芒柄花素与氟尿嘧啶的组合在制备抗肿瘤药物中的用途的制作方法

本发明涉及基于芒柄花素与氟尿嘧啶的协同效应的一种组合在制备抗肿瘤药物中的用途。本发明还涉及基于芒柄花素与氟尿嘧啶的协同效应的一种肿瘤治疗药物。

背景技术：

芒柄花素(formononetin)是一种异黄酮类黄酮，广泛分布于黄芪、苦参、甘草、葛根等豆科植物中,具有抗肿瘤、清除自由基、降脂和改善雌激素水平等药理活性。关于芒柄花素与其他药物的协同作用，阮善明等报道了芒柄花素可基于内质网应激途径逆转人结肠癌细胞hct-8/5-fu耐药(见：阮善明.刺芒柄花素基于内质网应激途径逆转人结肠癌细胞hct-8/5-fu耐药.浙江省中医药学会、浙江省抗癌协会、浙江省中医院.2013年浙江省中医药学会肿瘤分会、浙江省抗癌协会中医肿瘤专委会学术年会暨省级继续教育学习班文集.浙江省中医药学会、浙江省抗癌协会、浙江省中医院:,2013:9.)。但并未提及其与5-fu(氟尿嘧啶)联用的情况，也未提及其与5-fu的协同作用评价情况。

氟尿嘧啶(5-fu)是一种临床常用的抗肿瘤药物。临床常用于治疗结肠癌、直肠癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈部鳞癌、皮肤癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、肺癌等。5-fu临床使用中常有需要增加给药剂量，才能达到治疗效果，而该药常见的恶心、食欲减退和呕吐，以及白细胞减少、免疫力下降等毒副作用，在增加剂量时尤其显著，从而在一定程度上影响患者耐受和临床用药，因此，找到对5-fu具有显著的增效减毒药物组合具有重要意义。

芒柄花素

英文名：formononetin

别名：刺芒柄花素,芒柄花黄素,7-羟基-3-(4-甲氧基苯基)色酮；

7-hydroxy-4'-methoxyisoflavone；

7-hydroxy-3-(4-methoxyphenyl)chromen-4-one；

7-hydroxy-3-(4-methoxyphenyl)chromone；dadein4'-methylether

cas号：485-72-3

分子式：c16h12o4

分子量：268.27

化合物种类：flavonoids黄酮类

结构式：

氟尿嘧啶

化学名:5-氟-2,4(1h,3h)-嘧啶二酮

名称：氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶

别名：2,4-二羟基-5-氟嘧啶；5-氟-2,4(1h,3h)-嘧啶二酮

英文名称：5-fluorouracil

英文别名：5-fu；5-fu；2,4-dihydroxy-5-fluoropyrimidine；5-fluoro-2,4(1h,3h)-pyrimidinedione

cas号：51-21-8

分子式：c4h3fn2o2

分子量：130.08

结构式：

bliss协同作用的计算描述

bliss独立模型假设两个药物发挥作用是通过不同途径，作用于不同的靶标或者系统，bliss独立模型又被称作效应倍增模型(参见：fitzgeraldjb,schoeberlb,nielsenub,etal.systemsbiologyandcombinationtherapyinthequestforclinicalefficacy.naturechemicalbiology,2006,2(9):458.)。

bliss独立模型的协同作用计算公式如下(参见：blissci:thecalculationofmicrobialassays.bacteriolrev.1956,20:243-258)：

e(a,b)＝ea+eb-ea×eb(1)

这里ea，eb,e(a,b)分别表示两种药物独立的作用效果以及联合作用时的作用效果，取值均在0-1之间。两个药物的联合作用效果强于e(a,b)时，则认为这两个药物存在协同作用。

技术实现要素：

本发明人通过体外和体内抗肿瘤实验研究、bliss协同作用分析发现芒柄花素能够显著增强5-fu的抗肿瘤效果。

根据本发明的一个方面，提供了一种组合在制备抗肿瘤药物中的用途，所述组合含有：

芒柄花素，及

氟尿嘧啶。

根据本发明的另一个方面，提供了一种治疗肿瘤的药物，其特征在于所述药物的有效成分为一种组合，所述组合含有：

芒柄花素及氟尿嘧啶，二者的比例在5:8～5:1之间。

附图说明

图1显示了本发明进行的芒柄花素和5-fu联合应用对小鼠结肠癌c26的生长抑制作用的实验结果和对应的给药。

图2显示了依据本发明的实施例的数据对芒柄花素与氟尿嘧啶(5-fu)的协同作用进行bliss分析的结果。

具体实施方式

本发明人通过对于中药所含的大量化学成分与多种临床常用抗肿瘤药物的协同作用进行量化模型预测，发现芒柄花素与5-fu(氟尿嘧啶)可能存在显著超过两药加和作用的协同作用。

进而，本发明人对5-fu(氟尿嘧啶)与芒柄花素的协同作用进行了系统而深入的研究，发现5-fu与芒柄花素在治疗结肠癌等肿瘤上确实具有显著的协同作用。

本发明人用bliss独立模型方法来衡量芒柄花素与5-fu联用的协同作用。在给定的剂量下，利用芒柄花素和5-fu单独作用的药效计算出bliss协同作用分数，并和芒柄花素与5-fu联用后的实测药效进行比较，分别绘制出两个成分联用后实验实测抑制率和bliss模型计算的协同抑制率曲线。结果表明芒柄花素与5-fu联用的效果显著超过二药单独作用的加和效果，体现出明显的协同作用。

基于这种发现，作为本发明的一个方面，本发明人提出了一种组合在制备抗肿瘤药物中的用途，所述组合物含有：

芒柄花素及

氟尿嘧啶。

作为本发明的一个进一步的方面，上述组合物含有：

芒柄花素，及氟尿嘧啶的比例在5:8～5:1之间。

同时，基于上述发现，作为本发明的另一个方面，本发明人提出了一种治疗肿瘤的药物，所述药物的有效成分含有一种组合，所述组合为芒柄花素及氟尿嘧啶的组合，所述组合芒柄花素及氟尿嘧啶的比例在5:8～5:1之间。

实施例一

体外细胞实验发现芒柄花素可以增强5-fu对肿瘤细胞的生长抑制作用

本发明人采用细胞实验，发现芒柄花素能够增强5-fu对体外培养的肿瘤细胞的生长抑制作用。

将对数生长期的细胞用0.25％胰蛋白酶消化后，吹打成一定浓度的单细胞悬液，用计数板计数，根据肿瘤细胞生长速度的差异，按每孔1500-5000个细胞接种于96孔板中，每孔加入细胞悬液100μl，放入孵箱中培养24小时。次日加入含不同浓度的待测化合物及相应溶剂对照新鲜培养基，每孔加入100μl(dmso终浓度<0.1％)，每种受试化合物设3-6个剂量组，每组设三个平行孔。于37℃，5％co2孵箱中继续培养120h后弃上清，每个孔加入100μl新鲜配制的含0.5mg·ml^-1mtt的无血清培养基。放入孵箱中继续培养4h，弃去上清，每孔加入200μldmso溶解mtt甲簪沉淀，置于微型振荡器振荡混匀后，用酶标仪在参考波长450nm，检测波长570nm条件下测定光密度值(od)，以溶剂作为对照处理的肿瘤细胞为对照组，按下列公式计算药物对肿瘤细胞的抑制率，并按中效方程计算ic50：

实验结果表明在体外培养的结肠癌细胞生长抑制作用的实验中，芒柄花素在所检测剂量下(对相应细胞株的生长抑制率<30.0％)，在结肠癌hct116细胞(表1)、hct15细胞(表2)、c26细胞(表3)中，与5-fu(氟尿嘧啶)联合使用后的ic50值均比单独使用5-fu的ic50明显降低，提示芒柄花素可在体外培养的结肠癌细胞中增强5-fu抑制细胞增殖的活性。

表1.芒柄花素与5-fu联合应用对体外培养的hct116细胞的生长抑制作用

表2.芒柄花素与5-fu联合应用对外培养的hct15细胞的生长抑制作用

表3.芒柄花素与5-fu联合应用对体外培养的c26细胞的生长抑制作用

实施例二

体内动物实验研究发现芒柄花素可增强5-fu对小鼠结肠癌c26的生长抑制作用

本发明人采用小鼠结肠癌c26模型，腹腔注射给予不同剂量的芒柄花素，并通过与5-fu联合用药观察芒柄花素对5-fu抑制肿瘤生长的增强作用。

小鼠结肠癌c26模型，选用的动物为balb/c小鼠，雌性，体重14.5-18g。实验时，取生长良好的肿瘤组织，剪碎，研磨，用无菌生理盐水按1:3比例稀释后制成肿瘤细胞悬液，每只小鼠腋背部接种0.2ml瘤液。接种后次日动物随机分组，称重，并开始给药。溶剂对照组按每20g小鼠腹腔注射0.2ml无菌生理盐水，每日1次，共12次。5-fu给药体积为每20g小鼠腹腔注射0.2ml,5-fu单用组及联合用药组均为接种后第一天给药1次，第4天，第7天各给药一次，共给药3次。芒柄花素给药体积为每20g小鼠腹腔注射0.2ml，每日给药1次，共给药11次。芒柄花素及5-fu联合用药组给予时间间隔为6h。

实验动物共分17组，分别为：未荷瘤的正常对照组，溶剂对照组、5-fu20.0mg/kg单用给药组、5-fu30.0mg/kg单用给药组、5-fu40.0mg/kg单用给药组、芒柄花素25.0mg/kg单用给药组、芒柄花素50.0mg/kg单用给药组、芒柄花素100.0mg/kg单用给药组、5-fu20.0mg/kg与芒柄花素25.0mg/kg联合用药组，5-fu20.0mg/kg与芒柄花素50.0mg/kg联合用药组，5-fu20.0mg/kg与芒柄花素100.0mg/kg联合用药组，5-fu30.0mg/kg与芒柄花素25.0mg/kg联合用药组，5-fu30.0mg/kg与芒柄花素50.0mg/kg联合用药组，5-fu30.0mg/kg与芒柄花素100.0mg/kg联合用药组，5-fu40.0mg/kg与芒柄花素25.0mg/kg联合用药组，5-fu40.0mg/kg与芒柄花素50.0mg/kg联合用药组，5-fu40.0mg/kg与芒柄花素100.0mg/kg联合用药。每组6-7只动物。

实验结束，取外周血，处死动物，称体重，剥取肿瘤组织并称重。根据重量计算肿瘤抑制率(％)。体重、瘤重用均值±标准差(_x±sd)表示，并进行各给药组与阴性对照组之间的t检验。

实验结果(见表4)表明芒柄花素在25.0mg/kg到100.0mg/kg剂量下，可以在荷瘤小鼠中，剂量依赖地显著升高5-fu(20.0mg/kg–40.0mg/kg)的抗肿瘤活性(见表4和图1)；提示芒柄花素可以明显增强5-fu的抑瘤作用。

表4.芒柄花素和5-fu联合应用对雌性小鼠结肠癌c26的生长抑制作用(*p<0.05，**p<0.01,***p<0.001，与溶剂对照组比较；δp<0.05,δδp<0.01,δδδp<0.001，与单独使用5-fu比较)

图1显示了本发明的芒柄花素和5-fu联合应用对小鼠结肠癌c26的生长抑制作用的实验结果和对应的给药组。图1上部的图片显示的是发明人进行的小鼠结肠癌c26的生长抑制作用的原始实验结果，图1中图片下方的表格列出了图片中各行实验结果的给药组别(每个单元格代表不同的组别)，分别对应于图片中的左、中、右三部分的各行实验结果。其中，图1中的表亦作为以下的表5被包括在本说明书中。

表5.图1上部的图片中左、中、右三个部分的各行实验结果分别对应的给药组别

对芒柄花素与5-fu协同作用的bliss分析

采用上述体内动物实验中芒柄花素和5-fu在给定剂量下单独使用的药效数据，计算bliss协同抑制率，并和芒柄花素与5-fu在对应剂量下联合使用的实测药效数据进行比较，结果如表6所示。同时，分别绘制出两个化合物联用后实验实测抑制率和bliss模型计算的协同抑制率曲线(如图2所示)。

利用bliss独立模型分析芒柄花素与5-fu的协同作用，结果发现在分别联合给予荷瘤小鼠5-fu20、30、40mg/kg的剂量和芒柄花素25、50、100mg/kg的剂量时，二者联合给药的实测抑瘤效果表现出显著超过bliss分数的协同作用，在芒柄花素剂量为50、100mg/kg时协同作用最为明显。分析结果显示芒柄花素显著增强了5-fu的抑瘤作用。

表6.芒柄花素与5-fu的bliss协同抑制率与实测抑制率

实施例三

芒柄花素与5-fu联合用药能通过改善免疫功能而体现对5-fu的增效减毒效果

采用mtt方法测定脾淋巴细胞转化实验：将上述实施例中各药物处理组荷瘤小鼠断颈椎处死后，无菌取出小鼠脾脏，以1ml无菌注射器将脾在研钵中磨碎，将细胞悬液移入塑料离心管；离心混匀后计数；调整细胞浓度到1×10⁷/ml，以100μl/孔加入96孔细胞培养板中(含cona3.0μg/ml，或者lps5.0μg/ml)。将96孔细胞培养板放入细胞培养箱，37℃，5％co2继续培养48小时。培养结束前4小时，以50ul/孔添加mtt稀释液(2mg/ml)，继续培养至48小时。停止细胞培养，离心(2000rpm，10min)使淋巴细胞沉淀，轻轻倾去细胞培养液，纸巾吸干。加入dmso，150ul/孔。充分振荡后，在检测波长570nm条件下测定光密度值(od)(bio-rad,usa)。

实验结果表明，单独给予芒柄花素的荷瘤小鼠脾淋巴细胞在有或者没有cona/lps刺激下，增殖能力均强于未给药组；当芒柄花素与5-fu联合使用时，在有或者没有cona/lps刺激下，荷瘤小鼠的脾淋巴细胞增殖能力显著增强(表7)，表明芒柄花素与5-fu联合用药时，对荷瘤小鼠的免疫功能有一定的调节和改善作用，体现出芒柄花素对5-fu具有增效减毒的效果。

表7.芒柄花素与5-fu联合用药对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖能力

总之，本发明人首先通过量化模型预测发现芒柄花素与5-fu(氟尿嘧啶)可能存在显著超过两药加和作用的协同作用。进而，采用体外肿瘤细胞生长抑制实验和动物体内抗肿瘤实验研究，发现芒柄花素能够增强5-fu抗肿瘤效果。bliss独立模型分析的结果表明，芒柄花素与5-fu联用的效果显著超过二药单独作用的加和效果，体现出明显的协同作用。而对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖能力的实验研究表明芒柄花素还能通过改善免疫而显示出对5-fu的增效减毒效果。

上述实施例证明，芒柄花素在与5-fu的给药剂量比例在25:40～100:20mg/kg之间，尤其是50:40～100:20mg/kg之间时可以显著增强5-fu抑制结肠癌肿瘤细胞生长的作用。所以将芒柄花素和5-fu依照5:8～5:1(尤其是依照5:4～5:1)的比例组合用于制备抗肿瘤药物，有望为肿瘤治疗提供一种新的选择。