一种近红外光热响应的功能化氧化石墨烯/透明质酸复合水凝胶的制备方法与流程

本发明属于智能纳米复合水凝胶制备领域，特别涉及一种近红外光热响应的功能化氧化石墨烯/透明质酸复合水凝胶的制备方法。

背景技术

智能型水凝胶是一类能够对外界刺激(温度、ph值、盐浓度、溶剂、化学物质、光、电场等)产生一系列敏感响应的水凝胶材料。由于光的强度和波长很容易控制，特别是波长在800nm左右的近红外光能很好的穿透人体生物组织且对人体无害。将具有近红外光热效应的纳米材料与温度敏感的水凝胶复合而制备的光热响应的复合水凝胶，经近红外光辐照后水凝胶中的光热纳米材料将吸收的近红外光能转化为热，导致温敏水凝胶基体发生温敏相变，从而产生体积和亲疏水性变化。因此，近红外光热响应的复合水凝胶在生物医药领域极具应用前景。

石墨烯及其衍生物氧化石墨烯(go)具有大的比表面积和平面结构，能够通过非共价键作用键合药物分子，提高药物的载药量，对一些芳香类的小分子药物具有超强的吸附能力，非常适合作为药物输运的载体。而石墨烯类纳米材料具有优异的光热性质，尤其对近红外光具有很强的吸收能力，与同样具有光热性质的金纳米棒和碳纳米管比较，石墨烯含量丰富，价格低廉，在未来大规模应用中更具优势。

透明质酸是葡萄糖醛酸和n-乙酰氨基葡萄糖两种结构单元交替连接而成的一种直链线型阴离子粘多糖，具有良好的生物降解性、生物相容性、非毒性和非抗原性，广泛应用于生物医用领域。近年来氧化石墨烯/透明质酸复合材料引起了人们极大的研究兴趣。如利用pei(发明专利cn104248764a)、亚烷基二胺(cn201210561306.5)、己二酸酰肼(cn102727901a)、壳聚糖(cn106236712a和cn104922675a)和多臂peg(cn107625964a)等作为连接臂，通过化学键偶联的方法可将透明质酸接枝至氧化石墨烯表面形成氧化石墨烯/透明质酸纳米复合物，利用透明质酸优异的生物相容性和cd44靶向性可有效地降低氧化石墨烯的细胞毒性，用作纳米靶向药物控释载体。但这些工作仅限于对氧化石墨烯的功能化改性，并未涉及氧化石墨烯/透明质酸复合水凝胶的研究。如cn103980505a公开了透明质酸/氧化石墨烯纳米复合水凝胶的制备方法，将接枝酪胺的透明质酸直接溶解于氧化石墨烯pbs溶液中，通过辣根过氧化物酶和过氧化氢酶促交联制备复合水凝胶。该复合水凝胶表现出单一的ph响应性，可应用于罗丹明b的控制释放。

虽然氧化石墨烯/透明质酸复合水凝胶已有相关研究报道，但其中仍有诸如下述问题在内的问题急需解决：(1)要制备结构和性能可控的氧化石墨烯/透明质酸复合水凝胶，首先要解决氧化石墨烯在水凝胶基体中均匀分散的问题。透明质酸是一种水溶性的阴离子多糖，氧化石墨烯在ph4～11范围内表面带负电荷，表现出较强的疏水性。直接将未功能化的氧化石墨烯分散于透明质酸溶液中，氧化石墨烯和透明质酸间由于静电排斥无法有效地形成相互作用，氧化石墨烯不可避免地在透明质酸溶液中发生疏水聚集，无法实现对凝胶结构和性能的控制，从而导致材料性能的可重复性差；(2)透明质酸本身无温度响应性，复合水凝胶不能有效地对氧化石墨烯的光热效应表现出敏感的响应性；(3)复合水凝胶在透明质酸降解后，水凝胶中残存的未功能化的氧化石墨烯将直接暴露于生理条件下发生聚集，存在致癌和致畸变的潜在危害，作为药物输送载体存在明显的弱点。因此，有必要引入一种温度响应的聚合物，有效地功能化氧化石墨烯，在保证氧化石墨烯生理条件下稳定分散的同时，赋予复合水凝胶敏感的温度和近红外光热响应性。

技术实现要素：

针对现有的氧化石墨烯/透明质酸复合水凝胶药物控释载体制备中存在的技术问题，本发明提出一种近红外光热响应的功能化氧化石墨烯/透明质酸复合水凝胶，使得go在复合水凝胶中分散稳定的同时，能够快速简便地凝胶，并具有良好的生物相容性和光热响应性，适合作为抗癌药物控释载体。

本发明以酪胺封端的温敏性pluronic三嵌段共聚物(plu-tyr)功能化氧化石墨烯(go)，获得可在生理条件下稳定分散的plu-tyr/go胶体粒子，以此为交联剂和光热元件分散于酪胺接枝的透明质酸(ha-tyr)溶液中，在辣根过氧化酶(hrp)催化下制备出交联速度和交联结构可控的光热响应的功能化氧化石墨烯/透明质酸复合水凝胶；制得的功能化氧化石墨烯/透明质酸复合水凝胶可以利用其中含有的go装载抗癌药物，结合go的近红外光热效应和pluronic的温度响应性实现复合水凝胶对装载的药物分子光热响应性控制释放。

本发明所提供的技术方案如下：

一种近红外光热响应的功能化氧化石墨烯/透明质酸复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)酪胺封端的pluronic的制备：将对硝基苯基氯甲酸酯(npc)溶于10％～20％(w/v)的pluronic的二氯甲烷溶液中，冰浴条件下搅拌反应24h，反应液用正己烷沉淀，过滤，沉淀物真空干燥得到产物plu-npc，将plu-npc溶于二甲基甲酰胺中，浓度为10％～20％(w/v)，之后加入酪胺盐酸盐(tyr)，室温下搅拌反应24h，得到的透明反应液先用氯化钠溶液透析3天后，再用蒸馏水透析2天，透析液冷冻干燥，得到浅黄绿色的酪胺封端的pluronic(plu-tyr)；

(2)plu-tyr功能化的氧化石墨烯胶粒的制备：用hummers法制备得到氧化石墨烯，将不同质量的氧化石墨烯分散于步骤(1)中得到的plu-tyr溶液中超声分散2h，制得不同质量浓度的plu-tyr的功能化的氧化石墨烯胶粒(plu-tyr/go)分散液。

(3)功能化氧化石墨烯/透明质酸复合水凝胶的制备：将接枝酪胺基团的透明质酸(ha-tyr)溶于步骤(2)制备的plu-tyr/go胶粒分散液中，依次加入辣根过氧化物酶(hrp酶)和过氧化氢溶液，迅速混合均匀，酶催化交联生成无色透明水凝胶，即制备得到功能化氧化石墨烯/透明质酸复合水凝胶。

进一步的，所述复合水凝胶的制备方法中，步骤(1)中所述的pluronic聚合物选自pluronicf68或pluronicf127中的一种，市售可得。

进一步的，所述复合水凝胶的制备方法中，步骤(2)中所述的plu-tyr/go胶粒分散液中plu-tyr的质量浓度为0.01～6.0wt％，氧化石墨烯的质量浓度为0.01～1.0wt％。

进一步的，所述复合水凝胶的制备方法中，步骤(3)中所述的接枝酪胺基团的透明质酸的分子量为36kda～100kda，酪胺基团取代度为5～14。

进一步的，所述复合水凝胶的制备方法中，步骤(3)中所述的接枝酪胺基团的透明质酸的浓度为1.0～4.0wt％，辣根过氧化物酶的浓度为0.01～20units/ml，过氧化氢的浓度为1～2.5mm，且水凝胶酶催化交联为ha-tyr大分子链与plu-tyr/go胶粒中酪胺基团在辣根过氧化酶和过氧化氢的催化作用下，形成交联网络结构。

本发明还提供了制备得到的功能化氧化石墨烯/透明质酸复合水凝胶的近红外光热响应的方法，包括如下步骤：

将制得的功能化氧化石墨烯/透明质酸复合水凝胶在波长808nm的近红外光照射下，功能化氧化石墨烯吸收近红外光将光能转化为热能，且水凝胶在波长808nm的近红外光照射1～30min，复合水凝胶温度升高1～20℃。

本发明还提供了上述制备得到的功能化氧化石墨烯/透明质酸复合水凝胶和抗癌药物制备成装载抗癌药物的复合水凝胶的方法，包括如下步骤：

将抗癌药物溶解于步骤(2)制备的plu-tyr/go胶粒分散液中，其余按照功能化氧化石墨烯/透明质酸复合水凝胶的制备步骤，即可制备装载抗癌药物的复合水凝胶。

进一步的，制备成装载抗癌药物的复合水凝胶的方法中，所述抗癌药物选自盐酸拓扑替康或盐酸阿霉素中的一种。

本发明制得的功能化氧化石墨烯/透明质酸复合水凝胶和抗癌药物制备成装载抗癌药物的复合水凝胶可以应用于近红外光触发的抗癌药物控制释放，且其在波长808nm的近红外光照射下可提高复合水凝胶中装载的抗癌药物的释放速率和释放量。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

(1)本发明采用酪胺封端的温敏性pluronic三嵌段共聚物功能化氧化石墨烯制备了可在生理条件下稳定存在的plu-tyr/go胶粒，有效地解决了go在复合水凝胶中的分散稳定性和复合水凝胶降解后残留go的毒性问题；

(2)利用pluronic的优异的生物相容性和温度响应性，plu-tyr/go胶粒在复合水凝胶中作为药物载体、光热元件和交联增强剂，赋予了复合水凝胶高载药量、良好的生物相容性和光热响应性；

(3)本发明采用hrp酶催化交联制备复合水凝胶，凝胶反应条件温和，可在生理条件快速凝胶化，凝胶化时间3s～180s，凝胶化速度和凝胶结构与性能可控，且凝胶化过程不需要使用化学交联剂和有机溶剂，降低了原位聚合带来的毒性和致癌等潜在危害；

(4)本发明制备出的光热响应性复合水凝胶可实现近红外光热响应的抗癌药物控制释放。

附图说明

图1为图1为光热响应的复合水凝胶结构示意图。

图2为plu-tyr浓度对凝胶化时间的影响。

图3为ha-tyr浓度对凝胶化时间的影响。

图4为go浓度对凝胶化时间的影响。

图5为hrp浓度对复合水凝胶凝胶时间影响。

图6为h2o2浓度对凝胶化时间的影响。

图7为纳米复合水凝胶扫描电镜图。

图8为近红外光照射下复合水凝胶的温度变化。

图9为复合水凝胶对装载药物tpt光热响应的释放。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明作进一步地说明。

实施例1功能化氧化石墨烯/透明质酸复合水凝胶制备

(1)酪胺改性的pluronic的制备：称取15g完全干燥的pluronicf127，搅拌下溶于75ml二氯甲烷中，加入1.4g对硝基苯基氯甲酸酯(npc)，在氮气氛围下冰水浴搅拌反应24h，将反应后的液体用正己烷沉淀，过滤，沉淀物真空干燥得到第一步产物(plu-npc)，取10g完全干燥后的plu-npc，搅拌下溶解于50ml二甲基甲酰胺中，加入0.62g酪胺盐酸盐(tyr)，室温下搅拌反应24h，得到透明反应液体在透析袋(mwco3500)中，用氯化钠溶液透析3天，蒸馏水透析2天，透析液冷冻干燥得浅黄绿色产物plu-tyr；

(2)plu-tyr功能化的氧化石墨烯胶粒的制备：称取(1)中制备的plu-tyr50mg溶于10ml的pbs(ph＝7.4)溶液中，加入用hummers法制备得到的氧化石墨烯10mg，超声分散2h，得到稳定分散的plu-tyr/go胶粒分散液，其中plu-tyr浓度为0.5wt％，go浓度为0.1wt％。改变plu-tyr和go质量可制得不同plu-tyr和go浓度的plu-tyr/go胶粒分散液；

(3)接枝酪胺基团的透明质酸衍生物(ha-tyr)的制备：称取透明质酸(ha)2g加入100ml二次蒸馏水中，搅拌直至完全溶解，加入2.3gn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和3.832g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc.hcl)，溶解后将溶液ph值调至5.4左右，在25℃下活化1h，称取2.62g酪胺盐酸盐(tyr)加入已活化溶液中，将反应液ph调至6.8左右，室温搅拌反应48h。所得反应液在透析袋(mwco3500)中，用氯化钠溶液透析3天，蒸馏水透析2天，所得透析液冷冻干燥得白色絮状产物ha-tyr，核磁测试酪胺取代度为7；

(4)功能化氧化石墨烯/透明质酸复合水凝胶的制备：称取20mg(3)中合成的ha-tyr溶于980ul(2)中配制的plu-tyr/go胶粒分散液中获得ha-tyr浓度为2.0wt％的ha-tyr/plu-tyr/go混合溶液，再依次加入10ul浓度为0.25unit/ml的辣根过氧化物酶pbs溶液和10ul浓度为1mm的过氧化氢pbs溶液，用涡旋混合器迅速混合均匀，在50s内生成无色透明水凝胶。

制得的功能化氧化石墨烯/透明质酸复合水凝胶构型如图1所示。

实施例2plu-tyr浓度对复合水凝胶的凝胶时间影响

除实施例1的步骤(2)中分别配制plu-tyr质量浓度为0.01、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0wt％的plu-tyr/go胶粒分散液(go浓度为0.1wt％)，以及步骤(4)中用涡旋混合器迅速混合均匀之后通过试管翻转法测定不同plu-tyr浓度的溶液的凝胶时间之外，其余与实施例1相同。考察plu-tyr浓度对复合水凝胶的凝胶时间影响，结果如图2所示。

从图2可得，复合水凝胶的凝胶时间在随plu-tyr浓度增加而增加，凝胶化时间从50s一直增加至180s。

实施例3ha-tyr浓度对复合水凝胶的凝胶时间影响

除实施例1中的步骤4中分别配制取ha-tyr质量浓度为1.0、3.0和4.0wt％的ha-tyr/plu-tyr/go混合溶液，以及步骤(4)中用涡旋混合器迅速混合均匀之后通过试管翻转法测定不同plu-tyr浓度的溶液的凝胶时间之外，其余与实施例1相同。考察ha-tyr浓度对复合水凝胶的凝胶时间影响。结果如图3所示。

从图3可得，复合水凝胶的凝胶时间随ha-tyr浓度增加而降低，凝胶化时间从79s降低至25s。

实施例4go浓度对复合水凝胶的凝胶时间影响

除实施例1中的步骤2中分别配制取go质量浓度为0.01、0.025、0.05、0.1、0.15和0.2wt％的plu-tyr/go胶粒分散液(plu-tyr浓度为0.5wt％)，以及步骤(4)中用涡旋混合器迅速混合均匀之后通过试管翻转法测定不同plu-tyr浓度的溶液的凝胶时间之外，其余与实施例1相同。go浓度对复合水凝胶的凝胶时间影响，结果见图4。

从图4可得，go浓度对复合水凝胶的凝胶化时间影响不大，几乎为68s左右。

实施例5hrp浓度对复合水凝胶的凝胶时间影响

除实施例1中的步骤(4)中分别配制6个相同的ha-tyr/plu-tyr/go混合溶液(ha-tyr浓度为2.0wt％，plu-tyr浓度为0.5wt％，go浓度为0.1wt％)，分别向混合溶液中加入10ul浓度为0.01、0.25、1、5、10和20unit/ml的辣根过氧化物酶pbs溶液混合均匀，再向每个混合溶液中加入10ul浓度为1mm的过氧化氢pbs溶液，其余与实施例1相同。考察hrp浓度对复合水凝胶的凝胶时间影响，结果如图5所示。

从图5可得，随着hrp浓度增大，复合水凝胶的凝胶化时间降低，从85s降低至3s。

实施例6h2o2浓度对复合水凝胶的凝胶时间影响

除实施例1中的步骤(4)中分别配制6个相同的ha-tyr/plu-tyr/go混合溶液(ha-tyr浓度为2.0wt％，plu-tyr浓度为0.5wt％，go浓度为0.1wt％)，分别向混合溶液中加入10ul浓度为浓度为0.25unit/ml的辣根过氧化物酶pbs溶液混合均匀，再向每个混合溶液中加入10ul浓度分别为1、1.5、2和2.5mm的过氧化氢pbs溶液，其余与实施例1相同。考察h2o2浓度对复合水凝胶的凝胶时间影响，结果见图6所示。

从图6可得，随h2o2浓度浓度增大，复合水凝胶的凝胶化时间增加，从45s增加至95s。

实施例7ha-go-plu-tyr纳米复合水凝胶形貌表征

将实施例1中制备的复合水凝胶用液氮淬冷后冷冻干燥，选取断面结构用扫描电镜进行形貌分析，如图7所示。

实施例8复合水凝胶近红外光热响应性

取实施例1中制备的复合水凝胶，在功率为1.0w的808nm近红外光照射下，用flir红外热成像仪测复合水凝胶在不同照射时间下的温度，结果如图8所示。

从图8可得，复合水凝胶在近红外光照射1～30min后，复合水凝胶的温度升高1～20℃，说明复合水凝胶在近红外光照射后可以将光能转换为热量，表现出敏感的近红外光热响应性。

实施例9水凝胶对抗癌药物拓扑替康的装载

按实施例1配置plu-tyr/go胶粒分散液，并将10mg盐酸拓扑替康(tpt)溶于步骤(2)中的plu-tyr/go胶粒分散液(其中tpt浓度为1mg/ml)，其余与实施例1相同，制备得到装载抗癌药物拓扑替康的复合水凝胶。

实施例10复合水凝胶近红外光热响应的药物释放

取实施例9制备的装载抗癌药物拓扑替康的复合水凝胶两份，将其分别放入30mlph为7.4的pbs缓冲液中，一份用功率为1.0w的808nm近红外光照射，另一份不照射，在37℃水浴振荡器中进行药物释放，测定药物释放曲线，结果如图9所示。

从图9可得，在808nm近红外光照射下复合水凝胶对拓扑替康的的释放速度明显加快，累计释放量从不照射时的56％提高至78.6％，说明复合水凝胶具有很好的近红外光热药物控释性能。