本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，以及该冻干粉的应用。
背景技术：
干细胞(stemcell，sc)是指具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的原始细胞。根据分化能力可分为胚胎干细胞(embryonicstemcells，escs)和成体干细胞(adultstemcells，ascs)。胚胎干细胞即全能型干细胞，在分化能力上最具研究价值。但其来源于胚胎，势必存在着伦理方面和安全性方面的问题，所以胚胎干细胞在应用上受到了限制。然而，胎盘的采集简便易行，不会引起母亲和新生儿任何不适的感觉或产生任何不良的影响。过去胎盘通常作为废物丢弃，而从胎盘中提取干细胞进行保存，是宝贵的生命资源再生。
在分离出的胎盘干细胞中含有：胎盘间充质干细胞、胎盘亚全能干细胞和胎盘造血干细胞三类干细胞。新生儿降生之时，一般可通过三种渠道获得干细胞：第一种为脐带内血液源采集造血干细胞；第二种为脐带自身内采集脐带源间充质干细胞；第三种为胎盘源采集胎盘干细胞。胎盘干细胞在临床应用前景中，存在举足轻重的作用。在自体器官修复、克隆移植，美容，遗传类疾病治疗，及心脏病、肝病、糖尿病等领域具有无限前景。
干细胞提取物一般是指干细胞培养液的上清液或细胞裂解液。其细胞培养液上清液含有大量的具有多种生物活性的蛋白质、多肽及细胞因子，它们参与细胞结构的维持运动信息交流以及组织修复与再生，具有较好的抗光老化、抗氧化、抗皱、美白肌肤、伤口愈合、细胞修复等功效。因此，随着干细胞提取物的应用价值越来越受到人们的关注，如何获得大量的，质量稳定可控的干细胞提取物成为人们致力研究的问题。
鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法。
本发明的第二目的在于提供该冻干粉的应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明涉及一种人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)采集健康的胎盘，进行提取和分离后得到胎盘干细胞；
(2)对所述胎盘干细胞进行传代培养，分离得到胎盘干细胞提取物；
(3)将所述胎盘干细胞提取物与冻干保护剂混合后，冷冻干燥得到胎盘干细胞提取物冻干粉。
优选地，步骤(1)中，在无菌条件下，将健康的胎盘剪碎至1～3mm3的块体，用含有双抗的磷酸盐缓冲溶液冲洗后，接种于含有双抗的无血清培养基中进行培养，待细胞密度为80％～90％时，即得到原代胎盘干细胞。
优选地，步骤(1)中，对胎盘进行以下处理：
(i)将所述胎盘加入到含有0.1％～0.3％的胰蛋白酶和0.01％～0.03％edta的溶液中，在37℃下处理0.5～1.5h；
(ii)将所述胎盘取出后，剪碎至1～3mm3的块体，并用含有双抗的磷酸盐缓冲溶液冲洗；
(iii)将胎盘块体加入到含有1～2g/l胶原酶ⅱ、0.04～0.05g/ldnaseⅰ和8％～10％胎牛血清的dmem消化液的溶液中，在37℃下处理1～3h；
(iiii)对步骤(iii)得到的液体离心后，弃去上层清液得到培养物，然后接种于含有双抗的无血清培养基中进行培养。
优选地，所述双抗为青霉素和链霉素，所述磷酸盐缓冲液为pbs缓冲液。
优选地，青霉素在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为100u/ml，链霉素的浓度为0.1mg/ml。
优选地，步骤(2)中，对所述胎盘干细胞进行传代培养，收集第3～18代的细胞培养上清液，即为胎盘干细胞提取物。
优选地，步骤(3)中，将所述胎盘干细胞提取物与冻干保护剂混合均匀后，用孔径为0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，然后冷冻干燥，得到胎盘干细胞提取物冻干粉。
优选地，所述冻干保护剂为海藻糖和/或牛血清白蛋白，其在所述胎盘干细胞提取物冻干粉中的质量百分含量为5％～10％。优选所述冻干保护剂中，海藻糖与牛血清白蛋白的质量比为(5～10)：1。
优选地，所述冷冻干燥的操作过程为：在-80℃下预冻10～15h，然后在-30℃下保温1～2h，接着在-5℃，真空度为1.0×10-2～1.5×10-2mbar条件下冻干10～15h。
本发明还涉及一种人胎盘干细胞提取物冻干粉，其通过上述方法制备得到。
本发明还涉及所述冻干粉的应用，所述冻干粉用于创伤修复、皮肤护理和皮肤再生。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，该方法采用海藻糖或牛血清白蛋白作为冻干保护剂，得到的冻干粉具有良好的外观性状。其溶解性较好，动物实验证明其刺激性小，安全性高，使用可靠，并具有较好的生物活性，可用于创伤修复、皮肤护理和皮肤再生。该制备方法操作简单有效，能够实现人胎盘干细胞提取物冻干粉的产业化利用。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅为本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
本发明实施例涉及一种人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)采集健康的胎盘，进行提取和分离后得到胎盘干细胞；
(2)对胎盘干细胞进行传代培养，分离得到胎盘干细胞提取物；
(3)将胎盘干细胞提取物与冻干保护剂混合后，冷冻干燥得到胎盘干细胞提取物冻干粉。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，在无菌条件下，将健康的人胎盘剪碎至1～3mm3的块体，用含有双抗的磷酸盐缓冲溶液冲洗后，接种于含有双抗的无血清培养基中进行培养，待细胞密度为80％～90％时，即得到原代胎盘干细胞。
在本发明的一个实施例中，双抗为青霉素和链霉素。磷酸盐缓冲液为pbs缓冲液，其ph值为7.2～7.4，含有nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po42mmol/l。青霉素在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为100u/ml，链霉素的浓度为0.1mg/ml。
在本发明的一个具体实施例中，步骤(1)中，在无菌条件下，挑取新鲜健康的胎盘，剪碎至1～3mm3的块体，用含有双抗的磷酸盐缓冲溶液反复冲洗3～5次；接着用无菌的眼科镊子夹取胎盘，接种于含有双抗的无血清培养基中，在37℃，5％co2的条件下进行培养。每隔2-3天更换新鲜的培养基，待细胞密度为80％～90％时，即得到原代胎盘干细胞。
在本发明的一个具体实施例中，由于胎盘含有大量的肌肉和脂肪组织，为了使干细胞更好地溶出，需要将胎盘剪碎后，采用消化液对其进行处理。具体步骤如下：
(i)将胎盘加入到含有0.1％～0.3％的胰蛋白酶和0.01％～0.03％edta的溶液中，在37℃下处理0.5～1.5h；
(ii)将胎盘取出后，剪碎至1～3mm3的块体，并用含有双抗的磷酸盐缓冲溶液冲洗；
(iii)将胎盘块体加入到含有1～2g/l胶原酶ⅱ、0.04～0.05g/ldnaseⅰ和8％～10％胎牛血清的溶液中，在37℃下处理1～3h；
(iiii)对步骤(iii)得到的液体离心后，弃去上层清液得到培养物，然后接种于含有双抗的无血清培养基中进行培养。
在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，对胎盘干细胞进行传代培养，收集第3～18代的细胞培养上清液，即为胎盘干细胞提取物。
在本发明的一个具体实施例中，步骤(2)中，将获得的原代胎盘干细胞以0.1×105～1.0×105个细胞/cm2的密度接种于细胞培养皿中，加入新鲜的含有双抗的无血清培养基，在37℃，5％co2的条件下进行培养。至培养得到第3～18代的细胞时，将含有胎盘干细胞的培养基加水配成悬液，转移至离心管中，以800～1000转/分钟的速度离心3～6分钟。离心结束后取上清液，得到胎盘干细胞提取物。
在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，将胎盘干细胞提取物与冻干保护剂混合均匀后，用孔径为0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，然后冷冻干燥，得到胎盘干细胞提取物冻干粉。
在本发明的一个实施例中，冻干保护剂为海藻糖和/或牛血清白蛋白(bsa)，其在胎盘干细胞提取物冻干粉中的质量百分含量为5％～10％。
其中，海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等。是一种安全、可靠的天然糖类。海藻糖是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用。可以替代血浆蛋白，作为血液制品、疫苗、淋巴细胞、细胞组织等生物活性物质的稳定剂。牛血清白蛋白是牛血清中的一种白蛋白，能够对酶等生物活性物质起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性。由于海藻糖的价格远低于牛血清白蛋白，优选两者的质量比为(5～10)：1，能够保证胎盘干细胞提取物冻干粉具有较好的生物活性。
在本发明的一个实施例中，冷冻干燥的操作过程为：在-80℃下预冻10～15h，然后在-30℃下保温1～2h，接着在-5℃，真空度为1.0×10-2～1.5×10-2mbar条件下冻干10～15h。
在本发明的一个具体实施例中，冷冻干燥的操作过程为：先在-80℃下的超低温冰箱中预冻10～15h，优选12h，然后置于真空冷冻干燥机中，在-30℃下保温1～2h，接着在-5℃，真空度为1.0×10-2～1.5×10-2mbar条件下冻干10～15h，保持真空度，在20℃继续冻干2～4h，即得。
本发明实施例还涉及一种人胎盘干细胞提取物冻干粉，其通过上述方法制备得到。
本发明实施例还涉及冻干粉的应用，冻干粉用于创伤修复、皮肤护理和皮肤再生。例如，可以将该冻干粉配成无菌水溶液，涂抹在皮肤表面，即可促进涂抹区域的皮肤细胞再生。
实施例1
通过以下方法，制备人胎盘干细胞提取物冻干粉：
(1)在无菌条件下，将健康的胎盘剪碎至1～3mm3的块体，用含有双抗的磷酸盐缓冲溶液反复冲洗5次；接着用无菌的眼科镊子夹取胎盘，接种于含有双抗的无血清培养基中，在37℃，5％co2的条件下进行培养。每隔2-3天更换新鲜的培养基，待细胞密度为90％时，即得到原代胎盘干细胞。
(2)将获得的原代胎盘干细胞以0.1×105～1.0×105个细胞/cm2的密度接种于细胞培养皿中，加入新鲜的含有双抗的无血清培养基，在37℃，5％co2的条件下进行培养。至培养得到第10代的细胞时，将含有胎盘干细胞的培养基加水配成悬液，转移至离心管中，以1000转/分钟的速度离心5分钟。离心结束后取上清液，得到胎盘干细胞提取物。
(3)将胎盘干细胞提取物与冻干保护剂混合均匀后，用孔径为0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，然后依次在-80℃下预冻10～15h，-30℃下保温1～2h，接着在-5℃，真空度为1.0×10-2～1.5×10-2mbar条件下冻干10～15h，保持真空度，在20℃继续冻干2～4h，得到胎盘干细胞提取物冻干粉。冻干保护剂在胎盘干细胞提取物冻干粉中的质量百分含量为5％。
冻干保护剂的具体种类和用量见表1。
取上述制备得到的人胎盘干细胞提取物冻干粉50μg，加入1ml无菌水振荡溶解，冻干粉外观和溶解状态见表1。
表1
由表1可知，冻干保护剂采用单一bsa或海藻糖与bsa的质量比为(5～10)：1时，得到的胎盘干细胞提取物冻干粉具有良好的外观性状和溶解性。当海藻糖用量超出这一范围时，溶解性能下降。
实施例2
通过以下方法，制备人胎盘干细胞提取物冻干粉：
(1)采集健康的胎盘，进行提取和分离后得到胎盘干细胞；
(i)将胎盘加入到含有0.1％～0.3％的胰蛋白酶和0.01％～0.03％edta的溶液中，在37℃下处理0.5～1.5h；
(ii)将胎盘取出后，剪碎至1～3mm3的块体，并用含有双抗的磷酸盐缓冲溶液冲洗；
(iii)将胎盘块体加入到含有1～2g/l胶原酶ⅱ、0.04～0.05g/ldnaseⅰ和8％～10％胎牛血清的溶液中，在37℃下处理1～3h；
(iiii)对步骤(iii)得到的液体离心后，弃去上层清液得到培养物，将其接种于含有双抗的无血清培养基中，在37℃，5％co2的条件下进行培养。每隔2-3天更换新鲜的培养基，待细胞密度为90％时，即得到原代胎盘干细胞。
步骤(2)～(3)同实施例1-3。
安全性评价
(1)小鼠口服人胎盘干细胞提取物冻干粉的急性毒性试验
取10只昆明小鼠(雌雄各半，平均体重为24g)，给小鼠一次灌胃给予实施例1-1至1-7、实施例2制得的冻干粉10倍标示浓度的药量，观察其毒性反应。结果显示，小鼠没有出现任何不良反应，没有动物出现死亡，表明本发明制得的胎盘干细胞提取物冻干粉安全性高。
(2)兔子涂抹人胎盘干细胞提取物冻干粉的皮肤刺激性试验
取10只大耳白兔(雌雄各半，平均体重2kg)，实验前24h用脱毛剂对用药区(背部两侧)进行脱毛处理，去毛范围左右各3cm×3cm。将兔子背部左侧定位为对照区，右侧定位为试验区，对照区给予生理盐水0.5ml，试验区给予实施例1-1至1-7、实施例2制得的胎盘干细胞提取物冻干粉用生理盐水溶解后的溶液0.5ml，加纱布覆盖保护，用胶布固定。
24h后擦除受试物，温水洗净，观察30min，2h，6h，12h涂敷部位有无红斑和水肿情况。结果显示，试验区和对照区均无出现红斑和水肿情况，表明本发明制得的胎盘干细胞提取物冻干粉对皮肤刺激性小。
(3)裸鼠涂抹人胎盘干细胞提取物冻干粉的皮肤胶原合成实验
取6周龄的balb/c裸鼠40只，雌雄各半。分为实施例组、海藻糖组、和bsa组，每组10只。分别在各组裸鼠背部皮肤的右半边涂抹实施例得到的胎盘干细胞提取物冻干粉的生理盐水溶液，左半边的背部皮肤则涂上生理盐水作为对照。每次涂抹200μl，3次/天，6周后使用专门的皮肤弹性(含水量)测试仪来测量裸鼠背部皮肤的弹性和含水量。根据皮肤在短时间内恢复的状况来评定弹性的大小，弹性值1为最大，即皮肤100％恢复原状。实验结束后处死裸鼠，剥离裸鼠背部的皮肤组织，左右侧各取0.1g，采用rt-pcr检测组织中的ⅰ型胶原和ⅲ型胶原转录水平。结果见表2和表3。
表2人胎盘干细胞提取物冻干粉对裸鼠皮肤弹性和水分的影响
表3人胎盘干细胞提取物冻干粉对裸鼠皮肤胶原蛋白转录水平的影响
表2和表3说明，人胎盘干细胞提取物冻干粉中含有生物活性因子，可显著提高裸鼠皮肤弹性和水分含量，并促进裸鼠皮肤ⅰ型胶原蛋白和ⅲ型胶原蛋白合成，提高皮肤中胶原蛋白的含量。而以单一海藻糖或bsa对皮肤的改善作用有限。如果对胎盘先进行消化后再提取干细胞，对皮肤的提升作用进一步增强。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。