帕布昔利布在黏膜恶性黑色素瘤中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体地，本发明涉及帕布昔利布(palbociclib)在治疗黏膜恶性黑色素瘤中的应用。

背景技术：

恶性黑色素瘤(melanoma)是一种起源于黑色素细胞的肿瘤，黑素瘤发病部位分为皮肤，肢端，黏膜等黑色素瘤，其遗传背景各不相同。在欧美白种人中，恶性黑色素瘤好发于皮肤，指端和黏膜恶性黑色素瘤相对较少见。其中皮肤恶性黑色素瘤常发生于慢性阳光损害或非慢性阳光性损害的躯干，四肢，腿等部位，是源于表皮正常黑素细胞或原有痣细胞的一种恶性肿瘤，常参差不齐呈锯齿状改变，不光滑且常粗糙而伴有鳞形或片状脱屑。有时有渗液或渗血，病灶可高出皮面，以brafv600e/v600k突变为主要特征，而肢端及黏膜恶性黑色素瘤好发于亚洲人群，病因不清，在皮肤恶黑中常见的brafv600e/v600k突变不是其主要遗传学改变。肢端黑色素瘤原发部位为足底、足趾、手指末端及甲下等部位，主要依靠手术治疗。黏膜恶性黑色素瘤部分起源于黏膜基底层黑色素细胞的恶性转化，其进展快，肿瘤细胞具有明显的向黏膜内浸润的特点，其颈部淋巴转移多见，主要治疗方法以手术结合化疗为主，但五年生存率仅20-25％。因此，不同部位的黑色素瘤具有不同的临床表型和生物学行为。

在过去几十年中，起源于皮肤的恶性黑色素瘤，在临床治疗中的巨大突破，皮肤恶性黑色素瘤的分子分型和靶向治疗(例如，brafv600e/v600k突变作为对维罗非尼反应良好的一种标志)取得了革命性的改变。然而对于东亚人群中最致命的黑色素瘤亚型-黏膜恶性黑色素瘤(mucosalmelanoma，mm)，目前临床的治疗手段和靶向药物仍然十分匮乏。mm病人的长期预后很差，五年生存率只有20％-25％。相较于驱动基因明确的皮肤恶性黑色素瘤，mm的分子致病机制尚未明确。事实上，临床上的靶向mm的药物极度匮乏，唯一与mm靶向治疗相关的基因是kit。临床上针对kit突变的黏膜恶性黑色素瘤最常用的靶向治疗药物即为伊马替尼，以及高剂量白介素2(il-2)作为转移性或不可切除黏膜恶性黑色素瘤的治疗选择。多项临床试验显示目前伊马替尼在治疗mm中存在耐药或用药后复发的现象，极大的限制了其临床的推广和应用。另外，多种细胞毒类化疗药物的应用，例如，达卡巴嗪，顺铂，紫杉醇等并不能很好地改善患者的五年生存率。因此，目前在东亚，尤其是中国人群中显著高发mm患者“无药可用”，本领域继续探寻能够有效治疗mm的靶向药物，这对于缓解mm患者病痛，提高其生存率具有重要临床意义。同时，新型靶向药物的临床转化应用将填补目前mm治疗中存在的巨大市场空白，具有巨大的商业价值和社会意义。

技术实现要素：

本发明提供了帕布昔利布的新用途，即在黏膜恶性黑色素瘤中的应用。

本发明第一方面，提供了一种帕布昔利布或其药学上可接受的盐的用途，用于制备治疗黏膜恶性黑色素瘤的药物组合物。

在另一优选例中，所述的帕布昔利布的药学上可接受的盐包括盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、磺酸盐、碳酸盐、醋酸盐、酒石酸盐、甲酸盐、乙酸盐或羟乙基磺酸盐。

在另一优选例中，所述药物组合物含有安全有效量的帕布昔利布，和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述药物组合物还含有肿瘤治疗剂。

在另一优选例中，所述肿瘤治疗剂针对恶性黑色素瘤，优选地，针对黏膜恶性黑色素瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤治疗剂包括伊马替尼(imatinib)、维罗非尼(vemurafenib)、达拉菲尼(dabrafenib)、瑞博西林(ribociclib)、玻玛西林(abemaciclib)。

在另一优选例中，所述肿瘤治疗剂是伊马替尼。

在另一优选例中，所述药物组合物含有帕布昔利布和伊马替尼。

在另一优选例中，所述药物组合物中的帕布昔利布和伊马替尼用量之比为0.5-1.5:0.5-1.5，优选地，为1:1。

在另一优选例中，所述的药物组合物为单元剂型。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括胃肠给药剂型或胃肠外给药剂型。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆、乳剂、悬浮剂、注射剂、贴剂、滴剂、膏剂、栓剂或喷雾剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物的施用方式包括口服、肌肉注射、静脉注射、静脉滴注、瘤内注射、灌肠、喷雾、外敷、或腹腔注射。

在另一优选例中，所述安全有效量指的是50-1000mg/kg。

在另一优选例中，所述的安全有效量包括50-200mg/kg(小鼠)，或500-1000mg/kg(人)。

在另一优选例中，所述的安全有效量为100-700mg/kg，更优选地为500-700mg/kg。

在另一优选例中，所述黏膜恶性黑色素瘤包括来源于上呼吸道的黏膜恶性黑色素瘤。

在另一优选例中，所述上呼吸道黏膜包括口腔、鼻咽、或口咽部位的黏膜。

在另一优选例中，所述的黏膜恶性黑色素瘤来源于口腔。

在另一优选例中，所述黏膜恶性黑色素瘤包括原位黏膜恶性黑色素瘤或侵润性黏膜恶性黑色素瘤。

在另一优选例中，所述黏膜恶性黑色素瘤包括多种病理分化评级阶段。

在另一优选例中，所述的黏膜恶性黑色素瘤的分化评级包括：无法评估的(gx)分化良好的(g1)，中度分化的(g2)，低分化的(g3)，和/或未分化的(g4)病理分级。

在另一优选例中，所述上呼吸道黏膜包括口腔、唇部、鼻咽或口咽部位的黏膜。

在另一优选例中，所述黏膜恶性黑色素瘤来源于人。

本发明第二方面，提供了一种体外非治疗性抑制黏膜恶性黑色素瘤的方法，包括步骤：向含有黏膜恶性黑色素瘤的细胞培养体系中加入帕布昔利布或其药学上可接受的盐或含有其的药物组合物，从而抑制黏膜恶性黑色素瘤细胞。

在另一优选例中，所述帕布昔利布的浓度为0.001μm-1000μm，优选地为0.1um-100μm。

本发明第三方面，提供了一种治疗黏膜恶性黑色素瘤的方法，包括步骤：向需要的对象施用安全有效量的帕布昔利布或含有其的药物组合物，从而治疗黏膜恶性黑色素瘤。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了在施用了帕布昔利布之后，来源于上呼吸道黏膜恶性(图1a：硬腭，图1b：牙龈，图1c：颊黏膜，图1d：口咽；图1e、f：鼻咽)黑色素瘤的小鼠体内抑制效果。

图2显示了帕布昔利布、伊马替尼单独和联合用药与对照的肿瘤抑制比较结果，其中帕布昔利布效果显著优于伊马替尼，而联合用药具有显著的协同效果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，用于治疗乳腺癌晚期的新药帕布昔利布对于黏膜恶性黑色素瘤具有非常有效的肿瘤抑制效果，且该效果与其已知的靶点功能(如cdk4/6)并不相关。经过大量肿瘤抑制剂候选化合物的筛选以及对来源于黏膜恶性黑色素瘤的移植瘤小鼠模型的交叉验证，帕布昔利布可以对多部位来源的黏膜恶性黑色素瘤均具有显著的肿瘤抑制效果，小鼠肿瘤模型中肿瘤的体积显著减小。由此，帕布昔利布可以作为黏膜恶性黑色素瘤治疗的一个有力突破口，打破目前尚无特效治疗剂的瓶颈。而作为已上市药物，帕布昔利布易于获得且制备工艺成熟，可基于此进行多种适合制剂的开发。在此基础上，完成了本发明。

帕布昔利布(palbociclib，cas：571190-30-2，也称帕博西尼)

帕布昔利布为2015年2月3日辉瑞公司获得fda批准的晚期(已转移)乳腺癌治疗剂，是首个被批准的细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(cdk4/6)抑制剂，化学名称：6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基氨基)吡啶[2,3-d]嘧啶7(8h)-酮。

帕布昔利布的合成可以根据现有技术中的方法获得，例如wo1998033798a2。

可用于本发明的帕布昔利布包括帕布昔利布化合物本身或其衍生物，所述的衍生物的例子有帕布昔利布的多晶型、或其药学上可接受的盐，例如帕布昔利布的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、磺酸盐、碳酸盐、醋酸盐、酒石酸盐、甲酸盐、乙酸盐或羟乙基磺酸盐等。这些衍生物的制备通常可以通过常规技术手段获得，且其作用和效果可以根据细胞实验或等效性实验中与帕布昔利布比较获得，均在本领域技术人员可以理解和预期的范围内。一种优选的帕布昔利布为帕布昔利布盐酸盐。

本发明帕布昔利布或其衍生物可以直接用于所需的对象，或与药学上可接受的载体混合或经制备后，以药物组合物的形式进行施用。可用于本发明的帕布昔利布或其衍生物的施用剂量通常为5-150mg/kg/d，例如50-120mg/kg/d，优选为80-90mg/kg/d。而该施用的剂量在临床医师或实验室人员的可预期范围内，例如可通过有效性、安全性测试，对其剂量进行适当的调整，从而获得最优的施用剂量。

黏膜黑色素瘤

黏膜黑色素瘤是黑色素瘤的一种亚型，黏膜黑色素瘤西方人群中发病率较低，占恶性黑色素瘤的总数比例不足1.3％，但是在东亚人群中高发(占恶性黑色素瘤黑总数约33.3％)。常见的发病部位为头颈部的鼻咽部(23％)，口腔(15％)，包括牙龈，硬腭，颊部等，5年总生存率非常低为27％。皮肤恶性黑色素瘤多为阳光损害型，且以braf,cdkn2a,nras突变为主要特点，且突变负荷显著高于黏膜恶黑，早期发现的皮肤恶黑预后相对于黏膜恶性黑色素瘤较高。五年生存率为80％。黏膜黑色素瘤与皮肤恶性黑色素瘤不同，其病因与紫外线照射无关，但具体病因和机制尚不清楚，黏膜恶性黑色素瘤相对于皮肤恶性黑色素瘤来说，进展迅速，由于位置隐蔽，不易探查发现，无明显不适症状，初次就诊伴随淋巴转移多见，五年生存率极低。从遗传学角度来讲，黏膜恶黑相较于皮肤恶黑，突变负荷和驱动性基因的点突变频率较低，而存在更多的基因拷贝数目改变和染色体结构变异(缺失，复制，串联复制)。同时，黏膜恶黑的染色体中可见大量的断裂点聚集，这提示了粘膜恶黑可能存在更多的染色体重排，可能是由于一些复杂的遗传学事件驱动造成的。在关键基因突变方面，黏膜恶黑缺少皮肤恶黑中较为常见的braf，ras家族，nf1，tp53,pten，cdkn2a等知名的驱动性基因的高频突变；而存在大量的关键基因拷贝数目改变。比如12q14区域(包含知名原癌基因cdk4)and5p15(包含知名原癌基因tert)存在高频率的基因扩增，这提示了在遗传学基础和致病机制方面，黏膜恶黑与皮肤恶黑存在明显差异。

对于转移或不可切除的皮肤黑色素瘤，其治疗方式主要以免疫治疗及靶向治疗为主。如对于携带brafv600激活突变的患者，使用达拉菲尼/曲美替尼(dabrafenib/trametinib)或维罗菲尼/考比替尼(vemurafenib/cobimetinib)联合靶向治疗。近年在黑色素瘤肿瘤治疗中兴起的免疫治疗，主要为抗pd1的单抗治疗，包括派姆单抗(pembrolizumab)或者是纳武单抗(nivolumab)，在一些患者中也展示了良好的治疗效果。而对于黏膜黑色素瘤的治疗，通常包括手术切除，而对放疗和化疗均不敏感。近30年来，fda仅批准了dtic和高剂量il-2治疗晚期mm，但有效率低，不能明显延长生存期。而其它靶向药的疗效也亟待观察，且随人种和突变情况不同有效情况各不相同。黏膜恶性黑色素瘤的靶向药物除了imatinib外，无更有效的靶向治疗方式，但伊马替尼(imatinib)临床反应率低的现状亟需我们发现新的靶向药物来针对黏膜恶性黑色素瘤。

可用于本发明的黏膜黑色素瘤，主要包括头颈部的黏膜黑色素瘤，如来源于口腔、口咽、鼻咽等部位的黏膜黑色素瘤。

黏膜黑色素瘤通常为散发的野生型，也可为具有基因突变型的黏膜黑色素瘤。已知的具有突变基因的黏膜黑色素瘤包括kit基因突变、braf基因突变等。

可用本发明帕布昔利布进行治疗的黏膜黑色素瘤包括各种分期的黏膜黑色素瘤，优选iii期(t3)。常见的有通过目前唯一公认的黏膜恶性黑色素瘤分期即为ajcc上的分期。即一旦确诊即为t3,再根据是否为有淋巴转移或远处转移分类。黏膜黑色素瘤：

iii期(t3,n0,m0),

iva期(t4a,n0,m0,t3-t4a,n1,mo),

ivb期(t4b,任何n,m0),ivc(任何t,n,m1)

其中，n代表淋巴结转移；m代表远处转移；t代表浸润程度：

t3：黏膜病变

t4a：中期病变，病灶累及深层组织、骨或软骨

t4b：晚期病变，病灶累及脑、硬脑膜、颅底、后组脑神经(ⅸ、ⅹ、ⅺ、ⅻ)、咬肌间隙、颈内动脉、椎前间隙或纵隔结构。

关于黏膜恶性黑色素瘤，目前仅存在根据病理观察细胞形态进行的病理分级。如：无法评估的(gx)分化良好的(g1)，中度分化的(g2)，低分化的(g3)，和/或未分化的(g4)病理分级。

药物组合物

如本文所用，术语“药物组合物”是指将用于特定目的而被施用的组合物。

如本文所用，术语“活性成分”指的是帕布昔利布或其衍生物。

为了本发明目的，药物组合物含有帕布昔利布或其衍生物作为活性成分，以及药学上可接受的载体并用于治疗黏膜恶性黑色素瘤的物质。术语“药学上可接受的”是指政府药品管理机构或在药典上列出并认可的可以用于脊椎动物、尤其用于人类的物质。通常，药学上可接受的载体指的是一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

本发明活性成分或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肌肉注射、静脉注射、静脉滴注、瘤内注射、灌肠、喷雾、外敷、或腹腔注射。

用于口服给药的固体剂型包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、或胶囊剂。在这些固体剂型中，活性成分与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性成分或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性成分也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、溶液、悬浮剂、糖浆或酊剂。除了活性成分外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷雾剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选6～600mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。通常其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。

此外，本发明药物组合物或活性成分还可以与其它肿瘤治疗剂一起施用，例如已知靶点的恶性黑色素瘤靶点抑制剂，如伊马替尼(imatinib)、维罗非尼(vemurafenib)、达拉菲尼(dabrafenib)、瑞博西林(ribociclib)、玻玛西林(abemaciclib)。

应用

本发明提供了一种帕布昔利布的临床新应用，即用于治疗至今难以有确切治疗药物的黏膜恶性黑色素瘤。由于黏膜恶性黑色素瘤的分期晚、恶性程度高、预后极差，至今未能有有效的治疗药物，普通黑色素瘤的治疗药物几乎均无效果。而本发明人意外地发现，帕布昔利布对黏膜恶性黑色素瘤具有非常优异的抑制效果，而这种效果又与其本身作为cdk4/6抑制剂的机制不尽相同。

而用于细胞实验时，本发明活性成分还可以用于抑制细胞培养中的黏膜恶性黑色素瘤的增殖，为细胞模型的建立奠定了新的基础。通常，细胞实验中，所添加的本发明活性成分的浓度大约为0.001μm-1000μm，优选地为0.01-100μm，该浓度可以根据所需达到的效果对添加的浓度进行进一步调整和验证，这均在本领域技术人员可以常规获得的范围内。

本发明有益效果

本发明为治疗黏膜恶性黑色素瘤提供了全新的途径，丰富了黏膜恶性黑色瘤的治疗手段，为提高黏膜恶性黑色素瘤的五年生存期奠定了新的基础。此外，由于药物已知，在新的应用及药物安全性上将更有益于临床应用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用材料

rpmi1640培养基、胎牛血清(fetalbovineserum,fbs)购自gibco公司。

cck-8购自biotool公司。

所选150种候选药物均为nccn指南推荐的用于治疗恶性黑色素瘤的小分子抑制剂及细胞毒性药物，以及其他一些常见肿瘤治疗靶点的小分子靶向药物，细胞毒类药物以及小分子靶向抗肿瘤制剂均购于selleck公司。

实施例1pdc(patientderivedcell)筛选敏感性候选化合物

入选标准：发生于黏膜的恶性黑色素瘤原发病灶。黏膜恶性黑色素瘤尚无明确分型。分期根据ajcc。

将获得的黏膜恶性黑色素瘤样本进行pdc模型筛选敏感性抑制剂，方法如下：

1)收集对数生长期的pdc细胞，胰酶消化后，制备细胞悬液，细胞计数，将细胞浓度调至2×10⁴个/ml；

2)将细胞接种到96孔板中，每孔100ul细胞悬液，每个药物浓度至少设置3个副孔；

3)将细胞置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养过夜；

4)细胞接种后第二天，按药物浓度梯度0nm，10^-3nm，10^-2nm，10^-1nm，1nm，10nm，100nm，1000nm，10um，加入到96孔板中；

5)将细胞放入培养箱，继续培养72小时；

6)将cck-8试剂与培养基按照1:10配制成混合液，吹打均匀，吸去96孔板内原培养基，每孔加入100微升的cck-8稀释液。设置一组空白对照，即在一组没有细胞的空白孔中加100微升cck8稀释液，同样至少设置3个复孔。加药后轻微震荡96孔板，使cck-8以及侧壁残留的液体与板中液体充分混匀；

7)加入cck-8后将细胞继续培养3小时；

8)将酶标仪设定波长450nm，测定每孔的吸光值(od值)，并获得了ic50值。

对5株细胞进行的近150种靶点药物的筛选药物清单如下：

mdm2：nutlin3mx69,yh239-ee,nvp-cgm097,idasanutlin

tert：bibr1532,木香烃内酯(costunolide)

her2：拉帕替尼(lapatinib)、阿法替尼(afatinib)、来那替尼(neratinib)、卡奈替尼(canertinib)、sapitinib、木利替尼(mubritinib)、ac480、tak-285、irbinitinib、曲妥珠单抗trastuzumab、帕妥珠单抗(pertuzumab)。

cdk：roscovitin、迪那昔利布(dinaciclib)、azd5438、mk-8776、pha-793887、pha-767491r457、xl413、p276-00、nu6027、ro-3306、kenpaullone、senexina、purvalanola、ml167、tg003、su9516、帕布昔利布(palbociclib)

parp：奥拉帕尼(olaparib)、veliparib、rucaparib、talazoparib、iniparib、pj34hcl、upf1069、azd2461、niraparib、e7449、nu1025、苯甲酰胺(benzamide)、nms-p118、吡啶酰胺(picolinamide)

kit：达沙替尼(dasatinib)、舒尼替尼(sunitinib)

pdgfr：帕纳替尼(ponatinib)、avapritinib

egfr：埃罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、ag-490

vegfr：索拉菲尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、cabozantinib、foretinib、范德他替尼(vandetanib)、尼达尼布(nintedanib)、瑞戈非尼(regorafenib)、帕唑帕尼(pazopanib)、西地尼布(cediranib)、pd173074、多韦替尼(dovitinib)、linifanib、瓦他拉尼(vatalanib)、tivozanib、乐伐替尼(lenvatinib)、布利尼布(brivanib)

c-met：克唑替尼(crizotinib)、su11274、pha-665752、sgx-523、bms-777607、tivantinib、glesatinib、capmatinib、tepotinib、merestinib、去甲斑蝥素(norcantharidin).

stat3：sh-4-54、nt157、whi-p154、napabucasin、硝呋齐特(nifuroxazide)、ochromyclnone、hjc0152、氯硝柳胺(niclosamide)、c188-9

pi3k：dactolisib、pictilisib、idelalisib、buparlisib、tanalisib、autophinib

bcl2：abt-737、navitoclax、obatoclax、甲磺酸(mesylate)、tw-37、venetoclax、btsa1、s63845、wehi-539、fx1、at101、ha14-1、sabutoclax.

wnt/pactin：lgk-974、wnt-c59、xav-939、icg-001、iwr-1-endo、异槲皮苷(isoquercitrin)、icrt3、gnf-6231、iwp-l6、iwp-2、ky02111

jak：托法替尼(tofacitinib)、momelotinib、fm-381、pf-06651600、at9283、fedratinib、azd1480、az960、cep-33779、gandotinib、baricitinib、filgotinib、peficitnib、cerdulatinib、oclacitinib

hadc：vorinistat、entinostat、帕比司他(panobinostat)、曲古抑菌素a(trichostatina)、mocetinostat、wt161、达西司特(dacinostat)、givinostat.

化疗药：顺铂(cisplatin)、替莫唑胺(temozolomide)、达卡巴嗪(dacarbazine)、紫杉醇(paclitaxel)、卡铂(carboplatin)

nccn-黑色素瘤推荐药物：维莫非尼(vemurafenib)、达拉菲尼(dabrafenib)、曲美替尼(trametinib)、cobimetinib、伊马替尼(imatinib)

筛选后，获得了这些化合物对于不同来源黏膜恶性黑色素瘤的实验结果。其中的部分筛选结果如下表1所示。

表1

其中，002#、006#、010#、011#、014#分别为来自口咽、牙龈、鼻咽、硬腭，颊黏膜的代表性黏膜恶性黑色素瘤，这五株细胞增殖最快，由此将该五株细胞分别用于后续移植瘤模型的构建。

而从表1的结果可见，帕布昔利布对于黏膜恶性黑色素瘤具有较好的效果，且从100nm的浓度开始即具有效果。多种已知的普通皮肤黑色素瘤治疗剂vemurafenib，dabrafenib，selumetinib，tasisulam等对黏膜恶性黑色素瘤并不具有抑制作用，而多种已知的细胞毒类药物以及帕布昔利布同类的cdk4/6抑制剂也对各种部位来源的黏膜恶性黑色素瘤同样不具备抑制作用。由此，提示了帕布昔利布可能是通过新的未知作用途径对黏膜恶性黑色素瘤具有抑制作用。

实施例2移植瘤模型的构建及帕布昔利布的肿瘤抑制作用

为了对病人组织来源肿瘤的生物学和遗传学特征进行更好的还原，将实施例1中采集的样本同样进行小鼠移植瘤模型的构建，并进一步验证帕布昔利布的抑制作用。

1)将无菌培养皿，手术器械包放入传递仓进行紫外线消毒30分钟；

2)小鼠进行称重，无菌注射器抽取10％的水合氯醛，按照小鼠体重按0.004ml/g计算所用剂量，最大剂量不超过0.1ml，注射到小鼠腹腔内。

麻醉注意事项：缓慢注射，同时观察肌肉紧张性，活动度明显减弱或消失时为麻醉成功；

麻醉后需注意保持体温，采取保温措施，采用加热片，台灯照射；

麻醉深度不足可适当补加麻醉剂，补加剂量不宜超过标准计量20％

3)用含1％双抗的pbs清洗肿瘤组织2次，每次5-10分钟，用眼科剪在pbs中修剪瘤体，去除坏死组织，将组织分成3mm×3mm×3mm组织块。

4)在已麻醉的小鼠背部皮肤用酒精棉球消毒，将分离的组织块塞进套筒针，将套筒针推到老鼠背部皮下，平老鼠身长潜行长度约2cm，缓慢推套筒针末端将组织块推出套筒针，缓慢退针。每只老鼠注射一个部位，根据收集的肿瘤组织量，确定接种小鼠数量，一般每个肿瘤样本接种3-5只小鼠，第一代老鼠记为p1代(肿瘤患者为p0)，剩余肿瘤组织用于常规石蜡包埋。

nude裸鼠及nod－scid重症联合免疫缺陷小鼠小鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司

移植瘤模型命名为pdx002#(mm002)、pdx006#(mm006)、pdx010#(mm0010)、pdx011#(mm011)、pdx014#(mm0014)，以病人肿瘤接种日期进行编号。移植成功后,当肿瘤体积达到平均200-300mm³(每组5-15只老鼠)时，负荷移植瘤的老鼠被随机分为对照组与试验组。对照组与试验组分别给予28天处理计划的生理盐水(口服，每天)和帕布昔利布(30、60、90、120mg/kg,口服，每天)。每周测量移植瘤体积2次，用药28天后，将裸鼠麻醉，拍照，将肿瘤组织取出，冰上操作，将肿瘤分成多个小块，一部分包埋，一部分冻存到液氮中。肿瘤体积＝l×w²×0.5，其中l代表最大直径，w代表肿瘤最小直径。肿瘤生长抑制(tumorgrowthinhibition,tgi)tgi＝[1-(tvf,treated-tvi,treated)/(tvf,control-tvi,control)]×100％,其中tvf代表实验终点组内肿瘤平均体积，tvi代表实验起点组内肿瘤平均体积。

结果发现，60-90mg/kg/d的帕布昔利布在pdx011#和pdx014#模型中展现出明显的抗肿瘤效应(tgi＝46.02％-76.08％(60-90mg/kg/d)，62.21％(90mg/kg/d)，p<0.01),并且小鼠模型很好地耐受了药物。(30天的处理时间内体重改变<15％)。

为了进一步补充帕布昔利布在pdx011#模型中的抗肿瘤效应，将治疗时间延长至53天，发现，在pdx011#模型中，药物浓度依赖的tgi水平从60mg/kg时的60.30％上升到90mg/kg的87.05％。更重要的是。应用浓度为90mg/kg或120mg/kg的帕布昔利布的小鼠模型没有观察到明显的毒性作用，反而表现出53天药物处理时间段内持续稳定的肿瘤抑制作用。(见图1)

为了比较帕布昔利布和imatinib(美国nccn指南中，对存在kit基因突变的mm推荐的唯一靶向治疗药物)在pdx模型中的疗效差异，在存在kit基因的pdx014#模型中同时设置了imatinib和帕布昔利布单独及联合用药疗效评估。结果显示帕布昔利布较imatinib显示了更高的肿瘤抑制效应(tgi＝62.21％vstgi＝tgi＝25.57％)，值得注意的是，帕布昔利布和imatinib的联合用药显示的最为显著的协同肿瘤抑制效应(tgi＝82.14％)，见图2。

实施例3全基因组测序

对实施例1中筛选出的五株细胞进行全基因组测序，测序发现这些黏膜恶性黑色素瘤中，cdk4,以及tert,mdm2,frs2,kit,braf,ccnd1等知名肿瘤驱动基因存在明显扩增。

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