一种Lasiodiplodiairanensis菌及其发酵产茉莉酸的方法与流程

本发明涉及一种lasiodiplodiairanensis菌及其发酵产茉莉酸的方法，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：茉莉酸化学名称3-氧-2-2′-顺-戊烯基-环戊烷-1-乙酸，分子式c12h18o3，分子量210.27。是一种新型的植物激素，在植物的花、茎、叶、根等组织与器官中普遍存在，在植物的生长发育过程中发挥着重要的作用。同时作为第二信号，在植物受到生物与非生物的伤害时诱导激活植物体内的防御基因，抵御外界的伤害。并且因茉莉酸及其甲酯具有清淡、幽雅的香味，所以其可作为很多香花精油主香的成分，广泛的应用于香料业的产生中。在农业生产中，茉莉酸类物质能明显的促进不育植株开花还可以用来提高植物的抗旱性，同时茉莉酸类物质可以诱导植物产生有毒物质、害虫蛋白酶抑制剂等来达到抗虫害的效果，在农业生产中可以用其来代替部分杀虫剂。目前茉莉酸的制备方法主要有三种，从植物中提取、化学合成及微生物发酵法。植物中茉莉酸含量在1-9～10-6g/g，因此，从植物中提取的量少，满足不了当前的需求。化学法根据起始原料不同，分为顺-4-庚烯酸为起始原料、乙酸乙酯为起起始原料、及2-环戊烯-1-乙二醇缩酮和2-甲基-1,3-丁二烯为起始原料的方法，但这些方法的反应收率不高(30％以下)，反应条件苛刻，并且合成的茉莉酸都是外消旋物，限制了其使用的范围。微生物发酵法是通过真菌发酵生产茉莉酸。aldridge等最早从真菌可可毛色二孢lasiodiplodiatheobroma培养液中分离出游离的茉莉酸(j.chemsocchemcoummum.1971,13:1623),这说明某些微生物具有分泌茉莉酸的可能。美国专利us20020110881a1公开了棉色二孢(diplodiagossypina)发酵产茉莉酸、茉莉酸甲酯及茉莉酸异构体的方法，其中，d.gossypinaatcc10936产茉莉酸浓度可达1.2g/l。国内，韩晓敏等为检测可可毛色二孢菌对白木香产生倍半萜的诱导作用，采用气质联用在其pda培养液中检测到茉莉酸类化合物(中国中医药杂志，2014，39(2)：192-196)，但其中茉莉酸甲酯含量不高(250mg/l)，同时没有进行相关发酵生产方面的研究。技术实现要素：本发明要解决的第一个技术问题是提供一株lasiodiplodiairanensisdwh-2，可以产生茉莉酸。本发明对变质果蔬及玉蕊、拉贡木、海桑、水黄皮、玉米、棉花等植物的腐烂部位上的微生物进行分离，筛选得到分泌茉莉酸的菌株dwh-2，经分子鉴定属于一株l.iranensis菌，其产量明显高于一般野生菌株，通过优化培养基和培养条件进一步提高了产物浓度。所述l.iranensisdwh-2已于2017年5月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2017288。所述dwh-2的活化培养，可将菌株接于pda平板上，放置在25～28℃的培养箱中活化4～5天。所述dwh-2在pda平板上，菌落生长初期为白色，且日生长量较快，生长到第四天时平板背面开始出现绿色，生长到第六天时培养基开始变成黑色，生长到第九天时培养基完全变成黑色。在电镜下观察，发现该菌的菌丝体有横隔，且为多核。所述dwh-2的its基因序列与多株l.iranensis的its基因序列相似性达99％～100％，但这些l.iranensis都没有关于产茉莉酸的报道。本发明要解决的第二个技术问题是提供一种应用所述l.iranensisdwh-2发酵产茉莉酸的方法。应用所述l.iranensisdwh-2发酵产茉莉酸，是在静止培养状态下进行。包括在20～30℃，静止发酵培养6～10天。用于所述l.iranensisdwh-2发酵产茉莉酸的发酵培养基的碳源包括蔗糖、淀粉、麦芽糖、葡萄糖、果糖中的一种或几种的混合。碳源浓度为25～500g/l。用于所述l.iranensisdwh-2发酵产茉莉酸的发酵培养基的无机氮源包括硝酸钠、尿素、硝酸铵中的一种或几种的混合。无机氮源浓度为3～15g/l。用于所述l.iranensisdwh-2发酵产茉莉酸的发酵培养基的有机氮源包括牛肉膏、蛋白胨、玉米浆、酵母膏、麦芽提取物中的一种或几种的混合。有机氮源浓度为3～15g/l。在本发明的一种实施方式中，用于所述l.iranensisdwh-2发酵产茉莉酸的发酵培养基是蔗糖25～500g/l，硝酸钠1～15g/l，磷酸二氢钾0.5～3g/l，氯化钾0.1～0.4g/l，七水硫酸镁1～9g/l，七水硫酸铁0.1～0.9g/l，玉米浆1～5g/l，0.2-20g/l大豆油，微量元素10～12ml/l，ph4.5～8；所述微量元素：七水硫酸铁0.01～0.04g/l，七水硫酸锰0.001～0.004g/l，七水硫酸铜0.001～0.004g/l，二水合钼酸钠0.001～0.004g/l。在应用l.iranensisdwh-2发酵产茉莉酸的过程中，还可以向发酵体系中添加大孔树脂。大孔树脂的型号包括xad-1、xad-2、xad-7hp、ab-8、d101。用量为5～20g/100ml。应用本发明提供的l.iranensisdwh-2发酵产茉莉酸，茉莉酸的产量可达到1760mg/l。生物材料保藏lasiodiplodiairanensisdwh-2，已于2017年5月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2017288，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。附图说明图1tlc产物初步鉴定图图2产物鉴定gc-ms图图3菌株dwh-2的进化树具体实施方式产物分析方法：采用薄层层析(tlc)对产物进行初步定性。参照文献方法，所用的薄层板为gf254，展开剂为：正己烷：乙酸乙酯：醋酸＝60：40：1，显色剂为浓硫酸：甲醇＝1：1用气质联用(gc-ms)对产物进行进一步的鉴定。参照文献方法。气质条件：气相色谱柱ab--5ms30m×0.25mm×0.25μm，载气为氦气，压力为130kg/cm2，分表压力为0.31kg/cm2，流速0.8ml/min。色谱柱采用程序升温，从起始温度50℃以20℃/min升至180℃后保持4min，再以10℃/min升至290℃后保持15min，250℃进样，不分流，进样体积1μl。用hplc(高效液相色谱)对产物的浓度进行检测，参照文献方法。流动相为甲醇：水：磷酸＝55:44.9：0.1；进样量10～30ul；流速1ml/min；检测器为紫外检测器。实施例1产茉莉酸菌株的筛选与确定发酵培养基：蔗糖25～500g/l，硝酸钠1～15g/l，磷酸二氢钾0.5～3g/l，氯化钾0.1～0.4g/l，七水硫酸镁1～9g/l，七水硫酸铁0.1～0.9g/l，玉米浆1～5g/l，0.2-20g/l大豆油，微量元素10～12ml/l，ph4.5～8。所述微量元素：七水硫酸铁0.01～0.04g/l，七水硫酸锰0.001～0.004g/l，七水硫酸铜0.001～0.004g/l，二水合钼酸钠0.001～0.004g/l。以腐烂的水果及玉蕊、拉贡木、海桑、水黄皮、玉米、棉花等植物的腐烂部位为筛菌材料，将其处理好稀释涂布在pda平板，25℃～30℃培养4～7天。用打孔器将长出的菌接于500ml装有发酵培养基的三角瓶中，静止放置在20～30℃的培养箱中发酵6～10天。发酵结束后将发酵液离心后取上清液，用6mol/l的盐酸将其ph调至3～4左右，再用0.5～5倍发酵液体积的乙酸乙酯萃取，萃取结束后用真空旋转蒸发仪将乙酸乙酯蒸除，产物溶于甲醇中。用tlc(薄层层析)进行初步的定性检测，将有红色斑点出现的发酵液(图1)进行hplc进一步的检测，观察是否有与标样出峰时间相同的峰出现。与标样出峰时间相同的样品用gc-ms(气质联用)进行鉴定，并用hplc(高效液相色谱)进行产物的浓度测定，gc-ms图见附图2。经筛选，获得一株可以产茉莉酸的菌株dwh-2，产茉莉酸的浓度达到320mg/l发酵液。将dwh-2在pda平板上培养后进行its测序，测得its基因序列(seqidno:1)与lasiodiplodiairanensis的its基因序列相似性达100％。dwh-2在pda平板上，菌落生长初期为白色，且日生长量较快，生长到第四天时平板背面开始出现绿色，生长到第六天时培养基开始变成黑色，生长到第九天时培养基完全变成黑色。在电镜下观察，发现该菌的菌丝体有横隔，且为多核。因此，经形态学与分子生物学鉴定，dwh-2为lasiodiplodiairanensis。实施例2培养方式对菌株产茉莉酸的影响发酵培养基：蔗糖25～500g/l，硝酸钠1～15g/l，磷酸二氢钾0.5～3g/l，氯化钾0.1～0.4g/l，七水硫酸镁1～9g/l，七水硫酸铁0.1～0.9g/l，玉米浆1～5g/l，0.2-20g/l大豆油，微量元素10～12ml/l，ph4.5～8。微量元素：七水硫酸铁0.01～0.04g/l，七水硫酸锰0.001～0.004g/l，七水硫酸铜0.001～0.004g/l，二水合钼酸钠0.001～0.004g/l。用打孔器将长出的菌接于500ml装有发酵培养基的三角瓶中，于25～3℃的培养箱中发酵培养6～10天，在培养的过程中设置三种不同的培养方式，静止培养、往复式摇床培养及旋转式摇床培养。发酵上清液用hplc测产物的浓度，结果如表1。表1培养方式对菌株产茉莉酸的影响培养方式产物浓度(mg/l)静置培养342往复式摇床56旋转式摇床62实施例3不同碳源对菌株产茉莉酸的影响按实施例2的方法对dwh-2进行静止培养，其中发酵培养基的碳源(50g/l)分别为蔗糖、乳糖、淀粉、麦芽糖、葡萄糖、果糖，在培养箱中25～30℃静止培养6～10天，发酵上清液用hplc测产物的浓度，结果如表2。表2不同碳源对菌株产茉莉酸的影响碳源产物浓度(mg/l)蔗糖314乳糖31淀粉140麦芽糖258葡萄糖199果糖102实施例4碳源不同浓度对菌株产茉莉酸的影响同实施例2方法，其中发酵培养基以蔗糖为唯一碳源，且设置蔗糖的浓度分别为25g/l、50g/l、75g/l、100g/l、125g/l、150g/l，300g/l，500g/l在培养箱中25～30℃静止培养6～10天。hplc测发酵液中的产物的浓度，结果如表3。表3碳源不同浓度对产茉莉酸的影响蔗糖浓度(g/l)产物浓度(mg/l)253105051775267100238125177150185300189500201实施例5无机氮源对菌株产茉莉酸的影响按实施例2的方法，其中，发酵培养基以蔗糖为唯一碳源，无机氮源分别为硝酸钠、尿素、硝酸铵、氯化铵、硫酸铵，在培养箱中25～30℃静止培养6～10天。hplc测产物的浓度如表4。表4无机氮源对产茉莉酸的影响无机氮源产物浓度(mg/l)硝酸钠224尿素116硝酸铵3.6氯化铵0.503硫酸铵0.45实施例6无机氮浓度对菌株产茉莉酸的影响按实施例2的方法，其中发酵培养基以蔗糖为唯一碳源，无机氮源为硝酸钠，设置硝酸钠的浓度为3g/l、4.5g/l、6g/l、7.5g/l、9g/l、10.5g/l，15g/l在培养箱中25～30℃静止培养6～10天。hplc测产物的浓度如表5。表5无机氮浓度对产茉莉酸的影响硝酸钠浓度(g/l)产物浓度(mg/l)37934.580567097.5447.49660.410.5399.515380.9实施例7有机氮源对菌株产茉莉酸的影响按实施例2的方法，其中发酵培养基以蔗糖为唯一碳源，无机氮源为硝酸钠，有机氮源为牛肉膏、蛋白胨、玉米浆、酵母膏、麦芽提取物，在培养箱中25～30℃静止培养6～10天。hplc测产物的浓度如表6。表6有机氮源种类对菌株产茉莉酸的影响有机氮种类产物浓度(mg/l)牛肉膏849蛋白胨475玉米浆850酵母膏702麦芽提取物294实施例8大孔树脂对对菌株产茉莉酸的影响按实施例2的方法，在接种后培养第3-5天时，向培养基中加入灭过菌的xad-1、xad-2、xad-7hp、ab-8、d101，5～20％(w/v)，吸附部分产物，避免当培养液中产物浓度达到一定后，不再增加反而会分解。发酵结束后，分离树脂和上清液，用乙酸乙酯洗脱，用真空旋转蒸发仪蒸除乙酸乙酯。hplc测产物的浓度如表7。表7大孔树脂对菌株产茉莉酸的影响树脂类型产物浓度(mg/l)xad-11210xad-21760xad-7hp1527ab-81760d1011720虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。sequencelisting<110>江南大学<120>一种lasiodiplodiairanensis菌及其发酵产茉莉酸的方法<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>519<212>dna<213>lasiodiplodiairanensis<400>1cctgcggaaggatcattaccgagttttcgggcttcggctcgactctcccaccctttgtga60acgtacctctgttgctttggcggctccggccgccaaaggacctccaaactccagtcagta120aacgcagacgtctgataaacaagttaataaactaaaactttcaacaacggatctcttggt180tctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagt240gaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccccttggtattccggggggcatgcctgtt300cgagcgtcattacaaccctcaagctctgcttggaattgggcaccgtcctcactgcggacg360cgcctcaaagacctcggcggtggctgttcagccctcaagcgtagtagaatacacctcgct420ttggagtggttggcgtcgcccgccggacgaaccttctgaacttttctcaaggttgacctc480ggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaa519当前第1页12