法舒地尔在治疗急性CVB3病毒性心肌炎的药物中的应用及试剂盒应用的制作方法

本发明涉及医药领域，特别是法舒地尔在治疗急性柯萨奇b3病毒性心肌炎的药物中的应用及在rho激酶抑制剂中的应用。

背景技术：

病毒性心肌炎(viralmyocarditis，vmc)多由柯萨奇b3病毒(coxsackievirusb3，cvb3)感染引起，病毒在心肌细胞内大量复制不但引起直接损伤，还刺激免疫细胞产生多种细胞因子介导了免疫损伤。传统认为th1/th2细胞比例失衡可能是影响病毒性心肌炎疾病进展和结局的因素之一。近年来发现，由17型t辅助细胞(th17细胞)产生的白细胞介素-17(il-17)在心肌炎的急性和慢性病毒感染阶段均明显增多，提示在病毒性心肌炎发病过程中，il-17作为重要的促炎细胞因子也参与了炎症反应。

虽然对本病的逐渐认识提高使得多种治疗方法不断涌现，但急性病毒性心肌炎目前尚无有效治疗手段。法舒地尔(fasudil)是目前唯一被批准用于临床的rho激酶(rhoassociatedkinases，rock)抑制剂，在防治蛛网膜下腔出血后的脑血管痉挛方面早已经被证实安全有效。而在心血管疾病方面，大量研究表明，法舒地尔可通过阻断rhoa/rock信号通路，与多种细胞因子、炎症因子及血管活性因子相互作用，对心肌肥大、心衰、冠脉痉挛、心绞痛、心肌梗死等疾病的治疗也有着广阔的应用前景。然而，法舒地尔对cvb3感染后的急性病毒性心肌炎有何影响，国内外罕见报道。

技术实现要素：

本发明发明目的：本发明提供法舒地尔在治疗急性柯萨奇b3病毒性心肌炎的药物中的应用，以抑制rhoa/rock信号通路、抑制rho激酶，达到抑制cvb复制和il-17的表达，从而对cvb3所致的急性病毒性心肌炎小鼠产生保护作用，减轻心肌病理性损伤。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

法舒地尔在治疗急性柯萨奇b3病毒性心肌炎的药物中的应用。

法舒地尔抑制病毒性心肌炎的炎症因子表达的试剂盒应用。

本发明表明法舒地尔可抑制rhoa/rock信号通路，在rhoa/rock信号通路抑制后，rho激酶得到抑制和vbc3病毒的复制减少，可减少炎性细胞因子il-17的表达，对cvb3所致的急性病毒性心肌炎小鼠产生保护作用，为急性病毒性心肌炎的治疗开辟新的思路。

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

附图说明

图1为本发明实施例中各组小鼠生存情况比较图；

图2a-control为本发明实施例中第7天与14天正常对照组小鼠心肌病理组织学变化图；

图2a-placebo为本发明实施例中第7天与14天病毒性心肌炎组小鼠心肌病理组织学变化图；

图2a-fasudil为本发明实施例中第7天与14天法舒地尔治疗组小鼠心肌病理组织学变化图；

图2b为本发明实施中第7天与14天中fasudil治疗组和安慰剂组的心肌坏死组织面积的量化对比图；

图2c为本发明实施中第7天与14天中fasudil治疗组和安慰剂组的炎症细胞侵润心肌组织的量化对比图；

图3为本发明实施例中第7天与14天各组小鼠心肌组织cvb3mrna相对表达量比较图；

图4a为为本发明实施中第7天与14天中各组小鼠心肌细胞组织中rock2、il-17和β-actin的pcr结果图；

图4b为本发明实施例中第7天与14天各组小鼠心肌组织rock2mrna相对表达量比较图；

图4c为本发明实施例中第7天与14天各组小鼠心肌组织il-17mrna相对表达量比较图；

图5a为本发明实施例中第7天与14天各组小鼠心肌组织rock2、il-17和β-actin蛋白免疫印迹图；

图5b为本发明实施例中第7天与14天各组小鼠心肌组织il-17蛋白含量比较图；

图5c为本发明实施例中第7天与14天各组小鼠心肌组织rock2蛋白含量比较图；

图6a为本发明实施例中第7天与14天各组小鼠心肌组织中elisa定量的il-17浓度比较图；

图6b为本发明实施例中第7天与14天各组小鼠血清中elisa定量的il-17浓度比较图。

具体实施方式

在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。

实验动物、细胞和病毒株：4周龄spf级雄性balb/c小鼠90只，体重(16.3±1.3)克。柯萨奇病毒b3(cvb3nancy株)购自美国atcc公司。病毒经hep2细胞(上海生化细胞所)活化增殖，滴度为10⁷/0.1ml(tcid50)。

主要药品与试剂：盐酸法舒地尔(fasudilhydrochloride商品名：川威，分子式：c14h17n3o2s·cl，国药准字h20040356，批号1606241，规格：2ml：30mg)产自天津红日药业，trizol总rna提取液和pvdf膜(美国invitrogen公司)，逆转录和常规pcr试剂盒(赛默飞上海公司)，兔抗小鼠il-17单克隆抗体、兔抗小鼠rock2抗体(美国santacruz公司)，il-17elisa试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)，测量灵敏度为15pg/ml。

动物模型制备：采用双盲法将上述小鼠随机分设正常对照组(control组)，病毒性心肌炎加安慰剂组(placebo组)和病毒性心肌炎法舒地尔治疗组(fasudil组)各30只。接种病毒日设为第0天，正常对照组经腹腔注射不含病毒的dmem病毒培养液，后2组经腹腔注射cvb3病毒液(10⁵病毒/0.1ml生理盐水)。在接种病毒次日起，法舒地尔治疗组每日10mg/kg腹腔注射，其余两组每日腹腔注射等量生理盐水对照至第14天。分别于第7、14天从各组随机抽取8只小鼠取血和心脏标本，称重后计算心脏体重比值，将心脏沿中线切为两半，一半经10％甲醛固定后行病理组织学检查，另一半液氮速冻后保存在-80℃冰箱备用，做rt-pcr和蛋白质印迹法检测。另设上述三组小鼠各20只专门用于记录各组小鼠死亡数并计算生存率。

心脏重量(hw)/身体重量(bw)：分别计算第7、14天小鼠的hw/bw比值。

病理组织学检查：将10％福尔马林固定的心脏做厚约4μm常规石蜡切片和he染色，每张切片取5个视野，光镜下观察心肌组织病理改变，病变积分由2人分别判断后取平均值。具体评判标准参照rezkalla方法计为：无病变为0分；病变如炎症细胞浸润、心肌坏死范围占每张心脏切片视野面积≤25％为1分；＞25％～50％为2分；＞50％～75％为3分；＞75％为4分。

逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)检测小鼠心肌cvb3、rock2和il17的mrna的表达：取心肌组织剪碎匀浆，采用trizol一步法抽提心肌总rna，测od260/od280的比值，评估rna质量。取总rna2μg，逆转录合成cdna。扩增后取10μlpcr产物，行2％琼脂糖凝胶电泳后经凝胶成像系统分析处理，实验结果的分析使用imagej处理得到各条带的灰度值，以β-actin作为内参照，计算cvb3、rock2和il-17的mrna的相对表达水平。各引物序列见表1。pcr反应条件：预变性95℃3min，变性95℃30s，退火(具体温度见表1)30s，延伸72℃60s，循环次数见表1，72℃终末延伸5min后终止反应。

表1：

蛋白质印迹法测定心肌il-17、rock2蛋白相对含量：将心肌组织研磨匀浆后提取总蛋白，进行蛋白质定量，sds-page胶电泳后、转移至pvdf膜、一抗封闭分别加入1∶500il-17一抗、1∶500rock2一抗及1∶2500β-actin一抗4℃孵育过夜，二抗(1∶5000)室温孵育1小时，ecl化学发光试剂盒显色，暗室曝光，最后经ccd图像分析系统处理，以β-actin作为内参照，计算il-17及rock2蛋白相对量。

双抗体夹心elisa法检测血清il-17a浓度：心肌组织或血液样本离心后提取上清液，采用双抗体夹心elisa法测定各组小鼠血清il-17浓度，所有操作严格按试剂盒说明书由专人进行。

统计学方法：计量数据以均数±标准差表示，应用graphpadprism6.0版和spss19.0版软件进行统计分析，死亡曲线图行正态性检验和方差齐性检验，若方差齐，采用单因素方差分析检验进行各组间均数比较，两两比较采用lsd-t检验。若方差不齐则采用秩和检验。其他数据采用two-wayanova分析，p＜0.05为差异具有统计学意义。

实验结果：1.法舒地尔对病毒性心肌炎小鼠一般情况、死亡率及hw/bw的影响：正常对照组小鼠精神状态、饮食、活动均正常，病毒性心肌炎组小鼠从第2-3天开始陆续出现进食减少、少动、拱背、精神淡漠、易激惹、相互撕咬等症状，于第4天开始死亡。法舒地尔治疗组小鼠则上述症状明显减轻。对照组无死亡，病毒性心肌炎组、法舒地尔治疗组生存率分别为60％(12/20)、80％(16/20)，法舒地尔治疗组死亡率较病毒性心肌炎组显著降低(如图1所示，法舒地尔治疗组小鼠生存率明显高于病毒性心肌炎组)。此外，第7天与第14天病毒性心肌炎组hw/bw较对照组增加(p＜0.05)，而与病毒性心肌炎组比较，法舒地尔治疗组hw/bw降低(表2)。

2.法舒地尔对病毒性心肌炎小鼠心肌病理改变的影响：正常对照组心肌未发现任何病理改变，第7天与第14天法舒地尔治疗组心肌切片显示的灶性坏死、炎症细胞浸润比病毒性心肌炎组减轻(如图2a所示为第7天与14天各组小鼠心肌病理组织学变化(苏木素-伊红染色，×200)。与病毒性心肌炎组比较，法舒地尔组心肌切片病理积分明显减少，有显著性差异(图2b和表2)。

表2第7和14天各组小鼠hw/bw比值与心肌组织病理学评分比较(n＝8)

注：hw：heartweight，bw：bodyweight。a，与同一时间点的正常对照组比较，p＜0.05；b，与同一时间点的病毒性心肌炎组比较，p＜0.05。

3.法舒地尔减少病毒性心肌炎小鼠心肌组织cvb3、rock2和il17mrna的表达：病毒性心肌炎组第14天的cvb3mrna相对表达量低于第7天的cvb3mrna相对表达量(a，p＜0.0001)，法舒地尔干预后可明显抑制第7、14天病毒mrna的表达(如图3所示，其中control：正常对照组，placebo：病毒性心肌炎安慰剂组，fasudil：法舒地尔治疗组。b，fasudil组第7天与14天比较，p＜0.0001)。cvb3病毒感染后第7，14天，小鼠心肌组织rock2和il-17mrna表达较正常对照组均明显增高，其中，第7天测得rock2mrna水平高于第14天，而il-17mrna表达水平在第14天时明显高于第7天。而法舒地尔治疗后使得第7，14天心肌组织rock2和il-17mrna水平比病毒性心肌炎组均明显降低(如图4所示，a，placebo组于不同时间点的比较，p＜0.0001；b，fasudil组于不同时间点的比较，p＜0.05)。

4.法舒地尔减少病毒性心肌炎小鼠心肌组织rock2、il-17蛋白含量和外周血il-17的浓度：分别用蛋白质印迹法测定各组小鼠心肌组织中的rock2、il-17蛋白含量(如图5所示，a，placebo组于不同时间点的比较，p＜0.05；b，fasudil组于不同时间点的比较，p＜0.05)，用elisa法测定心肌组织和血清il-17浓度(如图6所示，a，placebo组于不同时间点的比较，p＜0.0001；b，fasudil组于不同时间点的比较，p＜0.0001；c，第14天对照组与fasudil组比较，p＜0.0001)。结果显示第7天和第14天，病毒性心肌炎组小鼠心肌组织rock2、il-17蛋白含量和血清il-17的浓度均高于正常对照组，法舒地尔治疗后病毒性心肌炎小鼠心肌组织rock2、il-17蛋白含量和血清il-17a浓度明显低于病毒性心肌炎组。

本发明公开的研究表明，急性病毒感染后小鼠心肌rock2mrna和蛋白含量表达均有升高，提示cvb3病毒感染激活了rho激酶，而应用法舒地尔抑制rhoa/rock信号通路后，病毒性心肌炎小鼠的cvb3病毒复制减少，心肌病理损伤减轻，生存率提高。这些结果提示，rhoa/rock信号通路在急性病毒性心肌炎发病机制中发挥着重要作用。而法舒地尔通过抑制rhoa/rock信号通路，可减少炎性细胞因子il-17的表达，而th17细胞及其分泌的il-17被证明是加重cvb3感染后心肌炎发展的一大关键，il-17不但促进病毒性心肌炎小鼠巨噬细胞分泌il-1β及tnf-α加重心肌损伤，还能抑制淋巴细胞分泌ifn-γ，而后者是公认的能抑制病毒复制的细胞因子。此外，il-17还可抑制cd8+t细胞来促进病毒的复制，反之，应用抗体中和il-17能减少病毒性心肌炎小鼠病毒复制及心肌损伤。本发明公开首次证实在cvb3导致的急性病毒性心肌炎模型中，法舒地尔治疗后同样能抑制il-17的表达，提示法舒地尔抑制cvb3病毒复制和减轻心肌病理损伤在部分程度上可能与减少il-17的表达有关。法舒地尔对cvb3诱发的急性病毒性心肌炎小鼠具有一定保护作用，这为急性病毒性心肌炎的治疗开辟新的思路。