一种磷酸钙骨水泥复合微球及其制备方法和应用与流程

本发明涉及骨修复材料技术领域，具体涉及一种磷酸钙骨水泥复合微球及其制备方法和应用。

背景技术：

磷酸钙骨水泥(calciumphosphatecement，cpc)于上世纪90年代由brown和chow研制成功，是一种具有自固化性的非陶瓷型羟基磷灰石类人工骨材料。它由固相粉末和固化液按照一定的比例混合后形成易塑形的浆体，在短时间内自固化，最终的水化产物为与人体骨组织的无机成分和晶体结构相似的磷灰石。cpc具有良好的骨传导性和生物相容性，在手术中可任意塑形，填充各种形状的骨缺损，在骨缺损修复、颌面外科修复和药物载体等领域得到了广泛应用。

与块状的磷酸钙骨修复材料相比，磷酸钙微球具有更好的流动性和优异的填充性能，能够在形状规则或不规则的骨缺损部位实现良好的填充和修复，同时，磷酸钙微球在填充过程中，微球堆积形成相互连通的孔隙结构，有利于骨组织的长入和血管的生成。磷酸钙微球可以通过液滴冷凝法、喷雾干燥法、模板法和乳液法等方法制备获得，传统的磷酸钙陶瓷类微球需经高温烧结处理，不利于负载药物和生物活性成分，且经高温烧结处理后的微球降解速率较慢，而高分子为基体的磷酸钙微球力学性能不足，且缺乏骨传导性和骨诱导性。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种磷酸钙骨水泥复合微球及其制备方法和应用，提高磷酸钙骨水泥微球的强度、降解性和细胞相容性。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种磷酸钙骨水泥复合微球的制备方法，包括以下步骤：

(1)将羧甲基壳聚糖溶于去离子水中，并加入浓度为10～20wt％的丝素蛋白溶液，混合均匀后，得到混合溶液；

(2)在步骤(1)的混合溶液中加入磷酸钙骨水泥固相粉末，混合溶液与磷酸钙固相粉末的液固比为1ml:0.4～1g，搅拌均匀后得到磷酸钙骨水泥浆料；

(3)将磷酸钙骨水泥浆料注入注射器中，并逐滴加到液氮中，形成冷冻复合微球；

(4)将冷冻复合微球放入温度为30℃～40℃，相对湿度为95％～100％的环境中水化1～4天后，在30℃～40℃干燥，得到所述磷酸钙骨水泥复合微球。

本发明中通过采用丝素蛋白和羧甲基壳聚糖复配，以磷酸钙骨水泥固相粉末作为原料，并结合液滴冷凝法，制备得到磷酸钙骨水泥复合微球，制备方法简单，无需高温烧结，所述磷酸钙骨水泥复合微球具有较高的强度，良好的抗崩解性、降解性和细胞相容性，在骨修复和药物载体领域具有良好的应用前景。

作为本发明所述的磷酸钙骨水泥复合微球的制备方法的优选实施方式，所述注射器的针头直径为0.5～1mm。

本发明通过控制针头直径可以调整所述磷酸钙骨水泥微球的粒径。

作为本发明所述的磷酸钙骨水泥复合微球的制备方法的优选实施方式，所述混合溶液中丝素蛋白的质量分数为2％～5％；所述混合溶液中羧甲基壳聚糖的质量分数为0.5％～2％。

作为本发明所述的磷酸钙骨水泥复合微球的制备方法的优选实施方式，所述混合溶液中丝素蛋白和羧甲基壳聚糖的质量比为2:1。

作为本发明所述的磷酸钙骨水泥复合微球的制备方法的优选实施方式，所述混合溶液中丝素蛋白和羧甲基壳聚糖的质量比为3:1。

丝素蛋白和羧甲基壳聚糖的加入，一方面能够形成三维空间网络结构，有效提高磷酸钙骨水泥复合微球的力学强度，增强微球的抗崩解能力，另一方面，本发明的丝素蛋白和羧甲基壳聚糖，可以为骨髓间充质干细胞的生长提供附着位点，有利于骨髓间充质干细胞的生长，起到了诱导骨生长的作用。

作为本发明所述的磷酸钙骨水泥复合微球的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，混合溶液与磷酸钙固相粉末的液固比为1ml:0.6g。

作为本发明所述的磷酸钙骨水泥复合微球的制备方法的优选实施方式，所述固相粉末包括磷酸四钙、β-磷酸三钙、α-磷酸三钙、碳酸钙、磷酸氢钙、磷酸二氢钙、磷酸八钙、无定型磷酸钙中的至少一种

作为本发明所述的磷酸钙骨水泥复合微球的制备方法的优选实施方式，所述固相粉末包括α-磷酸三钙、掺锶磷酸八钙和/或掺锶无定形磷酸钙；所述固相粉末中，锶和钙的摩尔比为：锶：钙＝0.1～1.6：1；所述钙和锶之和与磷的摩尔比为：钙+锶：磷＝1.1～1.4:1。

作为本发明所述的磷酸钙骨水泥复合微球的制备方法的优选实施方式，所述固相粉末中，锶和钙的摩尔比为：锶：钙＝0.7～1.0:1；所述钙和锶之和与磷的摩尔比为：钙+锶：磷＝1.3:1。

掺锶磷酸八钙(sr-ocp)作为sr²⁺源能提高磷酸钙骨水泥复合微球的强度。不同sr²⁺源掺杂改性磷酸钙骨水泥复合微球，均能在tris缓冲溶液中缓慢的释放出sr²⁺。sr²⁺源对离子释放性能有影响，用掺锶磷酸八钙(sr-ocp)或掺锶无定形磷酸钙(sr-acp)改性磷酸钙骨水泥复合微球表现出更稳定、合适的离子释放速率，促进细胞增殖和成骨分化。

采用上述成分的磷酸钙骨水泥复合微球，不仅掺锶量、钙和锶之和与磷的摩尔比((钙+锶)/磷)可调，无毒副性以及且具有缓释具特殊药理功能的锶离子等优势，还具有无杂质及杂相离子、制备工艺相对简单、成本较低等特点，适合人体非承载部位骨的修复、替代、矫正及外科重建等领域。

作为本发明所述的磷酸钙骨水泥复合微球的制备方法的优选实施方式，所述丝素蛋白溶液通过以下方法制备所得：

将蚕丝于0.02～0.05mol/l的na2co3溶液中煮沸20～60min，用去离子水多次搓洗以除尽丝胶；烘干后溶于9～10mol/llibr溶液，在50℃～60℃溶解3～5h后，去离子水透析24～48h，离心去除丝素凝聚物，经浓缩或稀释后制得质量分数为10～20wt％的丝素蛋白溶液。

本发明还提供了一种根据上述方法制备得到的磷酸钙骨水泥复合微球。

本发明还提供了上述的磷酸钙骨水泥复合微球的应用，所述微球作为医用骨缺损填充材料或作用药物载体材料的应用。

本发明的微球具有较高的力学强度，以及优异的抗崩解性，合适的降解性，对小鼠骨髓间充质干细胞的细胞增殖和成骨分化具有促进作用，可作为医用骨缺损填充材料或作用药物载体材料，在骨修复和药物载体领域具有良好的应用前景。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明通过采用磷酸钙骨水泥作为原料，采用丝素蛋白和羧甲基壳聚糖复配，结合液滴冷凝法制备磷酸钙骨水泥复合微球，该磷酸钙骨水泥复合微球具有较高的强度，以及优异的抗崩解性、降解性和生物相容性，在骨修复和药物载体领域具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1～4和对比例1～2的磷酸钙骨水泥复合微球的细胞增殖结果。

图2为实施例1～4和对比例1～2的磷酸钙骨水泥复合微球的alp活性结果。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

作为本发明所述的磷酸钙骨水泥复合微球的制备方法的一种实施例，本实施例所述的磷酸钙骨水泥复合微球的制备方法包括以下步骤：

(1)将羧甲基壳聚糖溶于去离子水中，并加入质量分数为10～20wt％的丝素蛋白溶液，混合均匀后，得到混合溶液，所述混合溶液中丝素蛋白的质量分数为2％；所述混合溶液中羧甲基壳聚糖的质量分数为1％；

(2)在步骤(1)的混合溶液中加入磷酸钙骨水泥固相粉末，混合溶液与磷酸钙固相粉末的液固比为1ml:0.6g，搅拌均匀后得到磷酸钙骨水泥浆料；

(3)将磷酸钙骨水泥浆料注入注射器中，并逐滴加到液氮中，形成冷冻复合微球；

(4)将冷冻复合微球放入温度为37℃，相对湿度为98％的环境中水化3天后，在37℃干燥，得到所述磷酸钙骨水泥复合微球。

本实施例所述丝素蛋白溶液通过以下方法制备所得：

将蚕丝于0.02～0.05mol/l的na2co3溶液中煮沸20～60min，用去离子水多次搓洗以除尽丝胶；烘干后溶于9～10mol/llibr溶液，在50℃～60℃溶解3～5h后，去离子水透析24～48h，离心去除丝素凝聚物，经浓缩或稀释后制得质量分数为10～20wt％的丝素蛋白溶液。

本实施例所述固相粉末由磷酸四钙和磷酸氢钙按摩尔比1:1混合组成。

实施例2

作为本发明所述的磷酸钙骨水泥复合微球的制备方法的一种实施例，本实施例所述的磷酸钙骨水泥复合微球的制备方法包括以下步骤：

(1)将羧甲基壳聚糖溶于去离子水中，并加入质量分数为10～20wt％的丝素蛋白溶液，混合均匀后，得到混合溶液，所述混合溶液中丝素蛋白的质量分数为3％；所述混合溶液中羧甲基壳聚糖的质量分数为1％；

(2)在步骤(1)的混合溶液中加入磷酸钙骨水泥固相粉末，混合溶液与磷酸钙固相粉末的液固比为1ml:0.6g，搅拌均匀后得到磷酸钙骨水泥浆料；

(3)将磷酸钙骨水泥浆料注入注射器中，并逐滴加到液氮中，形成冷冻复合微球；

(4)将冷冻复合微球放入温度为37℃，相对湿度为98％的环境中水化3天后，在37℃干燥，得到所述磷酸钙骨水泥复合微球。

本实施例所述丝素蛋白溶液通过以下方法制备所得：

将蚕丝于0.02～0.05mol/l的na2co3溶液中煮沸20～60min，用去离子水多次搓洗以除尽丝胶；烘干后溶于9～10mol/llibr溶液，在50℃～60℃溶解3～5h后，去离子水透析24～48h，离心去除丝素凝聚物，经浓缩或稀释后制得质量分数为10～20wt％的丝素蛋白溶液。

本实施例所述固相粉末包括α-磷酸三钙、掺锶磷酸八钙和/或掺锶无定形磷酸钙；所述固相粉末中，锶和钙的摩尔比为：锶：钙＝0.7：1；所述钙和锶之和与磷的摩尔比为：钙+锶：磷＝1.3:1。

实施例3

作为本发明所述的磷酸钙骨水泥复合微球的制备方法的一种实施例，本实施例所述的磷酸钙骨水泥复合微球的制备方法包括以下步骤：

(1)将羧甲基壳聚糖溶于去离子水中，并加入质量分数为10～20wt％的丝素蛋白溶液，混合均匀后，得到混合溶液，所述混合溶液中丝素蛋白的质量分数为4％；所述混合溶液中羧甲基壳聚糖的质量分数为1％；

(2)在步骤(1)的混合溶液中加入磷酸钙骨水泥固相粉末，混合溶液与磷酸钙固相粉末的液固比为1ml:0.6g，搅拌均匀后得到磷酸钙骨水泥浆料；

(3)将磷酸钙骨水泥浆料注入注射器中，并逐滴加到液氮中，形成冷冻复合微球；

(4)将冷冻复合微球放入温度为37℃，相对湿度为98％的环境中水化3天后，在37℃干燥，得到所述磷酸钙骨水泥复合微球。

本实施例所述丝素蛋白溶液通过以下方法制备所得：

将蚕丝于0.02～0.05mol/l的na2co3溶液中煮沸20～60min，用去离子水多次搓洗以除尽丝胶；烘干后溶于9～10mol/llibr溶液，在50℃～60℃溶解3～5h后，去离子水透析24～48h，离心去除丝素凝聚物，经浓缩或稀释后制得质量分数为10～20wt％的丝素蛋白溶液。

本实施例所述固相粉末包括α-磷酸三钙、掺锶磷酸八钙和/或掺锶无定形磷酸钙；所述固相粉末中，锶和钙的摩尔比为：锶：钙＝0.7：1；所述钙和锶之和与磷的摩尔比为：钙+锶：磷＝1.3:1。

实施例4

作为本发明所述的磷酸钙骨水泥复合微球的制备方法的一种实施例，本实施例所述的磷酸钙骨水泥复合微球的制备方法包括以下步骤：

(1)将羧甲基壳聚糖溶于去离子水中，并加入质量分数为10～20wt％的丝素蛋白溶液，混合均匀后，得到混合溶液，所述混合溶液中丝素蛋白的质量分数为2％；所述混合溶液中羧甲基壳聚糖的质量分数为2％；

(2)在步骤(1)的混合溶液中加入磷酸钙骨水泥固相粉末，混合溶液与磷酸钙固相粉末的液固比为1ml:0.6g，搅拌均匀后得到磷酸钙骨水泥浆料；

(3)将磷酸钙骨水泥浆料注入注射器中，并逐滴加到液氮中，形成冷冻复合微球；

(4)将冷冻复合微球放入温度为37℃，相对湿度为98％的环境中水化3天后，在37℃干燥，得到所述磷酸钙骨水泥复合微球。

本实施例所述丝素蛋白通过以下方法制备所得：

本实施例所述丝素蛋白溶液通过以下方法制备所得：

将蚕丝于0.02～0.05mol/l的na2co3溶液中煮沸20～60min，用去离子水多次搓洗以除尽丝胶；烘干后溶于9～10mol/llibr溶液，在50℃～60℃溶解3～5h后，去离子水透析24～48h，离心去除丝素凝聚物，经浓缩或稀释后制得质量分数为10～20wt％的丝素蛋白溶液。

本实施例所述固相粉末包括α-磷酸三钙、掺锶磷酸八钙和/或掺锶无定形磷酸钙；所述固相粉末中，锶和钙的摩尔比为：锶：钙＝1：1；所述钙和锶之和与磷的摩尔比为：钙+锶：磷＝1.3:1。

实施例5

作为本发明所述的磷酸钙骨水泥复合微球的制备方法的一种实施例，本实施例所述的磷酸钙骨水泥复合微球的制备方法包括以下步骤：

(1)将羧甲基壳聚糖溶于去离子水中，并加入质量分数为10～20wt％的丝素蛋白溶液，混合均匀后，得到混合溶液，所述混合溶液中丝素蛋白的质量分数为4％；所述混合溶液中羧甲基壳聚糖的质量分数为2％；

(2)在步骤(1)的混合溶液中加入磷酸钙骨水泥固相粉末，混合溶液与磷酸钙固相粉末的液固比为1ml:0.4g，搅拌均匀后得到磷酸钙骨水泥浆料；

(3)将磷酸钙骨水泥浆料注入注射器中，并逐滴加到液氮中，形成冷冻复合微球；

(4)将冷冻复合微球放入温度为30℃，相对湿度为95％的环境中水化1天后，在30℃干燥，得到所述磷酸钙骨水泥复合微球。

本实施例所述丝素蛋白溶液通过以下方法制备所得：

将蚕丝于0.02～0.05mol/l的na2co3溶液中煮沸20～60min，用去离子水多次搓洗以除尽丝胶；烘干后溶于9～10mol/llibr溶液，在50℃～60℃溶解3～5h后，去离子水透析24～48h，离心去除丝素凝聚物，经浓缩或稀释后制得质量分数为10～20wt％的丝素蛋白溶液。

本实施例所述固相粉末包括α-磷酸三钙、掺锶磷酸八钙和/或掺锶无定形磷酸钙；所述固相粉末中，锶和钙的摩尔比为：锶：钙＝0.1：1；所述钙和锶之和与磷的摩尔比为：钙+锶：磷＝1.1:1。

实施例6

作为本发明所述的磷酸钙骨水泥复合微球的制备方法的一种实施例，本实施例所述的磷酸钙骨水泥复合微球的制备方法包括以下步骤：

(1)将羧甲基壳聚糖溶于去离子水中，并加入质量分数为10～20wt％的丝素蛋白溶液，混合均匀后，得到混合溶液，所述混合溶液中丝素蛋白的质量分数为3.5％；所述混合溶液中羧甲基壳聚糖的质量分数为0.5％；

(2)在步骤(1)的混合溶液中加入磷酸钙骨水泥固相粉末，混合溶液与磷酸钙固相粉末的液固比为1ml:1g，搅拌均匀后得到磷酸钙骨水泥浆料；

(3)将磷酸钙骨水泥浆料注入注射器中，并逐滴加到液氮中，形成冷冻复合微球；

(4)将冷冻复合微球放入温度为40℃，相对湿度为100％的环境中水化4天后，在40℃干燥，得到所述磷酸钙骨水泥复合微球。

本实施例所述丝素蛋白溶液通过以下方法制备所得：

将蚕丝于0.02～0.05mol/l的na2co3溶液中煮沸20～60min，用去离子水多次搓洗以除尽丝胶；烘干后溶于9～10mol/llibr溶液，在50℃～60℃溶解3～5h后，去离子水透析24～48h，离心去除丝素凝聚物，经浓缩或稀释后制得质量分数为10～20wt％的丝素蛋白溶液。

本实施例所述固相粉末包括α-磷酸三钙、掺锶磷酸八钙和/或掺锶无定形磷酸钙；所述固相粉末中，锶和钙的摩尔比为：锶：钙＝1.6：1；所述钙和锶之和与磷的摩尔比为：钙+锶：磷＝1.4:1。

对比例1

本对比例所述的磷酸钙骨水泥复合微球的制备方法包括以下步骤：

(1)在质量分数为3％的丝素蛋白溶液中加入磷酸钙骨水泥固相粉末，丝素蛋白溶液与磷酸钙固相粉末的液固比为1ml:0.6g，搅拌均匀后得到磷酸钙骨水泥浆料；

(2)将磷酸钙骨水泥浆料注入注射器中，并逐滴加到液氮中，形成冷冻复合微球；

(3)将冷冻复合微球放入温度为37℃，相对湿度为98％的环境中水化3天后，在37℃干燥，得到所述磷酸钙骨水泥复合微球。

本对比例所述丝素蛋白溶液通过以下方法制备所得：

将蚕丝于0.02～0.05mol/l的na2co3溶液中煮沸20～60min，用去离子水多次搓洗以除尽丝胶；烘干后溶于9～10mol/llibr溶液，在50℃～60℃溶解3～5h后，去离子水透析24～48h，离心去除丝素凝聚物，经浓缩或稀释后制得质量分数为10～20wt％的丝素蛋白溶液。

本对比例所述固相粉末包括α-磷酸三钙、掺锶磷酸八钙和/或掺锶无定形磷酸钙；所述固相粉末中，锶和钙的摩尔比为：锶：钙＝0.7：1；所述钙和锶之和与磷的摩尔比为：钙+锶：磷＝1.3:1。

对比例2

本对比例所述的磷酸钙骨水泥复合微球的制备方法包括以下步骤：

(1)将羧甲基壳聚糖溶于去离子水中，得到羧甲基壳聚糖溶液，所述羧甲基壳聚糖溶液中羧甲基壳聚糖的质量分数为3％；

(2)在步骤(1)的羧甲基壳聚糖溶液中加入磷酸钙骨水泥固相粉末，羧甲基壳聚糖溶液与磷酸钙固相粉末的液固比为1ml:0.6g，搅拌均匀后得到磷酸钙骨水泥浆料；

(3)将磷酸钙骨水泥浆料注入注射器中，并逐滴加到液氮中，形成冷冻复合微球；

(4)将冷冻复合微球放入温度为37℃，相对湿度为98％的环境中水化3天后，在37℃干燥，得到所述磷酸钙骨水泥复合微球。

本对比例所述固相粉末包括α-磷酸三钙、掺锶磷酸八钙和/或掺锶无定形磷酸钙；所述固相粉末中，锶和钙的摩尔比为：锶：钙＝0.7：1；所述钙和锶之和与磷的摩尔比为：钙+锶：磷＝1.3:1。

对实施例1～6和对比例1～2制备的磷酸钙骨水泥复合微球进行以下性能检测。

1、抗崩解性能测定

取1g磷酸钙骨水泥复合微球加入到装有30mlsbf溶液的烧杯中，在120rpm，37℃恒温摇床中震荡，定时取样，记录微球明显开始崩解的时间，结果如表1所示。

2、体外降解性

称取一定质量的磷酸钙骨水泥复合微球浸泡在30ml的pbs溶液中，将微球置于在120rpm，37℃恒温摇床中震荡4周后将微球取出烘干，计算微球的质量损失率，结果表1所示。

3、抗压强度

分别取8颗粒径基本一致的微球，将其置入模具中，通过万能材料试验机测试试样的抗压强度，加载速率1mm/min，结果如表1所示。

4、孔隙率

以无水乙醇作为液相介质，通过比重天平，根据阿基米德排水法测定样品的孔隙率，结果如表1所示。

5、细胞增殖

以实施例1～4的磷酸钙骨水泥复合微球样品作为实验组，以对比例1～2的样品作为对照组，采用cck-8试剂盒检测细胞(小鼠骨髓间充质干细胞，atcccrl-12424)的增殖情况，将样品置入48孔板中，接种细胞数量为1×10⁴cell/孔，隔天换液，在37℃，5％co2的培养箱中分别培养1、3、7d后，通过酶标仪在450nm处的吸光度值，结果如图1所示。

6、成骨分化

以实施例1～4的磷酸钙骨水泥复合微球样品作为实验组，以对比例1～2的样品作为对照组，将微球样品置入48孔板中，在微球样品中培养小鼠骨髓间充质干细胞，接种细胞数量为1×10⁴cell/孔，隔天换液，在37℃，5％co2的培养箱中分别培养7、10d后，根据试剂盒进行alp活性测定，结果如图2所示。

表1

由实施例1和对比例1～2结果可知，羧甲基壳聚糖和丝素蛋白的加入能够显著提高骨水泥微球的抗压强度、抗崩解性，促进细胞增殖和成骨分化。由实施例1～5结果可知，通过调整混合溶液的组成、固相粉末组成和液固比，能够有效调控骨水泥的抗压强度、孔隙率和降解性能。

综上，本发明通过采用磷酸钙骨水泥作为原料，结合液滴冷凝法制备磷酸钙骨水泥复合微球，该磷酸钙骨水泥复合微球具有较高的强度，以及优异的抗崩解性，合适的降解性，对小鼠骨髓间充质干细胞的细胞增殖和成骨分化具有促进作用，可作为医用骨缺损填充材料或作用药物载体材料，在骨修复和药物载体领域具有良好的应用前景。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。