专利名称：提高青蒿器官生物量和青蒿素含量的培养方法
技术领域：
本发明属于生化工程技术中植物器官的培养方法，特别涉及一种提高青蒿器官生物量和青蒿素含量的培养方法。
青蒿素是含有过氧基团地倍半萜内酯，分子式为C15H22O5。它对脑型及抗氯喹恶性疟疾有特殊疗效。世界市场青蒿素主要来源于中国和越南，由于受气侯、种质退化等多种因素影响，远远不能满足对青蒿资源的要求。利用植物组织、器官培养来生产青蒿素是目前青蒿素研究的热点之一，自80年代以来，对植物组织、器官培养生产青蒿素已进行了较多的研究。已经在青蒿愈伤组织、悬浮细胞、芽和毛状根等培养体系中进行了青蒿素合成的探索。采用青蒿器官(毛状根和丛生芽)大规模培养将成为解决青蒿素生产中青蒿资源匮乏的有效途径之一，但传统的青蒿器官培养方法，由于所培养的青蒿器官的生物量和青蒿素含量较低而使得青蒿素生产成本高居高不下，限制了青蒿素的生产。
研究表明，在未分化的青蒿植物组织中不含或含有极低水平的青蒿素，而一定的组织分化则可促进青蒿素的合成。在对青蒿的愈伤组织、带芽的愈伤组织和由愈伤组织分化产生的小植株中青蒿素合成的分析，可以得出青蒿愈伤组织中不含青蒿素，在愈伤组织伴随芽分化形成时，检测到青蒿素的含量约为干重的0.008％，而在分化苗长成的植株中青蒿素的含量达到干重的0.92％，高于野生植株(贺锡纯等，植物学报，1983，25，87-90.)；在进行青蒿愈伤组织悬浮培养时，在愈伤组织中未检测到青蒿素的存在，但在悬浮培养液中检测到微量的青蒿素(8ug/mL)(Nair MSR，et al，J.Nat.Prod.，1983，49，504-507.)。同样在Brown(Brown G D，J.Nat.Prod.，1994，57，975～977.)的研究中也证实了青蒿的愈伤组织中不含萜类，但在分化的芽中检测到和亲本相似的萜类合成物。在研究青蒿悬浮细胞培养时，在培养物中没有检测到青蒿素的合成，但在培养液的正己烷提取物中检测到抗疟的活性(Tawfiq N K，et al，Plant cell Rep.，1989，8，425～428.)。在新诱导的青蒿愈伤组织中检测到青蒿素的含量约为干重的0.1-0.08％，此培养物经三次继代培养后，愈伤组织内青蒿素的含量几乎难以检测到(Paniego N B，et al，Plant Cell Tiss.Org.Cult.，1994，36，163～168.)。
通过青蒿器官生长及代谢产物合成过程调控，利用转基因植物均可能显著提高青蒿素含量，增加青蒿素产量。诱导的青蒿芽培养物中可检测到青蒿素的存在，并对营养物和激素对青蒿芽生长和青蒿素的影响进行研究，发现赤霉素和水解酪蛋白等对芽中青蒿素的合成具有强的刺激作用(Woerdenbag H J，et al，PlantCell Tiss.Org.Cult.，1993，32，247～257.)。转基因的青蒿芽培养物中其青蒿素含量稳定，约为干重的0.02％，改进培养基中的各种金属离子和复合维生素对芽中青蒿素的合成影响不明显，但添加赤霉素使得芽中青蒿素的含量提高了3～4倍(Paniego N B，et al，Enzyme Micro.Tech.，1996，18，526～530.)。用发根农杆菌1601成功转化青蒿幼茎获得毛状根培养物，提供了以发根农杆菌作为基因载体进行青蒿的遗传改造的可行性(秦明波等，植物学报，1994，36，165～170.)。同时，利用发根农杆菌15834感染青蒿的芽尖和叶片，获得青蒿毛状根培养物，并且检测到青蒿素的含量约为干重的0.43％，其含量远高于其它青蒿组织培养物中青蒿素的含量(Weathers P J，et al，Biotechnol.Lett.，1994，16，1281～1286.)。利用发根农杆菌1601感染青蒿叶片建立了毛状根培养系，并在培养物中检测到青蒿素，在添加赤霉素的条件下青蒿素的含量约为干重的0.2％(蔡国琴等，生物工程学报，1995，11，315～320.)。利用根癌农杆菌感染青蒿叶片，获得转基因植株中青蒿素含量约为干重0.17％，青蒿素合成前体青蒿素B的含量约为0.22％(Vergauwe A，et al，Plant Cell Rep.，1996，15，929～933.)。但以上青蒿组织的培养方法都存在着所得青蒿器官生物量和青蒿素含量比较低的缺陷，严重地限制了青蒿素的生产。
某些稀土元素在适宜的浓度下具有植物细胞、组织及器官快速生长和次生代谢产物合成所需的多种生理功能，如可提高光合作用效率，促进组织分化以及对营养物的吸收利用等；
不同的稀土元素在植物中所起到的作用不同，只有轻稀土中的部份元素，如镧、铈、钕、镨、钐、铕等，能促进植物生长；相反，有的重稀土元素，如钇等，甚至具有遗传毒性(芳能虎，何友昭，赵贵文，稀土元素的植物生理作用研究进展，稀土，1998，19(5)66-70)；
适宜浓度的稀土化合物对植物生长具有刺激促进作用，但不同的稀土元素对植物生长的影响不同。低浓度的稀土元素能促进种子萌发、生根及植株生长，其生理作用机制一般认为与酶有关(杨家朴、张淑媛。稀土元素对起稿小麦抗逆性的初步研究。中国稀土学报，1986，4(4)67)。尽管稀土本身是否属于植物必须营养元素这一点尚未得到确证，但许多研究已表明稀土元素在一定条件下确有促进植物对养份的吸收、转化和利用等生理活性；稀土元素对植物体内营养代谢也有明显的促进作用；一些研究认为，稀土离子能取代Ca2+在细胞膜上的位置，这对维持细胞膜的稳定性及对养分的吸收、运转均起了一定的促进作用；但高浓度稀土元素会破坏细胞膜的稳定性，使膜通透性增大，造成细胞质内K+等营养离子流失，植物营养代谢受阻；
稀土元素对植物的光合作用有明显的影响，但同时亦证明高浓度稀土对植物光合作用有抑制作用；一定浓度的稀土可促进植物PSII蛋白复合体活性及光电子传递的速率，从而促进光能转换和光化学反应过程；高浓度稀土的抑制作用可能是因为稀土离子在与Mg2+发生竞争吸附而取代Mg2+，以致影响叶绿素的合成；稀土元素对植物的抗逆性也有一定影响，可以提高植株的保水和耐高温能力，还能增强植物的抗病能力；
高浓度稀土能促使植物气孔关闭，抑制蒸腾作用，从而降低植物的代谢活动或使其失调。高浓度稀土可与ATP形成络合物，从而抑制己糖激酶的催化反应而使糖酵解受阻，导致体内可溶性糖增加，质膜通透性增大，电解质和细胞质外渗，从而降低和破坏植株的抗逆抗病能力；
稀土元素在植物生长中的生理作用已逐渐引起了植物细胞工程人员的重视，也进行了一定的研究，如在长春花细胞悬浮培养的前指数期加入硝酸镧无论对细胞的生长和次生代谢物的积累均有促进作用(元英进，胡宗定，稀土元素对长春花植物细胞培养的影响，稀土，1993，14(3)38-40)；La3+在墨兰根状茎细胞器的发育过程中是通过膜上受体产生第二信息后调节其发育(罗虹，陈汝民，La3+对墨兰根状茎某些细胞器发育的影响，热带亚热带植物学报，1996，4(3)56-59)；在红豆杉细胞悬浮培养生产紫杉醇中，镧、铈的加入能明显改变细胞生长模式，而且有利于紫杉醇的合成和释放(元英进，胡国武，王传贵，等，镧、铈对红豆杉细胞生长及紫杉醇合成与释放的影响，中国稀土学报，1998，16(1)56-60)；在发菜细胞培养中加入镧不但能促进其生长，而且还改变了氨基酸含量(刘世名，梁世中，镧对发菜细胞培养及氨基酸成分的影响，中国稀土学报，1999，17(1)60-64)；
但稀土元素在植物器官(特别是青蒿器官)培养方面的应用还未见报道，随着植物细胞大规模培养技术的不断进步，稀土元素在植物组织、器官培养中将显示越来越巨大的潜力。
本发明的目的在于克服上述诸多青蒿器官培养方法中存在的缺陷，而提供一种可大幅度地提高青蒿器官的生物量和青蒿素含量的培养方法。
本发明的技术方案如下
本发明提供的提高青蒿器官生物量和青蒿素含量的培养方法，其特征在于，步骤如下
(1)配制液体或固体培养基
A.液体培养基配制在MS液体培养基中添加20-30g/L的蔗糖，0或0.5mg/L的6-BA，0或0.05mg/L的NAA；再加入含单一或混合稀土元素化合物溶液，并进行高压蒸汽灭菌处理；所加入的单一或混合稀土元素在培养基中的含量为0.0001-0.5mmol/L；
B.固体培养基配制在上述液体培养基中加入6-10g/L琼脂；
(2)将青蒿器官接入上述液体或固体培养基中培养20-30天；其培养温度为25-30℃，光照为2000-5000lux；
所述的单一或混合稀土元素的化合物包括镧、铈、镨、钕或钐的硝酸盐、氯化物、氧化物；所述的青蒿器官为青蒿芽或青蒿毛状根。
使用本发明提供的方法对青蒿器官进行培养，由于所得培养物生物量和青蒿素含量的大幅度提高，不仅可解决青蒿素生产中青蒿资源匮乏的难题，而且可提高青蒿素生产量，并降低青蒿素生产的成本；由于本发明使用的培养基中加入了价格低廉的稀土元素化合物，减少甚至省去NAA、6-BA激素的用量，进一步降低了青蒿素生产的成本，在青蒿器官生物量增加和青蒿素含量增加的双重作用下，青蒿素生产的产量能显著提高，成本降低。
本发明的实践证明在青蒿器官(毛状根和丛生芽)生长和青蒿素合成过程中，适量的稀土元素能够显著提高青蒿的产量和青蒿素的含量；稀土元素的这种促进作用与其对青蒿器官细胞膜渗透性的影响，促进营养物吸收代谢，调节细胞内外水份平衡有关；与清除青蒿器官生长环境和青蒿体内的活性氧有关；与稀土元素具有的细胞分裂素作用，促进青蒿器官快速生长有关；由于青蒿器官分化程度及快慢与青蒿素合成呈正相关，因此稀土元素的加入同时又显著地提高了青蒿器官中的青蒿素含量；在青蒿器官生物量增加和青蒿素含量增加的双重作用下，青蒿器官培养的青蒿素产量能显著提高。
青蒿器官(毛状根和丛生芽)的生长和青蒿素的合成存在相关性，器官的分化是青蒿素合成的重要条件之一。在培养基中加入稀土硝酸盐、氯化物、硫酸盐等同培养基一起灭菌，或者先将稀土溶液调到一定pH值，在培养过程中通过除菌过滤器加入培养基中。稀土元素的加入量一般在0.0001-0.5mmol/L，每一种不同的单一稀土或混合稀土元素适宜的浓度范围有所差别，而且相同的稀土元素针对毛状根或丛生芽亦有所不同。
下面结合实施例进一步描述本发明
实施例1用本发明的方法进行青蒿芽培养，其步骤如下
1.配制下列四种固体培养基
配制固体培养基1在MS液体培养基中添加20g/L的蔗糖，0.5mg/L 6-BA，0.05mg/LNAA；再加入三氧化二镧的硝酸溶液和8g/L琼脂，镧在该固体培养基中的浓度0.1mmol/L；
配制固体培养基2在MS液体培养基中添加20g/L的蔗糖，0.5mg/L 6-BA，0.05mg/L NAA；再加入铈的氧化物硝酸溶液和8g/L琼脂，铈在该固体培养基中的浓度0.5mmol/L；
配制固体培养基3在MS液体培养基中添加20g/L的蔗糖，0.5mg/L 6-BA，0.05mg/L NAA；再加入三氯化二钕水溶液和8g/L琼脂，钕在该固体培养基中的浓度0.05mmol/L；
配制固体培养基4在MS液体培养基中添加20g/L的蔗糖，0.5mg/L 6-BA，0.05mg/L NAA；再加入混合稀土Re氧化物硝酸溶液溶液和8g/L琼脂，Re在该固体培养基中的浓度0.04mmol/L；这里的Re氧化物的成分及含量(W/W)La2O371.5％+CeO2 25.9％+Pr6O112.44％+Sm2O30.3％；
2.将青蒿芽分别接入上述四种固体培养基中，在25℃，光照3000lux条件下，培养30天，其结果如下
在固体培养基1中培养，所得培养物生物量较对照组(在相同培养条件下，用常规MS固体培养基进行青蒿芽培养简称“对照组”)增加80％，青蒿素含量较对照组增加124％，单位体积青蒿素产量较对照组提高了305％；
在固体培养基2中培养，所得培养物的生物量较对照组增加1.3倍，青蒿素含量较对照组增加近1.5倍，单位体积青蒿素产量较对照提高了4.7倍；
在固体培养基3中培养，所得培养物的生物量较对照组增加70.9％，青蒿素含量较对照组增加160％，单位体积青蒿素产量较对照组提高了270.9％；
在固体培养基4中培养，所得培养物的生物量较对照组增加了155.5％，青蒿素含量较对照组增加87.8％，单位体积青蒿素产量较对照组提高了260.4％。
实施例2用本发明的方法进行青蒿芽培养，其步骤如下
1.配制下列四种液体培养基
液体培养基1的配制不含琼脂，镧在该液体培养基中的浓度为0.008mmol/L，其它组份和含量与实施例中的固体培养基1相同；
液体培养基2的配制不含琼脂，铈在该液体培养基中的浓度为0.002mmol/L，其它组份和含量与实施例中的固体培养基2相同；
液体培养基3的配制不含琼脂，钕在该液体培养基中的浓度为0.002mmol/L，其它组份和含量与实施例中的固体培养基3相同；
液体培养基4的配制不含琼脂，Re(La2O371.5％+CeO225.9％+Pr6O112.44％+Sm2O30.3％。)在该液体培养基中的浓度为0.008mmol/L，其它组份和含量与实施例中的固体培养基3相同；
2.将青蒿芽分别接入上述四种液体培养基中，在30℃，光照5000lux的条件下，培养20天，其结果如下
在液体培养基1中培养，所得培养物的生物量较对照组提高89％；青蒿素含量较对照组提高43％；青蒿素单位体积产量在较对照组提高154.5％；
在液体培养基2中培养，所得培养物的生物量较对照组提高73％，青蒿素含量较对照组提高5％，青蒿素单位体积产量较对照组提高82％；
在液体培养基3中培养，所得培养物的生物量较对照组提高67.6％，青蒿素含量较对照组提高19.6％，青蒿素单位体积产量较对照组提高104.3％；
在液体培养基4中培养，所得培养物的生物量较对照组提高74％，青蒿素含量较对照组提高55.4％，青蒿素单位体积产量较对照组提高169.46％。
实施例3本实施例所配制的培养基中，各稀土元素浓度分别见表1至表4，其余组份同实施例2，在培养温度28℃，光照4000lux下，培养25天，其结果如表1至表4所示
表1为稀十元素为镧时的实验结果
表2为稀土元素为铈时的实验结果
表3为稀土元素为钕时的实验结果
表4为稀土元素为混合稀土Re是的实验结果
实施例4本实施例所配四种培养基中，蔗糖的含量均为3％，稀土元素浓度分别为0.04mmol/L镧(培养基1中)、0.005mmol/L铈(培养基2中)、0.01mmol/L钕(培养基3中)、0.04mmol/L混合稀土Re(培养基4中)，培养基中其它组份及含量同实施例2，在28℃，光照4000lux的条件下，于2.5升反应器中培养青蒿芽25天，其结果如下
在培养基1中培养，可使培养物的生物量较对照组提高了15％，青蒿素含量较对照组提高10.8％，单位体积青蒿素产量较对照组提高24.4％；
在培养基2中培养，可使培养物的生物量较对照组提高14.3％，青蒿素含量较对照组提高2.5％，单位体积青蒿素产量较对照组提高17.03％；
在培养基3中培养，可使培养物的生物量较对照组提高15.9％，青蒿素含量较对照组提高0.10％；单位体积青蒿素产量较对照组提高16.03％；
在培养基4中培养，可使培养物的生物量较对照组提高16.8％，青蒿素含量较对照组提高3.61％，单位体积青蒿素产量较对照组提高17.78％。
实施例5本实施例配制的四种液体培养基是在MS液体培养基(含3％蔗糖，0.4g/L NH4NO3，2.02g/L KNO3，0.204g/L KH2PO4，0.37g/L MgSO4.7H2O，0.33g/LCaCl2)中分别加入稀土元素，所加入的稀土元素浓度液体培养基1中镧为0.04mmol/L；在液体培养基2中铈为0.01mmol/L；在液体培养基3中钕为0.01mmol/L；在液体培养基4中混合稀土Re(La2O371.5％+CeO225.9％+Pr6O112.44％+Sm2O30.3％。)为0.04mmol/L；在28℃，3000lux光照条件，摇瓶培养青蒿毛状根，培养时间为25天，其结果如下
在液体培养基1中培养时，培养物单位体积青蒿素产量较对照组提高110.2％；
在液体培养基2中培养时，培养物单位体积青蒿素产量较对照组增加118.73％；
在液体培养基3中培养时，培养物单位体积青蒿素产量较对照组提高79.2％；
在液体培养基4中培养时，培养物单位体积青蒿素产量较对照组提高56.72％。
实施例6本实施例配制的四种培养基中，蔗糖浓度为5％，稀土元素浓度分别为0.1mmol/L镧(培养基1中)、0.05mmol/L铈(培养基2中)、0.03mmol/L钕(培养基3中)、0.02mmol/L混合稀土Re(培养基4中)，其余组份及含量同实施例5，在培养温度28℃，光照4000lux下，在2.5升反应器中培养青蒿毛状根25天，其结果如下
在培养基1中培养时，培养物单位体积青蒿素产量较对照组提高42.2％；
在培养基2中培养时，培养物单位体积青蒿素产量较对照组提高48.32％；
在培养基3中培养时，培养物单位体积青蒿素产量较对照组提高45.77％；
在培养基4中培养时，培养物单位体积青蒿素产量较对照组提高28.1％。
权利要求
1.一种提高青蒿器官生物量和青蒿素含量的培养方法，其特征在于，步骤如下
(1)配制液体或固体培养基
A.液体培养基配制在MS液体培养基中添加20-50g/L的蔗糖，0或0.5mg/L
的6-BA，0或0.05mg/L的NAA；再加入含单一或混合稀土元素化合物溶液，
并进行高压蒸汽灭菌处理；所加入的单一或混合稀土元素在液体培养基中的
含量为0.0001-0.5mmol/L；
B.固体培养基配制在上述液体培养基中加入6-10g/L琼脂；
(2)将青蒿器官接入上述液体或固体培养基中，在温度为25-30℃，光照为2000-5000lux的条件下，培养20-30天。
2.按权利要求1所述的提高青蒿器官生物量和青蒿素含量的培养方法，其特征在于所述的单一或混合稀土元素的化合物包括镧、铈、镨、钕或钐的硝酸盐、氯化物、氧化物；
3.按权利要求1所述的提高青蒿器官生物量和青蒿素含量的培养方法，其特征在于所述青蒿器官为青蒿芽或青蒿毛状根。
全文摘要
本发明涉及的提高青蒿器官生物量和青蒿素含量的培养方法在对传统的MS培养基进行改进后，再加入单一/混合稀土元素化合物，所述单一或混合稀土元素的化合物包括镧、铈、镨、钕或钐的硝酸盐、氯化物、氧化物，减少或替代培养基中NAA、6－BA激素，在这种培养基对青蒿器官进行固体或液体培养，可大幅度提高培养物生物量和青蒿素含量，解决青蒿素生产中青蒿资源匮乏的难题，提高青蒿素的产量，降低青蒿素生产成本。
文档编号C07D493/00GK1392252SQ01115980
公开日2003年1月22日 申请日期2001年6月15日 优先权日2001年6月15日
发明者王玉春, 赵兵, 杨成砚, 欧阳藩 申请人:中国科学院化工冶金研究所