本发明属于生物化工领域，具体涉及一种具有降糖活性的人参皂苷组合物及其应用。
背景技术：
糖尿病是一种与胰岛素的产生和作用异常相关、以高血糖症为主要特征的代谢紊乱综合征，是一种严重危害健康的慢性疾病，是当前人类所面临的主要健康问题之一。糖尿病可分为胰岛素依赖型糖尿病(i型糖尿病)及非胰岛素依赖型糖尿病(ii型糖尿病)，其中90%以上为ii型糖尿病。随着社会经济的发展和人们生活方式的改变，糖尿病患者的数量迅速增加。据最新统计数据表明全世界约有2.46亿人患有ii型糖尿病，预计在20年内ii型糖尿病患者数目将增至3.8亿。我国目前糖尿病患者人数已高达8000多万人，占全世界糖尿病患者总数的三分之一，成为全球糖尿病第一大国。目前糖尿病发病率在全球范围内呈上升趋势，尤其在发展中国家上升的趋势更加明显，其死亡率仅次于心脑血管疾病、癌症，被认为是人类第三大杀手。因此，积极预防和治疗糖尿病已迫在眉睫。
现阶段治疗ii型糖尿病的药物主要为传统抗糖尿病药物，包括磺酰脲类、格列奈类、双胍类、噻唑烷二酮类、α-葡萄糖苷酶抑制剂及胰岛素等，这些药物均存在不同程度的不良反应，如引发低血糖、胃肠道不适、肥胖等。随着对糖尿病基础理论研究的深入，开发作用于新靶点、避免传统降糖药物的副作用、对胰岛β细胞具有保护作用的糖尿病治疗新药成为国内外研究的热点。
人参为五加科植物人参属的根茎，为多年生草本植物，是驰名中外的名贵药材。现代医学研究表明人参在免疫功能调节，抗糖尿病、增强肝功能、改善心脑血管障碍、抗动脉硬化、血压调节等方面均有明显的功效，因此人参皂苷作为人参的主要有效成分，其在抗糖尿病领域的应用正成为糖尿病新药开发的热点。
中国专利申请201510612222.3，其公开了20(s)-人参皂苷rg3能够浓度依赖性激活sirt1蛋白，作为sirt1蛋白激动剂参与能量代谢，发挥降糖作用，并公开了其在糖尿药治疗药物中的应用。
中国专利申请201510012423.x，其公开了20(r)-人参皂苷rg3在制备缓解和治疗糖尿病药物中的新应用。
中国专利201110005851.1，其公开了以人参皂苷rb3为活性成分的组合物在制备治疗糖尿病药物的应用。
以上均为人参皂苷单个皂苷成分的药物应用，现有技术中鲜有对人参皂苷不同皂苷混合形成的组合物能提高降糖作用的报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种具有降糖活性的人参皂苷组合物，作为新的人参皂苷组合物，充分发挥各组分的降糖活性，提高降糖效果；另外，本发明还提供了该人参皂苷组合物在制备预防和治疗糖尿病产品中的应用。
本发明所采用的技术方案为：
具有降糖活性的人参皂苷组合物，其特征在于：
所述的人参皂苷组合物包含二醇组人参皂苷和三醇组人参皂苷；
二醇组人参皂苷选自人参皂苷rk1、rg3、rg5中的一种或两种或三种；
三醇组人参皂苷选自人参皂苷rk3、rh4中的一种或两种。
二醇组人参皂苷与三醇组人参皂苷的质量比是（20:1）~（1:5）。
二醇组人参皂苷与三醇组人参皂苷的质量比是（3:1）~（1:1）。
二醇组人参皂苷包含人参皂苷rg5。
三醇组人参皂苷包含人参皂苷rh4。
二醇组人参皂苷选自人参皂苷rk1、rg3、rg5中的两种，混合质量比为（1:1）~（1:3）。
二醇组人参皂苷选自人参皂苷rk1、rg3、rg5中的三种，混合质量比为（1:1:2）~（1:2:4）。
三醇组人参皂苷选自人参皂苷rk3、rh4中的两种，混合质量比为（1:1）~（1:3）。
如所述的具有降糖活性的人参皂苷组合物的应用，其特征在于：
所述的人参皂苷组合物作为预防或治疗糖尿病的降糖药物、降糖保健食品、降糖功能食品的有效成分。
本发明具有以下优点：
1）通过不同类型人参皂苷单体之间的组合，合理优化单体的比例，充分发挥了各单体降糖机制的互补特性，显著提高降糖效果；
2）在保证降糖效果的同时，人参皂苷的使用量没有明显增加，降低了生产的成本，同时也为产品的生物安全性提供了保障；
3）相比于单个人参皂苷单体的降糖效果，人参皂苷组合物在药效上更能达到新药开发的要求，具有成药性强，易于大规模生产的特点，更易用于成药开发。
附图说明
图1：在人参皂苷单体及组合物对ii型糖尿病小鼠模型的治疗过程中ii型糖尿病小鼠的体重变化。
图2：在人参皂苷单体及组合物对ii型糖尿病小鼠模型的治疗过程中ii型糖尿病小鼠的肝脏he染色切片。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
本申请经过研究和实践，发现人参皂苷的不同单体在对抗不同糖尿病模型引起的高血糖时表现出降糖效果具有明显差异，在此基础上进一步研究发现不同皂苷混合形成的组合物与单个皂苷成分相比降糖作用显著提高。同时经过大量的实验，总结归纳获得了一种组合物，其由二醇组人参皂苷及三醇组人参皂苷组成，能够充分发挥各组分的作用，同时降低了单个皂苷的使用浓度，具有高效，低成本，低毒副作用等特点，成药性很强。
本发明涉及一种具有降糖活性的人参皂苷组合物，包含有二醇组人参皂苷和三醇组人参皂苷，其中，二醇组人参皂苷选自人参皂苷rk1、rg3、rg5中的一种或两种或三种，三醇组人参皂苷选自人参皂苷rk3、rh4中的一种或两种。
二醇组人参皂苷与三醇组人参皂苷的质量比是（20:1）~（1:5），优选（3:1）~（1:1），更优选2:1。
二醇组人参皂苷优选为包含人参皂苷rg5。三醇组人参皂苷优选为包含人参皂苷rh4。
二醇组人参皂苷选自人参皂苷rk1、rg3、rg5中的两种时，混合质量比为（1:1）~（1:3），二醇组人参皂苷选自人参皂苷rk1、rg3、rg5中的三种时，混合质量比为（1:1:2）~（1:2:4）。
三醇组人参皂苷选自人参皂苷rk3、rh4中的两种时，混合质量比为（1:1）~（1:3）。
上述具有降糖活性的人参皂苷组合物，可以作为预防和治疗糖尿病的降糖药物、降糖保健食品、降糖功能食品的有效成分。
上述人参皂苷组合物用于制备预防和治疗糖尿病的降糖药物时，药品制剂中还包括药学上可接受的辅剂，药学上可接受的辅剂包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂等，且与活性成分人参皂苷组合物相容。将活性成分人参皂苷组合物和药学上可接受的辅剂组合在一起，配制成各种药品制剂，优选口服药物制剂或注射剂，如颗粒剂、片剂、丸剂和胶囊，最优选为片剂或胶囊剂。
以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用均为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器。
实施例1人参皂苷单体体外降糖实验
实验药品：二醇组人参皂苷：人参皂苷rk1、rg3、rg5；
三醇组人参皂苷：人参皂苷rk3、rh4；
以上药品纯度均＞98%。
实验细胞：ins-1大鼠胰岛瘤细胞、hepg2人肝癌细胞和3t3-l1小鼠前脂肪细胞均购自上海博古生物科技有限公司，代数在10代以内。
试验方法及结果：
1.人参皂苷单体对四氧嘧啶诱导的ins-1损伤模型细胞活力的影响实验
ins-1细胞复苏后用含10%灭活小牛血清的rpmi1640培养液转入100ml培养瓶中，在37℃、5%co2条件下培养。当细胞贴壁长满后，倾去培养基，用0.25%胰蛋白酶消化，每3天按1:3比例传代1次，对数生长期的细胞用于实验。
取对数生长期的细胞，用含10%fbs的rpmi1640培养基调整至合适的细胞浓度接种于96孔培养板中，实验分为正常对照组及四氧嘧啶组(30，25，20，15，10，5mm)。待细胞生长至90%融合时，按照实验分组加药，在37℃、5%co2培养箱中培养48h后，mtt比色法于570nm波长下测定各组吸光度值，并计算细胞存活率及ic50(半数抑制率)。四氧嘧啶对ins-1细胞的ic50为16mm，因此，在药效评价中，选择16mm作为四氧嘧啶诱导ins-1细胞损伤的浓度。
将处于对数生长期的细胞消化后，将细胞稀释至1×105细胞/ml，接种于96孔板中，每孔接种100μl。将接种细胞后的96孔板置于5％co2、37℃恒温培养箱中培养，待细胞生长至90％融合时，将细胞随机分为：空白对照组：2％fbs的dmem培养基；模型对照组：四氧嘧啶浓度为16mm的并含有2％fbs的dmem培养基；给药组：四氧嘧啶浓度为16mm的并含有2％fbs的dmem培养基培养的同时给予不同样品的药液；二甲双胍组：四氧嘧啶浓度为16mm的并含有2％fbs的dmem培养基培养的同时给予1mm二甲双胍。培养48h后，mtt比色法于570nm波长下测定各组吸光度值。照如下公式计算人参皂苷单体对ins-1损伤模型细胞活力的增加率，结果见表1。
ins-1细胞活力的增加率=（给药组细胞活力-模型组细胞活力）/模型组细胞活力*100％
实验结果：16mm四氧嘧啶处理ins-1细胞48h能够建立稳定的细胞损伤模型，受试药品的加入能够有效的提高损伤模型的细胞活力，与二醇组人参皂苷相比较，三醇组人参皂苷具有更好的修复损伤模型能力，其中人参皂苷rh4作用的细胞活力提高可达93.96%，修复效果理想。
2.人参皂苷单体对高糖高脂诱导的hepg2胰岛素抵抗细胞葡萄糖消耗作用的影响
人肝癌细胞hepg210000个/孔接种于96孔板，每孔100μl培养液。24h后，将培养液换成含不同浓度人参皂苷单体、0.5mm棕榈酸、0.5%bsa、1nm胰岛素、不含血清的高糖dmem培养基，实验另设无细胞空白组（无细胞、含0.5％bsa、1nm胰岛素的无血清低糖dmem培养基）、对照组（含0.5%bsa、1nm胰岛素的无血清低糖dmem培养基）、模型组（0.5mm棕榈酸、0.5%bsa、1nm胰岛素、不含血清的高糖dmem培养基）和阳性药组（1mm二甲双胍、0.5mm棕榈酸、0.5%bsa、1nm胰岛素、不含血清的高糖dmem培养基）。孵育24h后，每孔取10μl上清液，用葡萄糖测定试剂盒（葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法）测定每孔的葡萄糖消耗量。移去96孔板中的培养液，mtt比色法于570nm波长下测定各孔吸光度值。
以无细胞空白组的葡萄糖含量减去接种细胞的测试孔中的葡萄糖含量，即得各孔的葡萄糖消耗量。同时，除以各孔细胞的mtt值进行细胞数量的校正。
实验结果：结果如表2所示，0.5mm棕榈酸在高糖环境下能够建立稳定的hepg2胰岛素抵抗模型，受试药品的加入能够改善模型细胞的葡萄糖消耗，具有缓解胰岛抵抗的作用。二醇组人参皂苷（人参皂苷rk1、rg3、rg5），在解除高糖高脂建立的胰岛抵抗模型效果上明显优于三醇组人参皂苷（人参皂苷rk3、rh4），其中二醇组人参皂苷rg3促进胰岛素抵抗的hepg2细胞的葡萄糖消耗的效果最为显著，其次为人参皂苷rg5。
3.人参皂苷单体对3t3-l1胰岛素抵抗细胞葡萄糖消耗作用的影响
3t3-l1前脂肪细胞30000个/孔接种于48孔板，每孔0.5ml培养液。待细胞汇合之后，继续培养两天，将培养液换成含1μm地塞米松、0.5mm3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（ibmx）、10μg/ml胰岛素、10%fbs的高糖dmem培养液培养2天；随后将培养液换成含10μg/ml胰岛素、10%fbs的高糖dmem培养液培养2天；最后将培养液换成含10%fbs的高糖dmem培养液，每2天换一次培养液。诱导分化10-12天后，约80%的3t3-l1细胞分化为成熟脂肪细胞。用1μm地塞米松处理细胞24h，使细胞产生胰岛素抵抗。随后将培养液换成含不同浓度人参皂苷单体的高糖dmem培养基，同时设置无细胞空白组、对照组、模型组和阳性药组（1mm二甲双胍），继续培养48h。
用葡萄糖测定试剂盒测定每孔的葡萄糖消耗量。随后将96孔板中的培养液吸尽，mtt比色法于570nm波长下测定各孔吸光度值，以无细胞空白组的葡萄糖含量减去接种细胞的测试孔中的葡萄糖含量，即得各孔的葡萄糖消耗量。同时，除以各孔细胞的mtt值进行细胞数量的校正。
实验结果：如表3所示，人参皂苷rk1、rk3、rg3、rg5、rh4对胰岛素抵抗3t3-l1细胞的葡萄糖消耗均有一定程度的促进作用，其中人参皂苷rg3促进胰岛素抵抗的3t3-l1细胞的葡萄糖消耗的效果最为显著，其次为人参皂苷rg5。在解除3t3-l1胰岛抵抗模型效果上，二醇组人参皂苷明显优于三醇组人参皂苷，这与hepg2细胞胰岛素抵抗模型的结果一致。
上述人参皂苷体外模型结果显示，人参皂苷单体对建立的糖尿病体外模型均有缓解效果，但是二醇组皂苷与三醇组皂苷在不同的建模机制下建立的体外模型所表现的缓解效果存在明显的差异。
实施例2人参皂苷单体及药物组合对ⅱ型糖尿病小鼠模型的治疗作用
造模：健康雄性、清洁级5～6周龄的c57bl/6小鼠（体重18±2g）110只，购买于西安交通大学医学院动物中心。小鼠适应性饲养7天，随机分为两组，一组10只，给予基础饲料；一组100只，给予高脂高糖饲料。6周后，高脂高糖饮食组禁食不禁水12h后，腹腔注射stz(柠檬酸缓冲液配制)30mg/kg，每天一次，连续注射5天，建立糖尿病模型。将小鼠禁食(不禁水)12h，每只小鼠眼底静脉丛取血0.2ml，分离血清。取10μl血清于样品管中按照试剂盒说明的操作方法测定小鼠的空腹血糖值。空腹血糖值≥11.1mmol/l的小鼠视为糖尿病模型小鼠，可用于后续实验。
动物分组：高血糖小鼠随机分成8组，每组10只动物，分别为模型组、二醇组rg3（60mg/kg）组、三醇组rh4（60mg/kg）组、二醇组rg5（60mg/kg）组、二醇组rg3（40mg/kg）+三醇组rh4（20mg/kg）组、二醇组rg3（40mg/kg）+二醇组rg5（20mg/kg）组、三醇组rh4（20mg/kg）+二醇组rg5（40mg/kg）组、阳性药二甲双胍组(100mg/kg)。药物溶于0.5％羧甲基纤维素钠溶液，所有小鼠每天灌胃相应剂量的药物一次，对照组和模型组小鼠给予同等体积溶剂0.5％羧甲基纤维素钠溶液。连续给药三周。
指标检测：给药前和给药后每周测定一次小鼠的空腹血糖，具体操作如下：动物禁食(不禁水)12h，尾静脉采血检测葡萄糖水平即为空腹血糖。从造模开始，到给药结束，每周一次称量小鼠体重。给药结束，处死小鼠，取小鼠肝脏，进行he染色，制作病理切片。
实验结果：
1）血糖检测
人参皂苷单体和药物组合都能够显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖水平，改善血糖代谢，人参皂苷药物组合rg3+rh4、rg3+rg5、rh4+rg5降糖效果优于人参皂苷rg3、rh4和rg5单体。与已有降糖药二甲双胍相比，人参皂苷药物组合其改善葡萄糖代谢能力不弱于二甲双胍，具体结果见表4。
2）安全性评价
体重监测：各组小鼠给药前初始体重无明显差异，灌胃3周后，正常组小鼠体重稳定增加，模型组小鼠体重较正常组显著降低。人参皂苷组和二甲双胍组小鼠体重与模型组基本相当，药物本身不会造成小鼠体重明显下降，结果见图1。
he染色：对照组光镜下肝小叶结构正常，细胞边界清晰，细胞核呈圆形且位于细胞中央，肝细胞以中央静脉为中心成索状排列；模型组肝索紊乱，肝细胞轮廓模糊，细胞核皱缩或裂解，肝细胞空泡变性，肝组织出现明显病变；二甲双胍组肝小叶结构完整，肝细胞轮廓较模型组清晰，肝细胞空泡变性减少；人参皂苷rh4组肝小叶结构基本完整，可见轻度的脂肪变性与空泡变性；人参皂苷rg3、rg5、rg3+rh4、rg3+rg5、rh4+rg5组肝小叶结构完整，肝细胞索轻度紊乱，核质较清晰，脂肪变性与空泡变性高度缓解。病理切片见图2。
人参皂苷组合物治疗ⅱ型糖尿病小鼠体内实验结果显示，人参皂苷组合物改善血糖代谢的效果明显高于各人参皂苷单体，与临床一线药二甲双胍相当。给药3周受试动物未见与药物毒性相关的毒性反应，表明该组合物安全性良好。
实施例3人参皂苷片剂的制备
取人参皂苷组合物（人参皂苷rg560g和人参皂苷rh430g）90g，羧甲基纤维素钠70g，微晶纤维素200g，羧甲淀粉钠70g、硬脂酸镁2g为原料。
将上述主药和辅料分别过80目筛，充分混匀，采用80％乙醇为粘合剂，用16目筛网制粒，55~60℃干燥，14目筛网整粒，压片，每片0.4g。
实施例4人参皂苷胶囊剂的制备
取人参皂苷组合物（人参皂苷rg580g和人参皂苷rh440g）120g、枸杞子350g、知母350g、山药300g为原料。
取枸杞子、知母、山药，加水煎煮2次，每次加12倍量水，各煎煮2h，煎液过滤，合并滤液，减压浓缩干燥，粉碎，过80目筛后，与人参皂苷组合物混合，采用80％乙醇制软材，16目筛制粒，55~60℃干燥，分装于0号胶囊中，每粒0.4g。
实施例5人参皂苷组合物产品对ⅱ型糖尿病大鼠模型的治疗作用
取wistar大鼠（200±20g）60只，适应生长7天后，分为空白组（10只）和模型组（50只），模型组给予高糖高脂饲料，空白组给予正常饲料。喂养一个月后，取血测定其空腹总胆固醇、甘油三脂、胰岛素及血糖的含量，将胰岛素抵抗的大鼠再按30mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素（stz），7天后测定空腹血糖，血糖值大于11.1mmol/l的大鼠共40只，随机分成4组（模型组，人参皂苷组合物片剂混悬液组，人参皂苷组合物胶囊剂混悬液组，二甲双胍组，所述人参皂苷组合物片剂和人参皂苷组合物胶囊剂按实施例3制备），每组10只。分组后给糖尿病大鼠再喂以高糖高脂饮食，并于每天灌胃给药。空白组和模型组均给予0.5%的cmc-na溶液；人参皂苷片剂混悬液组是将人参皂苷片剂混悬于0.5%cmc-na溶液中，人参皂苷胶囊剂混悬液组是将人参皂苷胶囊剂混悬于0.5%cmc-na溶液中，按50mg/kg人参皂苷剂量给大鼠灌胃；二甲双胍组灌胃给予50mg/kg二甲双胍。连续给药4周后，禁食不禁水12h后眼眶取血，处死大鼠，收集血清。
治疗糖尿病指标测定：测定大鼠给药后体重变化，血清葡萄糖，总胆固醇，甘油三脂。以上指标均用试剂盒测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
实验结果：如表5所示，以人参皂苷组合物为主要成分的产品能增加ⅱ型糖尿病大鼠的体重，显著降低其血糖，降低总胆固醇，甘油三脂含量，改善糖脂代谢紊乱的症状，其改善糖脂代谢紊乱的效果与阳性药二甲双胍相当。
本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。