一种质子泵抑制剂的新用途的制作方法

本发明涉及化合物及其应用领域，尤其是一种质子泵抑制剂的新用途。

背景技术：

legumain即天冬酰胺内肽酶，是溶酶体半胱氨酸蛋白酶c13家族的成员，legumain首先在植物中被发现，随后在血吸虫中和哺乳动物中陆续被发现，其在生物物种中高度保守，存在于细胞内膜泡，例如溶酶体、内吞体，以及细胞表面和细胞外基质中。

legumain的酶原前体为56kd的未活化形式，ph的改变启动其自身催化转变为具有活性形式的46kd的成熟酶。在溶酶体内，c端可由46kd成熟酶经蛋白酶的剪切生成36kd的成熟酶，这种酶在形成46kd和36kd中活性是一致的。legumain(aep)在溶酶体降解系统的过程中起到重要作用，并帮助抗原呈递，在legumain敲除鼠的肾脏的溶酶体中的cathepsins的作用消失，导致大分子蛋白在溶酶体内的残留，并导致溶酶体的功能紊乱。legumain作为一种蛋白酶，能专一的水解天冬酰胺残基羧基端的肽键，除了蛋白降解功能外，它还能水解活化某些前体蛋白(酶原和激素原)，或激活其他蛋白水解酶系统而使其发挥作用，进而参与机体的多种生理活动。

哺乳动物legumain参与了机体的免疫、溶骨及肿瘤发生等多个病理生理过程。legumain在肿瘤中过表达首先在2003年得到报道，研究发现多种鼠肿瘤细胞株高度表达。用免疫组织化学的方法还检测了人正常组织及多种肿瘤组织，结果显示在正常组织中，legumain表达稀少，而在很多实体瘤组织中高表达，包括乳腺、结肠、肺、前列腺、卵巢肿瘤和中枢神经系统恶性肿瘤，其中前列腺癌表达量最高，大部分乳腺癌和结肠癌阳性表达，而所有的中枢神经系统恶性肿瘤都是阳性表达。有相关研究发现天冬酰胺内肽酶(legumain)在乳腺癌组织中高表达而在legumain正常乳腺组织中低表达，并且高表达legumain是乳腺癌预后较差的指标。其次，高表达legumain的细胞系其侵袭转移能力增强。legumain其独特的生物学特性，提示我们legumain的病理及病理生理功能可能在肿瘤的发展以及浸润、转移过程中发挥重要作用。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种质子泵抑制剂的新用途。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种质子泵抑制剂，5-甲氧基-2-[(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基)甲基亚磺酰基]苯并咪唑-1-基镁埃索美拉唑镁(购自selleck公司)，具有式(i)所示结构：

上述质子泵抑制剂在制备legumain蛋白酶活性抑制药物方面的用途。

上述质子泵抑制剂抑制legumain蛋白酶活性的用途是利用legumain以及其特异性底物构建的筛选抑制剂体系筛选获得的，该小分子化合物能明显抑制乳腺癌细胞中legumain的蛋白酶活性、抑制癌细胞侵袭能力，此外该化合物能明显抑制乳腺癌细胞的侵袭能力。

上述质子泵抑制剂在制备抗肿瘤药物方面的用途。

上述质子泵抑制剂在制备乳腺癌抑制药物方面的用途。

本发明的有益效果是：

上述质子泵抑制剂利用legumain以及其特异性底物构建的筛选抑制剂体系对小分子化合物库进行筛选发现一种小分子化合物，所述小分子化合物为质子泵抑制剂5-甲氧基-2-[(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基)甲基亚磺酰基]苯并咪唑-1-基镁埃索美拉唑镁，能有效的抑制legumain蛋白酶活性。活性检测实验表明该化合物可以明显抑制乳腺癌细胞mda-mb-231中legumain的活性。mtt实验显示该化合物在低浓度下对正常肝细胞以及mda-mb-231细胞无毒性。transwell实验显示该化合物随着浓度的增加可以抑制mda-mb-231细胞的侵袭能力。这些结果都说明该化合物可以抑制legumain的蛋白酶活性，抑制癌细胞的侵袭能力，并可作为一种以legumain为靶点的抗肿瘤药物。

附图说明

图1为本发明利用具备活性的legumain筛选抑制legumain蛋白酶活性的小分子化合物结果，i号药物即为本发明所述药物。结果说明，i号药物即为有效抑制legumain蛋白酶活性的药物。

图2为本发明通过legumain活性检测体系检测本发明所述药物对mda-mb-231细胞中legumain活性的抑制效果。结果说明，i号药物即为本发明所述药物能抑制乳腺癌细胞内legumain的活性。

图3为本发明利用transwell实验检测本发明所述药物对mda-mb-231细胞侵袭能力的抑制效果。结果说明，i号药物即为本发明所述药物能明显抑制mda-mb-231细胞的侵袭能力。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。

实施例1

(1)体外筛选legumain的小分子抑制剂

①先配置体外筛选药物体系需要用到的缓冲液，activationbuffer:50mm醋酸钠,100mmnacl,ph4.0，assaybuffer:50mmmes,250mmnacl,ph5.0。

②将表达出的legumain蛋白稀释于avtivationbuffer至终浓度为100μg/ml，37℃保温2h进行活化。

③将活化后的legumain蛋白加到assaybufer中至终浓度为1ng/μl。

④将从国肽公司合成的荧光底物z-ala-ala-asn-amc稀释到200μm。

⑤取96孔黑板，向每个孔中加入30μllegumain，30μl荧光底物，30μl不同浓度(60nm、70nm、80nm、100nm、200nm)的化合物i，对照空只加入60μlassaybuffer和30μl荧光底物。

⑥通过酶标仪在380nm处的激发波和460nm处的发射波下测取荧光值。图1结果显示i号药物可以抑制legumain蛋白的活性。

(2)化合物i对mda-mb-231细胞中legumain活性的影响

①先配置体外筛选药物体系需要用到的缓冲液，0.1％chaps裂解液，assaybuffer:50mmmes,250mmnacl,ph5.0。

②收集mda-mb-231细胞并用0.1％chaps裂解液冰上裂解1h，15min混匀一次。

③8000rpm/min离心10min，取上清于新的离心管中。

④可先通过加入不同量的蛋白裂解液(2μl、4μl、8μl、16μl)用assaybuffer补足体系到30μl，再加入30μl200μm的荧光底物，通过酶标仪在380nm处的激发波和460nm处的发射波下测取荧光值。通过这个预实验检测确定合适的蛋白浓度。

⑤用assaybuffer稀释蛋白裂解液至上述相应浓度，将荧光底物稀释到200μm。

⑥取96孔黑板，向每个孔中加入30μllegumain，30μl荧光底物，30μl不同浓度的小分子抑制剂(0.4μm、0.8μm、1.6μm)，对照空只加入60μlassaybuffer和30μl荧光底物。

⑦通过酶标仪在380nm处的激发波和460nm处的发射波下测取荧光值。图2结果显示化合物i可以抑制mda-mb-231细胞中legumain蛋白的活性。

(3)检测化合物i对mda-mb-231细胞侵袭能力的影响

①冰上过夜融化matrigel胶，用预冷的无血清培养基按照1:8的比例进行稀释matrigel胶。

②取出transwell小室放入24孔板中，取40μl(可根据细胞类型进行调整)稀释后的matrigel缓慢滴入小室底部，使其铺平底部。放入37℃培养箱中4h使其凝固。

③用含有10％胎牛血清的培养基进行mda-mb-231细胞重悬，计数，5万个细胞/200μl，加入600μl含有20％胎牛血清的培养基于transwell下室中。

④4个小时等mda-mb-231细胞沉到小室底部时将上室中10％胎牛血清的培养基更换为含有不同浓度化合物i(2.5μm、5μm、10μm)的培养基，放入培养箱中培养48h。

⑤取出小室，用pbs洗三次，3min/一次。

⑥用4％的多聚甲醛避光固定20min，取蒸馏水洗涤2次，2min/一次。

⑦用棉签小心除去transwell小室内部未侵入的细胞。

⑧用0.1％结晶紫染色15min，然后用pbs进行清洗。

⑨用显微镜进行拍照分析，每个样本随机选出3-5个视野进行拍照，随后计数。最后与对照进行比较分析。图3结果显示随着化合物i浓度的增加，mda-mb-231侵袭能力逐渐减弱。

上述化合物i的结构式为：

上述参照实施例对该一种质子泵抑制剂的新用途进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。