。免疫组化结果显示0.5％hla醇质体组联合光动力后棕黄色蛋白(il-6)表达较0.5％ala、5％ala和空白醇质体明显减少，见图5。

表1的结果表明，0.5％hla醇质体组il-6的表达量显著低于0.5％ala溶液组(p＝0.000)、5％ala溶液组(p＝0.000)和空白醇质体组(p＝0.002)，具有显著性差异。图6为不同光敏剂联合光动力后皮肤切片的平均荧光强度统计图。

表1不同形态醇质体联合光动力后皮肤切片的平均荧光强度(au，均数±标准差，n＝3)

结合图3和图6，发现免疫组化荧光强度在本发明的前后，有显著性差异。使用本发明前平均荧光强度为38341.28±5995.67au，0.5％hla醇质体联合光动力后平均荧光强度为13543.24±1904.50。表明hla醇质体联合光动力可以有效减少白细胞介素6的表达，有利于在临床上得到应用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。