青蒿素在制备治疗PI3K/AKT/mTOR激活的人肝癌Huh7细胞的药物中的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及青蒿素在制备治疗pi3k/akt/mtor激活的人肝癌huh7细胞的药物中的应用。

背景技术：

肝癌，其症状包括肋骨下方右侧肿块或疼痛，腹部肿胀，皮肤发黄，体重减轻，也称为肝癌，起始于肝脏。原发性肝癌是全球第六大常见癌症类型(占所有癌症的6％)，每年全世界有超过50万人死于此类癌症。

根据世界卫生组织国际癌症研究中(who/iarc)2008年全球癌症报告(globocan2008)结果显示，全世界肝癌平均发病世标率为10.8/10万，男性16.0/10万，女性6.0/10万。发达国家发病世标率为5.2/10万，男性8.2/10万，女性2.7/10万。发展中国家发病世标率为13.1/10万，男性18.9/10万，女性7.6/10万。亚洲平均发病世标率为14.8/10万，男性21.6/10万，女性8.2/10万。中国发病世标率为18.4/10万，男性27.9/10万，女性9.2/10万。2003～2010年中国癌症发病分析结果显示肝癌居全部恶性肿瘤第4位，中标率14.54/10万，居男性全部恶性肿瘤第3位，中标率22.40/10万，居女性全部恶性肿瘤第5位，中标率6.82/10万。

肝癌的发病与饮食和生活习惯息息相关，大量流行病学调查表明，长期大量饮酒会诱发肝癌。国内近10年研究饮酒与原发性肝癌关系的文献进行meta分析，显示饮酒与原发性肝癌呈中等关联。长期吸烟、进食霉变食物、含亚硝胺是食物、微量元素硒缺乏也是促发肝癌的重要因素。尽管为改善肝癌的诊断和治疗策略做了大量努力，但在过去十年中，肝癌患者的平均存活率仅略有改善，故新治疗方式的发现至关重要。因此，迫切需要鉴定一种新的肝癌治疗靶点并探索可能的相关分子机制。

原发性肝癌多为正虚邪实之证，临床多表现为肝区疼痛、神疲乏力、纳呆食少和进行性肝肿大等。肝癌的发病与人体抗癌力强弱、致病邪气的性质密切相关。“多因交合、癌毒内生”是肝癌发展的关键因素,病机多以虚为本,因癌致虚,虚实夹杂。其治疗主张攻毒抗癌，以扶正与祛邪为主，在临床上应根据病情做到辨病与辨证相结合，注重在辨病基础上的辨证治疗，形成辨证论治的中医思维。“痰、瘀、毒、虚”互结是恶性肿瘤的常见病机，其中肝癌以“肝郁脾虚、瘀毒互结”为主，常兼夹湿热、水湿、肝肾阴虚等证，当以“健脾理气、化瘀软坚、清热解毒”为基本治法，配合清热利湿、清肝利胆、利水化湿、滋补肝肾等法。因此，中药治疗对原发性肝癌和预后转移具有重要的临床意义。

青蒿素是上世纪七十年代从菊科植物黄花蒿中提取的一种含有过氧桥基团的倍半萜内酯类药物，是一种无色针状晶体，化学名称为(3r,5as,6r,8as,9r,12s,12ar)-八氢-3,6,9-三甲基-3,12-桥氧-12h-吡喃〔4,3-j〕-1,2-苯并二塞平-10(3h)-酮。分子式为c15h22o5，属倍半萜内酯，具有过氧键和6-内酯环，有一个包括过氧化物在内的1，2，4-三噁结构单元，这在自然界中十分罕见，分子中包括有7个手性中心，它的生源关系属于amorphane类型，其特征是a，b环顺联，异丙基与桥头氢呈反式关系。制备熔点为156-157℃，[a]d17＝+66.3°(c＝1.64氯仿)。青蒿素在丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷中易溶，在甲醇、乙醇、稀乙醇、乙醚及石油醚中溶解，在水中几乎不溶；在冰醋酸中易溶。因其具有特殊的过氧基团，它对热不稳定，易受湿、热和还原性物质的影响而分解。

最近的研究表明，青蒿素及其衍生物在各种人类癌细胞模型系统中表现出有效的抗癌作用，如结肠癌，黑色素瘤，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，中枢神经系统癌，白血病癌和肾癌细胞。根据组织类型和实验系统、分子、细胞和生理学研究表明，青蒿素及其衍生物的反应和多种癌症信号通路有关，这些通路可能涉及细胞周期停滞、细胞凋亡、抑制血管生成和细胞迁移、以及核受体反应的调节。

青蒿素具有毒性较低的特点并显示出良好的抗肿瘤活性。经文献调研并未见青蒿素在人源肝癌huh7细胞作用机制的研究报道。

技术实现要素：

为了克服上述技术缺陷，本发明的目的是提供了一种青蒿素在制备治疗pi3k/akt/mtor激活的人肝癌huh7细胞的药物中的应用，其含有药学上的治疗有效剂量的青蒿素，所述青蒿素能够通过抑制pi3k/akt/mtor通路的p-akt、p-s6的表达，进而诱导人肝癌huh7细胞的凋亡。

pi3k/akt/mtor信号通路是正常细胞和癌细胞的主要生长调节途径之一。其在细胞生长、存活、代谢和抗凋亡中起重要作用。pi3k是以一种胞内磷脂酰肌醇激酶，与v.src和v.ras等癌基因的产物相关，且pi3k本身具有丝氨酸/苏氨酸激酶的活性。pi3ks蛋白家族参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。pi3k活性的增加常与多种参与癌症相关。akt，亦称为蛋白激酶b，是pi3k的下游主要效应物，在多种细胞生长过程中发挥关键作用，如葡萄糖代谢、凋亡、细胞增殖、转录和细胞迁移。akt的ser473可以被pdk1磷酸化。活化的akt通过磷酸化多种酶、激酶和转录因子等下游因子，进而调节细胞的功能。启动后的akt通过直接和简介两种途径启动其底物雷帕霉素靶体蛋白(mtor)：直接磷酸化mtor，或者通过失活结节性硬化复合物2(tsc2)从而维持rheb的gtp结合状态，然后增强mtor的启动。mtor是pi3k/akt下游的一种重要的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。它可通过激活核糖体激酶，来调节肿瘤细胞的增殖、存活和侵袭转移。

进一步的，所述青蒿素是从复合花序植物黄花蒿茎叶中提取的有过氧基团的倍半萜内酯的一种无色针状晶体，来源于美国sigma公司。

青蒿素是从复合花序植物黄花蒿茎叶中提取的有过氧基团的倍半萜内酯的一种无色针状晶体，分子式为c15h22o5，属倍半萜内酯，制备熔点为156-157℃，[a]d17＝+66.3°(c＝1.64氯仿)。本品在丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷中易溶，在甲醇、乙醇、稀乙醇、乙醚及石油醚中溶解，在水中几乎不溶；在冰醋酸中易溶。因其具有特殊的过氧基团，它对热不稳定，易受湿、热和还原性物质的影响而分解。

进一步的，所述青蒿素的浓度≥100μm。

当青蒿素浓度≥100μm时，对人肝癌huh7细胞的抑制有差异统计学意义，肝癌细胞的集落形成抑制在50％以下，且随着青蒿素浓度增大，抑制效果越好。

进一步的，所述药物可制成栓剂，其制备方法为：1)加入203.7g聚乙二醇4000、101.8g聚乙二醇400、33.9g纯化水、4g吐温-80，于80℃下融化；2)不断搅拌下加入50g青蒿素，然后加入4g维生素e，搅拌30分钟，使之均匀；3)将配置好的溶液加入bzs-1型栓剂灌封机组贮藏药罐中，设定保温温度为53-55℃，开启灌装机组，罐装速度为3000粒/小时，即得青蒿素栓剂。

进一步的，所述药物可制成微囊颗粒，其制备方法为：1)将1-10mg青蒿素过100目筛，溶解于其6-8倍重量的乙醇中；2)加入20mg淀粉磷酸酯钠和50mg吐温乳化剂，搅拌均匀，得芯材溶液；3)以10mg壳聚糖、20mg羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐和50mg明胶作为壁材，加入所述壁材的6-8倍重量的水，升温至50-60℃，搅拌均匀，得壁材悬液；4)将所述芯材溶液和所述壁材悬液按照重量比为1：3-5于胶乳超声波均质机进行均质处理20-30分钟，得乳状物；5)将所述乳状物输送至造粒喷雾机进行喷雾干燥，冷却至室温，包装，即得青蒿素微囊颗粒。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明首次发现青蒿素对人肝癌huh7细胞具有增殖抑制作用，并呈现良好的时间和浓度依赖性。细胞活力实验结果显示：在同一作用时间的青蒿素浓度越高，对细胞的增值抑制率越高；当青蒿素浓度为100μm时，对人肝癌huh7细胞的抑制有差异统计学意义。细胞克隆形成实验结果显示：青蒿素对人肝癌huh7细胞增殖具有明显的抑制作用；当青蒿素浓度为100μm时，肝癌细胞的集落形成抑制在50％以下，且随着青蒿素浓度增大，抑制效果越好。

(2)本发明发现青蒿素能够通过抑制pi3k/akt/mtor通路的p-akt、p-s6的表达，进而诱导人肝癌huh7细胞的凋亡。细胞流式实验结果显示：对照组huh7细胞的凋亡率为4.97％，经100μm青蒿素处理24h后，实验组huh7细胞的凋亡率为10.48％，其凋亡率明显升高。westernblot实验结果显示：与空白对照相比较，加入青蒿素后，p-akt/p-s6蛋白表达下调，差异有统计学意义(p<0.05)。

(3)本发明为研制新的抗肝癌候选药物提供了科学依据，对开发中药新药具有重要意义。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，其中：

图1为实施例1中细胞活力实验检测不同浓度的青蒿素在不同时间下对人肝癌huh7细胞的增殖抑制作用图；

图2为实施例1中细胞活力实验检测100μm的青蒿素在不同时间下对人肝癌huh7细胞的增殖抑制作用图；

图3为实施例1中细胞克隆形成实验检测不同浓度的青蒿素对人肝癌huh7细胞的增殖抑制作用图；

图4为实施例1中细胞克隆形成实验检测不同浓度的青蒿素对人肝癌huh7细胞的增殖抑制作用图；

图5为实施例2中细胞流式实验检测青蒿素诱导人肝癌huh7细胞凋亡的作用图；

图6为实施例2中细胞流式实验检测青蒿素诱导人肝癌huh7细胞凋亡的作用图；

图7为实施例3中westernblot检测青蒿素对pi3k/akt/mtor信号通路蛋白的影响图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明通过细胞活力测试、细胞克隆形成实验、细胞流式实验、westernblot实验研究青蒿素诱导人肝癌huh7细胞凋亡的作用机制。

各种试验仪器与试剂均为市售商品，均为可通过商业途径购买获得。其中，青蒿素由传统中草药黄花蒿中提取有效成分制得，购买于美国sigma公司，产品型号为361593，青蒿素含量为98％；体外实验所用的细胞株为人源肝癌细胞(huh7)，来源于美国atcc细胞库。

实施例1：

将青蒿素药物制成栓剂，其制备方法为：

1)加入203.7g聚乙二醇4000、101.8g聚乙二醇400、33.9g纯化水、4g吐温-80，于80℃下融化；2)不断搅拌下加入50g青蒿素，然后加入4g维生素e，搅拌30分钟，使之均匀；3)将配置好的溶液加入bzs-1型栓剂灌封机组贮藏药罐中，设定保温温度为54℃，开启灌装机组，罐装速度为3000粒/小时，即得青蒿素栓剂。

给药方法：

成人常用量：直肠给药，首次0.6g，4小时后0.6g，第2、3日各0.4g。

注意事项：1、如肛塞后2小时内排便，应补用一次。

实施例2：

将青蒿素药物制成微囊颗粒，其制备方法为：

1)将1-10mg青蒿素过100目筛，溶解于其7倍重量的乙醇中；2)加入20mg淀粉磷酸酯钠和50mg吐温乳化剂，搅拌均匀，得芯材溶液；3)以10mg壳聚糖、20mg羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐和50mg明胶作为壁材，加入壁材的7倍重量的水，升温至55℃，搅拌均匀，得壁材悬液；4)将上述芯材溶液和壁材悬液按照重量比为1：4于胶乳超声波均质机进行均质处理25分钟，得乳状物；5)将步骤4)所得乳状物输送至造粒喷雾机进行喷雾干燥，冷却至室温，包装，即得青蒿素微囊颗粒。

给药方法：口服，每日三餐前服用一粒。

效果试验例1：检测不同浓度的青蒿素在不同时间下对人肝癌huh7细胞的增殖抑制作用。

(一)cellviabilityassay法测定细胞增殖

1)取处于对数生长期，生长状态良好的人肝癌huh7细胞，用dmem(含有10％fbs和1％青霉素、1％链霉素)培养基调整细胞密度到3×10⁴个/ml，接种到96孔板，每孔100μl细胞悬液，同时设置空白组，在37℃，5％co2条件下培养过夜；

2)待细胞贴壁生长良好24h后，弃旧的培养液，加入用dmem培养基稀释过的青蒿素，浓度依次为0μm、50μm、100μm、150μm、200μm、250μm，每种浓度设置6个重复；阴性对照组加等量的dmem；放入培养箱分别培养24h、48h、72h；

3)待药物作用到相应时间点后，从培养箱中取出96孔板，分别加入20μlcelltiter-luminescentcellviabilityassay，注意避光，放入培养箱孵育10分钟后，使用bio-rad细胞城乡检测仪测量luminescent的吸光度；

4)细胞存活率(cellviability％)＝(加药组/阴性对照组)×100％。

实验重复三次，分别计算不同浓度的青蒿素在不同时间下对人肝癌huh7细胞的抑制情况，实验结果如图1-2、表1所示。

表1细胞增殖抑制率

细胞活力实验结果显示：有表1可见，分别作用24h、48h、72h后，青蒿素能剂量依赖和时间依赖性抑制人肝癌huh7细胞的增殖。由图1可见，在同一作用时间的药物浓度越高，与空白对照相比细胞增殖抑制率也随着增高。由图2可见，在青蒿素浓度为100μm时，对人肝癌huh7细胞的抑制有差异统计学意义。

(二)细胞克隆形成实验

1)制备细胞悬液：弃旧培养基，pbs洗一遍后加1ml0.25％的胰酶消化3min，显微镜下观察大部分细胞变圆时，弃胰酶，加2倍所加胰酶量的完全培养基终止消化，将瓶内细胞轻轻吹下并转移到15ml离心管中，于1000rpm下离心5min；

2)弃上清，加入新鲜培养基，1/3的细胞悬液留种，其余备用；

3)细胞计数和铺板：细胞悬液吹打混匀后，吸取10μl加入血球计数板在显微镜下计数；向12孔板的每孔加入2ml浓度调整过的细胞悬液，细胞数为2000个/孔，置于37℃，5％co2培养箱中培养，使其过夜贴壁；

4)加药：弃去旧培养基，加入用dmem培养基稀释过的青蒿素，浓度依次为0μm、50μm、100μm、150μm，每种浓度设置3个重复；

5)将平板在37℃，5％co2条件下孵育7天以允许菌落生长；在长期孵育期间，每三天更换含有不同浓度的青蒿素(0μm、50μm、100μm、150μm)的新鲜完全培养基；用1xpbs洗涤细胞两次，0.01％结晶紫溶液染色；geldoctmxr+imager(bio-rad)捕获图像；为了量化集落形成的速率，将集落形式的染色细胞溶解在10％(v/v)乙酸中，在540nm处定量吸光度；

6)数据统计：细胞克隆形成率＝(加药组/阴性对照组)×100％。

细胞克隆形成实验结果显示：由图3可见，与空白对照组相比较，青蒿素对人肝癌huh7细胞增殖具有明显的抑制作用。由图4可见，在青蒿素浓度为100μm时，肝癌细胞的集落形成抑制在50％以下，且随着青蒿素浓度增大，抑制效果越好。故后续实验我们选取青蒿素浓度为100μm。

效果试验例2：细胞流式实验检测青蒿素诱导人肝癌huh7细胞凋亡的作用。

1)取处于对数生长期，生长状态良好的人肝癌huh7细胞，用dmem(含有10％fbs和1％青霉素、1％链霉素)培养基调整细胞密度到5×10⁶个/ml，接种到6孔板，每孔100μl细胞悬液，同时设置空白组，在37℃，5％co2条件下培养过夜；

2)待细胞贴壁生长良好24h后，弃旧的培养液，加入用dmem培养基稀释过的青蒿素，浓度依次为0μm、100μm，每种浓度设置3个重复；阴性对照组加等量的dmem；放入培养箱培养24h；

3)把细胞培养液吸出至一合适离心管内，pbs洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液(可含有edta)消化细胞；室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液，需避免胰酶的过度消化；

4)加入步骤3)中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用pbs轻轻重悬细胞并计数；注意：加入步骤3)中的细胞培养液一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶；残留的胰酶会消化并降解后续加入的annexinv-pe导致染色失败；

5)取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μlannexinv-pe结合液轻轻重悬细胞；

6)加入5μlannexinv-pe，轻轻混匀；注：由于细胞样品的差异、凋亡和坏死程度的差异，可根据预实验结果优化annexinv-pe的使用量；

7)室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中；可以使用铝箔进行避光，孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善标记效果；

8)随即进行流式细胞仪检测；

9)数据统计。

以上实验重复三次，实验结果如图5-6所示。

实验结果显示：由图5可见，annexinv-fitc/pi双染结果显示，在青蒿素药物作用24h时，与空白对照相比较，实验组的细胞凋亡率增加。由图6可见，对照组huh7细胞的凋亡率为4.97％，经100μm青蒿素处理24h后，实验组huh7细胞的凋亡率为10.48％，其凋亡率明显升高。

效果试验例3：westernblot检测青蒿素对pi3k/akt/mtor信号通路蛋白表达的变化。

考察的相关蛋白有：p-akt、akt、p-s6、s6。

1)取处于对数生长期，生长状态良好的人肝癌huh7细胞，用dmem(含有10％fbs和1％青霉素、1％链霉素)培养基调整细胞密度到5×10⁶个/ml，接种到6孔板，每孔100μl细胞悬液，同时设置空白组，在37℃，5％co2条件下培养过夜；

2)待细胞贴壁生长良好24h后，弃旧的培养液，加入用dmem培养基稀释过的青蒿素，浓度依次为0μm、100μm、200μm每种浓度设置3个重复；阴性对照组加等量的dmem；放入培养箱培养24h。

3)从培养箱中取出细胞，吸掉培养基，轻轻加入冰的pbs清洗一遍，弃掉残留液体；

4)加入100μl的ripa细胞裂解液(含有蛋白酶抑制剂)，用细胞刮铲刮下细胞，吸到ep管中，插入冰里裂解1h，期间颠倒几次使细胞裂解充分；

5)将ep管放在4℃离心机中于14000rpm下离心20min，取上清；

6)使用bca试剂盒测蛋白浓度：用bsa作为标样做标准曲线，在96孔板中加入2μl蛋白溶液和200ulbca工作液(a：b＝50：1)于37℃下反应30min，用酶标仪在450nm检测吸光度，利用吸光度浓度计算公式计算样本浓度；按其中浓度最低的样品为参照，将所有样品浓度调节一致。

7)加入v/2蛋白变性loadingbuffer在金属浴中95℃变性10min，离心后可直接上样，或长期保存在-80℃冰箱；

8)上样：westernblotting上样，每孔上样20ul，根据样品数量选择孔数，电压200v，时间30min左右(预制胶)；

9)转膜：切一块长9cm、宽6cm的pvdf膜和两张相同大小的滤纸，将膜放在甲醇中浸泡，滤纸、膜、凝胶和滤纸“三明治”式放置湿转250ma、90min，胶面向黑的一测即负极，切勿放错位置，做好方向标记；

10)封闭：将膜放在tbst配制5％的牛奶中封闭1h后，tbst清洗4次，每次5min；

11)孵育一抗：一抗用5％的bsa+0.02％的叠氮钠按1：1000稀释。4℃摇床孵育过夜，一抗稀释液可有放在-20℃保存多次使用；

12)清洗：用tbst清洗4次，放在摇床，低速摇晃，每次10min；

13)孵育二抗：二抗用tbst配制的5％牛奶按1：5000稀释，放置在摇床，室温孵育2h；二抗稀释液最好不要反复使用；

14)清洗：使用tbst摇晃清洗4次，每次5min；

15)曝光：显影液试剂盒a与b液按1：1配用，使用时，覆盖住膜反应1min左右放入蛋白成像系统中曝光。

以上实验重复三次，实验结果如图7所示。

实验结果显示：由图7可见，与空白对照相比较，加入青蒿素后，p-akt/p-s6蛋白水表达下调，差异有统计学意义(p<0.05)，表明青蒿素通过抑制pi3k/akt/mtor信号转导通路的p-akt和p-s6的表达，进而抑制人肝癌huh7细胞增殖。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。