本发明涉及药物化学
技术领域：
，具体涉及虫草菌发酵物在制备抗运动性疲劳药品或食品中的应用。
背景技术：
1982年的第5届国际运动生物化学会议上，大会对疲劳的概念作了统一，认为疲劳是“机体生理过程不能持续其功能在一特定水平，各器官不能维持预定的运动强度”。运动性疲劳主要是指由运动引起身体能力下降的现象。运动性疲劳产生的原因和机制十分复杂，是机体生命活动多种因素综合变化的结果。虫草是我国名贵的真菌药物和高级补品，在我国明代以前，人们已知道应用虫草，从明代中叶开始，虫草就受到东南亚人民的喜爱，在国际市场上享有很高的声誉。广义上的虫草是指虫生子囊真菌侵染昆虫或节肢动物后形成的真菌子实体(子座)与昆虫或节肢动物的复合体。虫草属真菌约有400余种，其中最名贵的是冬虫夏草(cordycepssinensis)，其是麦角菌科线形虫草属真菌(ophiocordyceps)寄生于蝙蝠蛾属(hepialusspp.)的幼虫体内形成的复合体，是青藏高原高海拔地区的特有物种，简称“虫草”，是中国传统的名贵中药。世界上已发现同属“虫草属”的虫草已有三百五十种之多，其中在中国已发现过六十余种，包含冬虫夏草(c.sinensis)、北冬虫夏草(c.militaris)、大团虫草(c.ophioglossoides)、亚香棒虫草(c.hawkesii)、古尼虫草(c.gunnii)、珊瑚虫草(c.martialis)、镰刀状虫草(c.falcata)、泰山虫草(c.taishanensis)、山西虫草(c.shanxiensis)、凉山虫草(c.liangshanensis)、新疆虫草(c.gracilis)、香棒虫草(c.barnesii)、蝉花(c.sobolifera)等。目前，虫草属中最为热门的是冬虫夏草(c.sinensis)，其药理学研究主要集中在免疫系统、肾脏和心血管系统的研究，以及抗肿瘤作用的研究。例如：王德慧等提出冬虫夏草具有增强细胞细胞免疫功能、体液免疫功能和单核-巨噬细胞吞噬功能的作用，具有双向调节作用，增加免疫器官重量(王德慧、颜燕.冬虫夏草营养液对免疫调节功能的研究.中国公共卫生，2001,17(5)：417)。杜极德等指出冬虫夏草多糖与虫草水剂抗癌作用相似，对瘤株均有显著的抑制和杀伤作用(杜极德、曾庆田、冉长清等.冬虫夏草抗肿瘤作用的研究，中药通报，1986,11(7)：51-4)。此外，关于冬虫夏草在运动性疲劳中的作用也有相应的研究报道。有学者研究提出：运动造成骨骼肌组织脂质过氧化反应加强而产生较多的自由基，其可导致肌纤维膜及线粒体膜等生物膜完整性丧失及损伤，从而引发细胞代谢功能紊乱，细胞广泛性损伤及病理变化，使肌肉工作能力下降产生疲劳。孔祥环观察了冬虫夏草对大鼠体外肝均浆过氧化脂质和小鼠体内过氧化脂质及红细胞超氧化物歧化酶的影响，结果显示冬虫夏草营养液能够明显抑制肝lpo生成，提高超氧化物歧化酶活力(孔祥环.冬虫夏草营养液抗衰老作用的实验研究.首都医科大学学报，1997,11(1)：15-17)。刘凤芝研究表明：冬虫夏草醇提取液能够减轻脂质过氧化物损伤并稳定细胞质膜，改善细胞能量代谢和atp酶活性(刘凤芝，李延平，赵雅君.冬虫夏草注射液等对大鼠缺血-再灌注心肌保护作用研究.中国药理学报，1997,11(5)：46.)。上述研究主要集中于冬虫夏草，而其他虫草属的研究则较少，虫草真菌发酵物类产品在改善或治疗运动性疲劳的研究更是鲜有报道。另外，目前虫草在抗运动性疲劳机理上的研究主要集中于能源物质耗竭学说和自由基学说，至于虫草是否能够从其他方面改善和治疗运动性疲劳也未见报道。技术实现要素：本发明提供了虫草菌发酵物在制备抗运动性疲劳药品或食品中的应用，首次提出虫草菌发酵物能够用于抗运动性疲劳，尤其是在提高运动耐力和骨骼肌力量方面的应用。具体内容如下：本发明提供了虫草菌发酵物在制备抗运动性疲劳药品或食品中的应用，所述虫草菌发酵物由虫草属真菌经液体和/或固体发酵后得到。本发明所指虫草属真菌是指从虫草中分离得到的寄生真菌。所述虫草菌发酵物由具体的某一类虫草属真菌菌种进行发酵获得，而非多种虫草属真菌菌种的混合发酵物。由于液体发酵产物中的菌丝体含量较少，故更优选，所述虫草菌发酵物先经液体发酵，再经固体发酵，效果更佳。本发明提供了虫草菌发酵物在制备提高运动耐力的药品或食品中的应用，所述虫草菌发酵物由虫草属真菌经液体和/或固体发酵后得到。本发明通过小鼠游泳耐力实验、跑步耐力实验，证明：与对照组相比，虫草菌固体培养物给药组小鼠的游泳力竭时间和跑步力竭时间显著延长；说明虫草菌发酵物能够提高小鼠的运动耐力，提高小鼠抗运动性疲劳的能力。本发明提供了虫草菌发酵物在制备提高骨骼肌力量的药品或食品中的应用，所述虫草菌发酵物由虫草属真菌经液体和/或固体发酵后得到。本发明通过检测虫草菌固体培养物给药组小鼠中的腓肠肌总蛋白、肌酸激酶和肌糖原含量，证明长期服用虫草菌固体培养物可有效提高腓肠肌总蛋白、肌酸激酶和肌糖原的含量，进而提高骨骼肌力量，提高小鼠抗运动性疲劳的能力。进一步地，所述虫草属真菌为冬虫夏草(c.sinensis)菌种、北冬虫夏草(c.militaris)菌种、大团虫草(c.ophioglossoides)菌种、亚香棒虫草(c.hawkesii)菌种、古尼虫草(c.gunnii)菌种、珊瑚虫草(c.martialis)菌种、镰刀状虫草(c.falcata)菌种、泰山虫草(c.taishanensis)菌种、山西虫草(c.shanxiensis)菌种、凉山虫草(c.liangshanensis)菌种、新疆虫草(c.gracilis)菌种、香棒虫草(c.barnesii)菌种、蝉花(c.sobolifera)菌种中的至少一种。更进一步地，所述虫草属真菌为地顶孢霉(acremoniumterricola)、中国被毛孢(synnematiumsinensesp.)、蛹草拟青霉(paecilomycesmilitaris)、霍克斯拟青霉(paecilomyceshawkesii)、羽束梗孢霉(paraisariasp.)、大团囊菌(elaphomycesgranulatus)、蝉白僵菌(beauveriasobolifera)中的至少一种。本发明以地顶孢霉(acremoniumterricola)的发酵产物作为研究对象，证明了虫草菌固体培养物能够制备抗运动性疲劳药品或食品，并通过提高运动耐力和增强骨骼肌力量的实验来证明。所以，进一步地，所述虫草属真菌为地顶孢霉(acremoniumterricola)。更进一步地，所述虫草属真菌为地顶孢霉(acremoniumterricola)mkl18，保藏编号为cctccno.m2013654。地顶孢霉(acremoniumterricola)mkl18已于2013年12月12日保藏于武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心，本申请不涉及遗传资源的保藏。所述液体发酵包括：(1)活化虫草属真菌；(2)取所述虫草属真菌接种于种子培养基中，进行种子培养；再转接至扩大培养基中，进行扩大培养，得到液体发酵菌液。本发明采用的液体发酵培养基和固体培养基均为常规培养基，无特殊中药材等成分，获得的发酵物中仅含有虫草属真菌及其发酵代谢产物，以及极为少量的真菌生长未利用完的固体培养基组分，本发明发现利用虫草属真菌自身发酵产生的发酵产物能够提高小鼠的运动耐力和增强骨骼肌力量。上述液体发酵培养基包括氮源、碳源和微量元素；其中，作为优选，氮源为蚕蛹粉、蛋白胨、酵母粉和黄豆粉中的至少一种，碳源为白砂糖、黄豆粉、玉米粉、麦芽粉和大米粉中的至少一种，微量元素为mgso4、kh2po4、nah2po4和vb中的至少一种。更优选，所述液体培养基的组分为白砂糖、蚕蛹粉、黄豆粉、蛋白胨、酵母粉、mgso4和kh2po4。上述固体发酵培养基也包括氮源、碳源和微量元素；其中，作为优选，氮源为豆粕、棉籽粉和小麦次粉中的至少一种，碳源为玉米粉和麦麸中的至少一种，微量元素为硫酸镁mgso4、kh2po4、nah2po4和vb中的至少一种。更优选，所述固体发酵培养基的组分为玉米粉、棉籽粉、小麦次粉、豆粕、麦麸、硫酸镁、硫酸锌、磷酸二氢钾和磷酸二氢钠。进一步地，上述制备的所述药物包括有效成分和药用辅料，所述有效成分为所述的虫草菌发酵物。其中，所述的药用辅料是指药学领域常规的药物载体，如填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂等。所述填充剂可采用淀粉、蔗糖或微晶纤维素；所述粘合剂可采用淀粉浆、羟丙纤维素、明胶或聚乙二醇；所述湿润剂可采用硬脂酸镁、微粉硅胶或聚乙二醇类；所述吸收促进剂可采用聚山梨脂或卵磷脂；所述表面活性剂可采用伯洛沙姆、脂肪酸山梨坦或聚山梨脂。另外，还可以加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。所述药物的剂型可以是片剂，丸剂，粉剂，分散片，小药囊剂，酏剂，混悬剂，乳剂，溶液剂，糖浆剂，气雾剂，软胶囊，硬胶囊等；可制成常规、速释、缓释或延迟释放制剂。上述虫草菌发酵物可以添加在如饮料、糖果、糕点、果酱、速食食品等中，也可以制成片剂，丸剂，粉剂，分散剂，气雾剂，溶液剂，软胶囊，硬胶囊。上文所述的食品均指常规食用食品以及保健食品。本发明所述的虫草菌发酵物作为药品或食品服用时，用量范围在0.05g～100g。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供了虫草菌发酵物在制备抗运动性疲劳药品或食品中的新用途，尤其是在提高运动耐力和骨骼肌力量方面的应用；通过小鼠试验证明虫草菌发酵物能够有效延长小鼠的游泳力竭时间和跑步力竭时间，并通过提高腓肠肌总蛋白、肌酸激酶和肌糖原的含量来提高小鼠的骨骼肌力量。具体实施方式下面结合具体实施案例对本发明作进一步地详细说明。下列实施例中未说明的方法或指标检测方法均为本领域公知的现有技术手段。实施例1虫草菌发酵物的制备1、发酵菌液(1)古尼虫草菌种：地顶孢霉(acremoniumterricola)mkl18(可购自合肥迈可罗生物工程有限公司)；(2)种子培养：种子培养的培养基为：600g白砂糖，300g蚕蛹粉，200g黄豆粉，150g蛋白胨，100g酵母粉，10gmgso4，10gkh2po4，溶解于20l水，自然ph；121℃高压蒸汽灭菌30min。种子发酵的条件为：温度为25℃，通气量为1.00l/(l·min)，接种量为10％(质量分数)，300l气升式发酵罐装液量67％，发酵时间为24h。(3)扩大培养：扩大培养的培养基为：6000g白砂糖，3000g蚕蛹粉，2000g黄豆粉，1500g蛋白胨，1000g酵母粉，100gmgso4，100gkh2po4，溶解于200l水，自然ph；121℃高压蒸汽灭菌30min。扩大培养的条件为：温度为25℃，通气量为1.00l/(l·min)，接种量为10％(质量分数)，300l气升式发酵罐装液量67％，发酵时间为24h。种子培养和扩大培养完成后，得到地顶孢霉菌液。2、固体培养物(1)将本实施例中制得的地顶孢霉菌液与固体培养基搅拌接种后(接种量为15％，质量分数)，平铺在浅盘上发酵，物料厚度为3cm，温度恒定为25℃，湿度为70％，发酵时间为168h，得到固体培养物；其中，固体发酵的培养基为：玉米粉45％、棉籽粉5％、小麦次粉4％、豆粕30％、麦麸15.8％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.05％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸二氢钠0.05％；自然ph，100℃蒸汽灭菌6h。(2)收集固体培养物，在60℃下热风干燥至水分降至8wt％以下，粉碎装袋，密封，避光储藏，即虫草菌固体培养物。测定本实施例制备获得的发酵菌液和固体培养物中的组分，结果如表1所示。实施例2一、实验方法1、实验材料：icr小鼠；实施例1制备的虫草菌固体培养物。2、药物配制：200mg/ml的虫草菌固体培养物水溶液：取适量的虫草菌固体培养物在超净工作台里用研钵充分研磨至细腻均匀，先向研钵里加入少量无菌双蒸水研磨，让溶液呈粘稠状态，再加入一定体积的水研磨，溶液呈悬浮状态，于4℃存储备用，给小鼠灌胃时，需充分摇匀。3、小鼠分组(1)分组：24只重20～24g小鼠随机分成三组，每组平均体重24.8；以无菌双蒸水作为药剂的组为对照组；设置两组给药组分别为高剂量给药组、低剂量给药组。(2)具体实验方案如表2所示。表2具体实验方案注：低剂量给药组和高剂量给药组中的药剂均为实施例1制备的虫草菌固体培养物的水溶液。上述三组实验组均进行游泳力竭实验或者跑步力竭实验。其中，对于游泳力竭实验：给药第0～6天内小鼠无负荷游泳；b.给药第7～13天内小鼠负荷1.5％体重的物体游泳；c.给药第14～20天内小鼠负荷3％体重的物体游泳。跑步力竭实验中无负重。(3)检测指标a.游泳力竭时间：给药第0、7、14、20天测试小鼠游泳力竭时间。b.跑步力竭时间：给药第12天和18天，用小鼠转轮式疲劳仪检测小鼠跑步力竭时间。c.肌肉力量：给药第17天，用大小鼠抓力测定仪检测小鼠前肢抓力。d.腓肠肌重量：实验结束时，称量腓肠肌重量。4、统计学分析：实验所得数据采用均数±标准误差(mean±se)表示，采用graphpad_prism_7.0.0.159和student'st-test进行统计分析，以p＜0.05表示差异有统计学意义。二、实验结果实验结果如表3所示。结果显示：(1)与对照组相比，给药14天，高剂量给药组小鼠的游泳力竭时间延长60.4％；给药20天，低剂量给药组小鼠和高剂量给药组小鼠的游泳力竭时间延长179.8％和238.3％。(2)与对照组相比，给药12天和18天，高剂量给药组小鼠的跑步力竭时间延长89.1％和62.8％。(3)虽然低剂量给药组小鼠和高剂量给药组小鼠的腓肠肌重量均高于对照组，但差异不显著，无统计学意义。(4)与对照组相比，给药17天，低剂量给药组小鼠和高剂量给药组小鼠的前肢抓力显著提高43.2％和45.8％。表3小鼠给药期间测定的各指标的检测结果注：a.给药第0天，测试小鼠无负荷游泳力竭时间；b.给药第7天，测试小鼠负荷1.5％体重的物体游泳力竭时间；c.给药第14/20天，测试小鼠负荷3％体重的物体游泳力竭时间。表中所有数据都是各组的mean±se值，数据分析采用studentt-test，*和**、***表示与对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；百分率(％)＝(给药组-对照组)/对照组×100％。实施例3一、实验方法1、实验材料：icr小鼠；实施例1制备的虫草菌固体培养物。2、药物配制：虫草菌固体培养物水溶液：取适量的虫草菌固体培养物在超净工作台里用研钵充分研磨至细腻均匀，先向研钵里加入少量无菌双蒸水研磨，让溶液呈粘稠状态，再加入一定体积的水研磨，溶液呈悬浮状态，于4℃存储备用，给小鼠灌胃时，需充分摇匀。3、小鼠分组(1)分组：24只重20～24g小鼠随机分成三组，每组平均体重24.8；以无菌双蒸水作为药剂的组为对照组；设置两组给药组分别为高剂量给药组、低剂量给药组。(2)具体实验方案如表4所示。表4具体实验方案注：低剂量给药组和高剂量给药组中的药剂均为实施例1制备的虫草菌固体培养物的水溶液。给药实验结束时，取小鼠腓肠肌立即置于液氮预冷的异戊烷中快速冰冻10～15s，然后放至于-80℃冰箱冷藏。称取少量腓肠肌组织，加入4℃生理盐水，按照1:9(w/v)的比例加入；然后，在冰浴中，进行电动匀浆和超声粉碎(4次，10s/次，间隔10s/次)，制备成10％的组织匀浆，4℃离心(3000rpm)10min，再取上清液再用生理盐水按1:9稀释成1％组织匀浆待测。采用市售的试剂盒对肌糖原、肌肉肌酸激酶(ck)和肌肉蛋白含量进行测定，具体测定方法按照试剂盒说明书进行操作。统计学分析：实验所得数据采用均数±标准误差(mean±se)表示，采用graphpad_prism_7.0.0.159和student'st-test进行统计分析，以p＜0.05表示差异有统计学意义。结果如表5所示。表5不同实验组中小鼠腓肠肌的总蛋白、肌肉肌酸激酶和肌糖原含量结果分组总蛋白含量(g/l)肌糖原(mg/g)肌酸激酶(u/mgprot)对照组(双蒸水)0.53±0.130.70±0.031.01±0.14低剂量给药组(1g/kg)0.79±0.12*0.86±0.05*1.89±0.11*高剂量给药组(2g/kg)0.89±0.10**0.95±0.03**#1.96±0.12**注：*和**表示与对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；#表示与低剂量给药组比较，#p＜0.05。与对照组相比，给药组小鼠骨骼肌组织的总蛋白含量、肌肉肌酸激酶含量和肌糖原含量均显著提高；说明虫草菌固体培养物能够通过提高小鼠骨骼肌的总蛋白、肌肉肌酸激酶和肌糖原的含量来提高骨骼肌代谢能力，从而提高骨骼肌力量，实现抗运行性疲劳的功效。当前第1页12