本发明涉及京尼平苷在促进骨骼肌快肌生成中的应用，属于天然产物治疗领域。
背景技术：
骨骼肌是人体直接参与运动的器官，约占人体总重量的40％-50％，也是人体最大的组织，人体的运动和姿态维持，都离不开其功能的正常发挥。骨骼肌又可称为横纹肌，人体大约有600多块骨骼肌。骨骼肌细胞呈纤维状，不分支，有明显横纹，核很多，且都位于细胞膜下方。肌细胞内有许多沿细胞长轴平行排列的细丝状肌原纤维。运动系统的最基本功能单位，也称运动单元，是由运动神经元和一束肌纤维组成，其中肌纤维具有相似、但不完全相同的结构和功能。许多(从几十到几百)的运动单元组装在一起，从而构成一块完整的骨骼肌，其中每一运动单元都有着自己特殊且唯一的作用。肌肉组装所用的运动单元都是特殊选择的，这样保证肌肉可以最好的完成运动功能所需的所有要求。肌纤维的异质性是骨骼肌强大适应能力的基础，同一块骨骼肌需要适应不同的运动要求，例如持续性低强度的活动(维持身体姿态)；重复性中强度的运动(身体的运动)；以及短时间极高强度的活动(跳远、踢)。另外，肌纤维结构和功能的性质，也称为肌纤维表型。
骨骼肌纤维按形态和功能可以分为快肌纤维和慢肌纤维。从代谢特征上区别，慢肌纤维有氧氧化能力较高，表现为线粒体数量多，体积大，氧化酶活性较高，依赖氧化磷酸化持续产生atp，脂质是这类纤维的首选供能原料，甘油三酯含量高，毛细血管丰富，肌红蛋白含量高。而肌肉需要短时间内高频率收缩时快肌纤维被激活。快肌纤维无氧代谢能力较高，表现为肌纤维中参与无氧氧化过程酶的活性较慢肌纤维高，肌糖原含量较高。不同肌纤维在同一肌肉中所占的数量百分比称为肌纤维类型的百分组成。两类肌纤维百分组成与某些基本素质关系密切。慢肌百分组成与一般耐力和力量耐力有关；而快肌百分组成与速度、爆发力有关。
随着近年来研究的深入，骨骼肌肌纤维类型是由肌球蛋白重链(myhc)亚型来决定的。myhc基因家族又称肌球蛋白重链基因家族，是骨骼肌纤维中最重要的肌原纤维蛋白之一，是肌肉收缩的主要功能蛋白，维持肌细胞结构的完整性，它的基因表达已经成为肌肉纤维类型划分的主要分子标记。肌肉所含肌球蛋白的亚型不同，即表现出不同的收缩能力和atpase活性，并且首先在人和哨齿类动物上确定了特定的肌纤维类型与四种肌纤维肌球蛋白重链(myosinheavychain，myhc)异构体中的某一种类型的对应关系。至今为止，在哺乳动物骨骼肌中发现了八种myhc亚型，但在成人骨骼肌中只表达了myhc家族的ⅰ、ⅱa、ⅱx和ⅱb型，它们分别对应i型(慢速氧化型)、ⅱa型(快速氧化型)、ⅱx型(中间型)和ⅱb型(快速酵解型)4种肌纤维类型，代谢类型从氧化到酵解过渡，收缩速度依次增加。在锻炼过程中，肌纤维类型可以转变。有研究表明，在骨骼肌急性挫伤模型中，myhc-ⅱb的表达升高，可以促进新骨骼肌生成。ⅱb型纤维含量较高的骨骼肌的直径往往较大。高比例的myhc-ⅱb有助于增加肌肉质量。快肌质量的增加可以通过改变远程组织中脂肪酸氧化能力来引起肥胖的衰退并且改善代谢情况，力量训练可能特别有利于肥胖人群。更有研究指出，骨骼肌中氧化向糖酵解代谢转变在糖尿病状态下具有潜在益处，可以提高葡萄糖稳态。在老年人中myhc-ⅱb往往会缺失，这表明骨骼肌的组成与衰老相关的肌肉功能丧失和肌肉疾病有关。虽然肌纤维的最大收缩速度主要由肌球蛋白的atp酶来决定，但其最大力量则主要由肌纤维的横截面积来决定。
栀子果是茜草科栀子属植物栀子gardeniajasminoidesellis的成熟果实，主要分布在热带、亚热带地区，在中国其产量约占世界总产量的90％。栀子果是卫生部颁布的首批药食两用资源，常用来做中药、食品添加剂、食用色素、榨油等，具有消炎、镇痛、保肝利胆、抗氧化等功效。其主要活性成分包含环烯醚萜、藏红花苷类，环烯醚萜类主要以京尼平苷为主，藏红花苷类主要以藏红花素为主。京尼平苷是栀子众多药理活性的物质基础之一，含量随产地的不同主要在3–9％，其结构式如图1所示。迄今为止，京尼平苷在促进骨骼肌快肌生成的作用方面还未见报道。
技术实现要素：
本发明提供了用于促进骨骼肌快肌生成的化合物或者组合物，所述化合物为京尼平苷，所述组合物为含有京尼平苷的组合物。
所述骨骼肌快肌为骨骼肌肌纤维中的一类，即ⅱ型肌纤维，也叫白肌。骨骼肌快肌的糖代谢是以糖酵解为主。骨骼肌快肌在腓肠肌中含量较多，主要在短距离无氧运动中起作用。
所述促进骨骼肌快肌生成是指在一定剂量和时间范围内，成肌细胞和骨骼肌组织中i型肌纤维(慢肌)减少、ii型肌纤维(快肌)增加，和/或肌纤维类型发生转化，和/或使肌肉质量增加、肌纤维面积增大。促进骨骼肌快肌生成有利于在短期运动中发挥主要作用。
所述京尼平苷的来源可以是：栀子粕、栀子果、杜仲，地黄、牛膝、白花蛇舌草、黄连解毒汤等。
所述组合物，还包括药学上接受的辅料，包括溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、ph值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
所述化合物或者组合物，还可以用于制备短距离运动所需运动食品，例如功能性饮料、功能性饼干。
本发明通过腹腔注射京尼平苷标品对小鼠进行给药处理，从切片染色和qpcr结果来看，给药组的快肌肌纤维数目明显多于对照组，ⅰ型纤维相关基因表达明显减少，ⅱ型纤维相关基因显著增加，改变了骨骼肌肌纤维分型。本发明继续在体外实验中进行验证，用京尼平苷标品刺激分化的c2c12成肌细胞，从免疫荧光结果来看，与空白对照组相比，京尼平苷的处理可以增加快肌肌纤维数目。因此，我们认为京尼平苷有促进骨骼肌快肌生成的作用，具有应用于短距离运动食品的潜在作用。
附图说明
图1京尼平苷的化学结构式。
图2对小鼠骨骼肌腓肠肌、比目鱼肌(gas、sol)进行苏木精与伊红(he)染色(n＝3)(显微镜20倍，20x)，con为空白对照组；geni为京尼平苷(geniposide)处理组。
图3对小鼠骨骼肌的gas部分进行琥珀酸脱氢酶(sdh)染色(n＝3)(20x)，con为空白对照组；geni为京尼平苷(geniposide)处理组。对于sdh染色gas结果中i型肌纤维的比例进行统计，数据用平均值±标准误表示，每组三次平行。与对照相比，*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001(t检验)。
图4(a)对小鼠骨骼肌gas部分进行腺苷三磷酸酶(atpase)染色(ph＝4.3)(n＝3)(20x)，对于atpase染色gas结果中i型肌纤维的比例进行统计；(b)对小鼠骨骼肌sol部分进行atpase染色(ph＝4.3)(n＝3)(20x)，对于atpase染色sol结果中i型肌纤维的比例进行统计；(c)对小鼠骨骼肌gas部分进行atpase染色(ph＝10.5)(n＝3)(20x)，对于atpase染色gas结果中i型肌纤维的比例进行统计；(d)对小鼠骨骼肌sol部分进行atpase染色(ph＝10.5)(n＝3)(20x)，对于atpase染色sol结果中i型肌纤维的比例进行统计。con为空白对照组；geni为geniposide处理组，与对照相比，*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001(t检验)，每组三次平行。
图5实时定量pcr(rt-qpcr)检测小鼠骨骼肌gas中myhc四种亚型myhc-ⅰ、myhc-ⅱa、myhc-ⅱx、myhc-ⅱb、慢肌标志基因mb和tnni1的mrna表达水平，数据用平均值±标准误表示，每组三次平行。与对照相比，*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001(t检验)。con为空白对照组；geni为geniposide处理组。
图6c2c12细胞分化2天后，用0.2mg/ml的京尼平苷刺激细胞，12h后，固定细胞，分别用anti-myosin-fast(a)和anti-myosin-slow(b)的抗体进行免疫荧光检测，用荧光显微镜在10x镜下随机拍摄视野，图中所选视野具有代表性。con为空白对照组；geni为geniposide处理组。
图7(a)用不同浓度(0,0.0125,0.025,0.05,0.1,0.2mg/ml)的京尼平苷刺激c2c12肌管细胞12h，提取rna，用rt-qpcr分析myhc-ⅰ、myhc-ⅱa、myhc-ⅱx、myhc-ⅱb的mrna水平。(b)用0.4mg/ml的京尼平苷分别处理c2c12肌管细胞0、1、2、4、8、12h，提取rna，用rt-qpcr分析myhc-ⅰ、myhc-ⅱa、myhc-ⅱx、myhc-ⅱb的mrna水平。con为空白对照组；geni为geniposide处理组。数据用平均值±标准误表示，每组三次平行。与对照相比，*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001(t检验)。
具体实施方式
实施例1京尼平苷促进骨骼肌快肌生成作用的验证
1实验方法
1.1动物实验
实验中所用6-8周的雄鼠饲养在spf(无特定病原体)级动物房中，动物可以自由进食和饮水(由上海斯莱克实验动物中心提供)。动物房保持恒温22±3℃，相对湿度35±5％，12小时为周期昼夜循环。模式动物的使用和操作均严格按照江南大学食品科学与技术学院动物管理和使用委员会的规程进行。
待雄鼠适应了新环境之后，将其随机分为两组，空白组和处理组。空白组不做任何处理，处理组要根据体重每天注射京尼平苷标品(25mg/kg)(图1)，连续21天。21天过后，处死所有小鼠，取左右后肢中的腓肠肌(gas)、比目鱼肌(sol)、胫骨前肌(ta)，将右腿gas、sol固定在黄蓍树胶中进行快速冷冻再进行冰冻切片用于组学分析，其余组织用液氮立即冷冻，再放入-80℃保存用于之后rna的提取。
1.2细胞培养、细胞处理、免疫荧光
c2c12小鼠成肌细胞置于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养，生长在含有10％胎牛血清(fbs)和1％的双抗(p/s)的dmem培养基中。c2c12细胞诱导分化为肌纤维时，需要将细胞培养基中fbs的成分更换为2％马血清(hs)即可。
待c2c12细胞分化第4天，成肌细胞大部分已经分化为肌管后，对c2c12细胞进行京尼平苷刺激处理。浓度梯度：用0、0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2mg/ml的京尼平苷分别刺激细胞12h。时间梯度：用0.4mg/ml的京尼平苷分别处理c2c12肌管细胞0、1、2、4、8、12h。
免疫荧光染色：待c2c12细胞分化第2天，用0.2mg/ml的京尼平苷刺激细胞12h后，洗掉培液，加入甲醇固定，然后磷酸缓冲盐溶液(pbs)漂洗3次，每次10分钟。配制3％牛血清蛋白(bsa)的pbs溶液，加入终浓度为0.1％的聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)对细胞透化处理，室温封闭细胞1小时。pbs洗涤3次。加入按照适当比例稀释的快肌一抗anti-myosin-fast或慢肌一抗anti-myosin-slow，4℃结合过夜。一抗结合后，用pbs漂洗3次，加入二抗在室温下结合1小时，二抗结合过程中需要避光。再次漂洗，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)对细胞核进行染色，pbs漂洗3次。在倒置荧光显微镜下观察样品，并拍摄照片。
1.3rna提取和实时定量荧光pcr
使用trizol试剂从c2c12细胞和组织样品中提取总rna，并用nanodrop对rna浓度进行测定。使用primescriptrt系统(takara)合成第一链cdna。实时定量pcr在abistep-one7900rt-pcr系统上进行。每个样品做三次平行。
表1pt-pcr引物序列
1.4组学分析
使用苏木精和伊红染色(he)、琥珀酸脱氢酶染色(sdh)和腺苷三磷酸酶染色(atpase)观察gas和sol组织冰冻切片中空白对照组与京尼平苷处理组的情况。用倒置光学显微镜来观察切片。
2实验结果
2.1京尼平苷可以改变骨骼肌肌纤维分型
从图2中he染色来看，京尼平苷的处理没有破坏小鼠骨骼肌肌纤维形态。sdh染色，ⅰ型肌纤维(慢肌)呈深蓝色，ⅱ型肌纤维(快肌)浅蓝色。由图3可知，gas中京尼平苷组ⅰ型肌纤维比例显著下降。接着我们用atpase染色技术，对不同的肌肉进行了分型鉴定，并统计出其中的i型肌纤维的比例(图4)。在酸性的缓冲液条件下(ph＝4.3)i型肌纤维将呈现黑色(图4a和图4b)，而在碱性的缓冲液条件下(ph＝10.5)ii型肌纤维将呈现黑色(图4c和图4d)。从结果可以直观发现，不管是在gas中还是在sol中，京尼平苷的处理可以显著降低骨骼肌肌纤维中慢肌肌纤维的数量。
我们进一步检测gas中相关肌纤维的基因表达变化。图5的结果显示，京尼平苷可以显著抑制慢肌相关基因(myhc-ⅰ、mb、tnni1)表达，促进快肌相关基因(myhc-ⅱa、myhc-ⅱb、myhc-ⅱx)表达。因此我们认为，京尼平苷在体内可以改变骨骼肌肌纤维分型，导致肌纤维类型“慢→快”的转换，有助于维持快肌肌纤维的生理特性。
2.2京尼平苷对细胞系统中肌纤维类型的调控
为了进一步研究京尼平苷对肌纤维类型的改变，我们应用免疫荧光方法来标记不同类型的肌管。图6中，在分化2天的c2c12中进行京尼平苷的刺激能够显著增加快肌类型的肌管数目，同时减少慢肌类型的肌管数目。而且我们在c2c12细胞中重复了定量pcr的实验，用浓度梯度(图7a)和时间梯度(图7b)对细胞进行京尼平苷刺激，结果与体内实验得到结论基本一致，随着京尼平苷浓度上升(0.2mg/ml)和刺激时间增长(12h)，慢肌基因myhc-ⅰ表达显著降低，快肌基因myhc-ⅱb表达显著增加。我们得出结论，京尼平苷在体外也可以引起肌纤维类型“慢→快”的转换。