本发明涉及一种红树植物果实中黄酮类化合物的生产技术，具体讲是一种从白骨壤果实中提取黄酮类化合物的方法。
背景技术：
白骨壤为马鞭草科白骨壤属真红树植物，主要分布在广东、广西、福建、海南、台湾等沿海地区，面积超过7000hm2。白骨壤果实产量丰富，年产量达2万吨以上，但目前尚未合理开发利用。研究表明，白骨壤果实中含有丰富的黄酮类化合物。黄酮类化合物广泛存在于自然界中。国内外学者研究证实，黄酮类化合物具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、调节心血管等多种生物活性。
目前，关于提取黄酮类化合物的专利有很多，如专利cn201410049110.7提供了一种利用大孔吸附树脂和聚酰胺色谱分离提取山楂叶中黄酮类化合物的方法，得到含量90%以上的黄酮类化合物；专利cn201310107062.8提供了一种利用极性不同的两节串联大孔树脂提取分离甘草中黄酮类化合物的方法；专利cn201610508276.x公开了一种鼠曲草总黄酮的制备方法，通过超声或加热提取、固定相金属离子螯合色谱层析柱分离，得到含量85%的总黄酮。
上述方法多采用树脂作为分离植物中黄酮类化合物，存在大孔树脂的致孔剂泄漏的可能，且工艺中需要大量使用有机试剂对目标产物进行洗脱，使食品安全危害限量控制及环境保护难以达到。因此，需要建立一种高效、无毒、无污染的绿色提取方法。
双水相萃取技术是一种新的液-液分离技术，与传统的液-液萃取技术相比，双水相萃取技术具有分相时间短、易于连续操作、成本投资少、绿色环保等优点，拥有广阔的发展前景。离子液体，又称为室温熔融盐，由大体积的有机阳离子和无机阴离子构成的在室温或者室温附近呈液态的熔盐。离子液体因其优良的溶解性能、热稳定好、低蒸气压等优异性质，在天然活性物质提取领域得到了广泛的关注。离子液体作为一种设计型溶剂，可以通过引入功能基团、调整阴阳离子来调节其溶解性以及对目标产物的提取性能。将离子液体应用于双水相萃取技术中，能更加高效地将目标产物分离提取出来。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供一种从白骨壤果实提取黄酮类化合物的方法，使用离子液体-双水相萃取技术，结合高剪切技术对白骨壤果实中黄酮类化合物进行提取，本方法快速简单，条件易控制，提取过程中减少了有机溶剂的加入，更加环保安全，并适合大规模生产。
本发明的技术方案如下：
一种从白骨壤果实中提取黄酮类化合物的方法，包括如下步骤：
（1）原料前处理：称取一定量的干燥白骨壤果实加入粉碎机中进行粉碎，过40~100目筛，得白骨壤果实粉末备用；
（2）高锰酸钾破壁：白骨壤果实粉末中加入0.5~1.5倍体积的浓度为0.1%~0.5%的高锰酸钾酸性溶剂，搅拌混匀后，减压脱气，形成真空，然后启动超声装置进行超声波处理5min，离心过滤，收集滤渣；
（3）高剪切提取：将收集的滤渣加入高剪切反应釜中，然后加入3~5倍体积的50%~80%乙醇溶液，10000r/min~20000r/min，30~50℃条件下反应5~10min，反应结束后离心过滤，收集提取液，反应2~3次，合并提取液，减压浓缩并真空干燥得粉末a，称量并记录其质量；
（4）双水相萃取：将粉末a加入羧基功能化离子液体/水双水相体系中，室温下震荡10~30min，使体系内可溶物质溶解完全，室温静置分层，其中上相为羧基功能化离子液体与黄酮类化合物，下相为水溶液与不溶物沉淀，离心过滤，保留双水相，弃去沉淀；
（5）双水相水解：将含有黄酮类化合物的双水相体系使用恒温水浴锅进行加热，加热至温度75~95℃，并不断搅拌10~30min，使羧基功能化离子液体与黄酮类化合物分离，分离后的羧基功能化离子液体在高温条件下作为催化剂，催化黄酮苷元与糖分子的水解，黄酮苷元与糖分子水解后不溶于水，形成沉淀聚集在底部，糖分子溶解于水中，静置10~20min后离心，收集沉淀，其中沉淀中的主要成分为黄酮苷元，羧基功能化离子液体回收利用；
（6）将富含黄酮苷元的沉淀用清水洗涤2~3次，真空干燥得高纯度黄酮类化合物提取物。
作为本发明的进一步说明：干燥白骨壤果实的水分活度≤5%。
作为本发明的进一步说明：步骤（2）中高锰酸钾酸性溶液配置方法为：准确称取高锰酸钾固体0.10g~0.50g，溶解于50ml双蒸水中，再加入1mol/l稀硫酸溶液2ml，搅拌混匀，然后继续加双蒸水定容至100ml，避光保存。
作为本发明的进一步说明：所述的羧基功能化离子液体的阳离子为1-羧甲基-3-甲基咪唑离子或1-羧乙基-3-甲基咪唑离子，阴离子为氯离子、溴离子、硝酸离子、双三氟甲烷磺酰亚胺离子、硫酸氢离子中的一种。
作为本发明的进一步说明：所述羧基功能化离子液体/水双水相体系为每20ml体系中加入羧基功能化离子液体4.0~8.4g，粉末a2.0~5.0g，加水至刻度线，震荡溶解。
本发明的技术原理如下：
细胞壁是植物细胞的显著特征之一，主要由纤维素、半纤维素、木质素、果胶和壁蛋白等组成，组织结构致密坚硬，其中纤维素和木质素通过酯键和醚键相互交联，填充在微纤丝之间充当粘合剂的作用，同时也作为基质包裹在纤维素微纤丝的表面，构成了致密的保护层，抵御外界微生物、酶或化学试剂的入侵。黄酮类化合物在植物的花、果实等生殖器官中，主要以糖苷形式出现，在这种结构中，黄酮类化合物糖苷配基的一个或多个羟基通过酸不稳定的半缩醛与一个或多个糖分子相接，糖基化的作用使黄酮类化合物增大了水溶性，使其在细胞的胞液中蓄积。植物的细胞壁是细胞内黄酮类化合物提取的主要障碍。破裂细胞壁是生物活性成分快速高效提取的关键环节，植物细胞壁的破裂程度越大，提取的速度越快，活性成分的得率越高。其中纤维素、半纤维素和木质素结构中基环间的连接主要为苷键，含还原性基团，基团上还有羟基，易发生水解反应，或进行氧化、还原、酯化反应等，在氧化剂存在作用下易受到氧化而裂解，使部分纤维素、半纤维素和木质素脱离，破坏植物细胞原本结构，增加植物的孔隙率，从而提高物质间流体的传质过程。
高锰酸钾为氧化剂，在一定的低浓度条件下，高锰酸钾能在保证细胞内部不受损伤的前提下，氧化还原性基团，破坏细胞壁中的纤维素和木质素，使木质素和纤维素等从细胞壁中脱离，使植物细胞壁氧化破裂，增加植物孔隙率，提高物质传质过程，并在不破坏细胞液中黄酮类化合物的情况下，达到破裂细胞壁的目的。高锰酸钾在酸性介质中，由于其还原电位的增大，其氧化性能更强，能缩短反应时间。
在酸性条件下，高锰酸钾与乙醇反应可生成硫酸锰和硫酸钾溶于水中，能与羧基功能离子络合形成沉淀除去。
羧基功能化离子液体具有强的金属络合作用，能将液体中金属离子通过络合反应形成沉淀而除去。在与黄酮类化合物反应成盐的同时，通过络合反应将细胞壁破裂使引入的金属离子锰和钾通过络合反应形成沉淀除去，使金属离子不影响后续的提取过程。
羧基功能化合离子液体具有强酸性，能与黄酮类化合物反应成盐。黄酮类化合物是一类存在于自然界的、具有2-苯基色原酮结构的化合物，它们分子中有一个酮式羰基，第一位上的氧原子具碱性，能与强酸成盐。黄酮类化合物在果实中主要以糖苷类形式存在，黄酮类化合物糖苷配基的一个或多个羟基通过酸不稳定的半缩醛与一个或多个糖分子相接，糖分子中存在较多的亲水基团使黄酮类化合物水溶性增加。羧基功能化离子液体与黄酮类化合物通过羰基上的氧原子连接成盐，而由于糖分子的存在，增加离子液体与黄酮苷元的亲水性，使离子液体与黄酮连接后溶于水中，通过该反应，使羧基功能化离子液体对黄酮化合物的提取更加有针对性，不能与羧基功能化离子液体反应形成可溶物的物质且不溶于水中的物质形成沉淀而被除去，提高了黄酮化合物的提取纯度。
羧基功能化离子液体为酸性溶液，黄酮类化合物在酸性条件下可以发生水解反应，与糖分子解离，形成不溶于水的黄酮苷元。想要获得高纯度的黄酮类化合物，需要对糖分子进行水解除去。黄酮糖苷的水解主要通过无机液体酸催化和酶催化完成，前者污染大，需要用到的均为强酸，存在一定的安全隐患，后者由于酶活性条件限制而应用范围太窄。使用羧基功能化离子液体具有的强酸性，具有有机酸的相似的性质，能作为酸性催化剂，在高温的条件下催化黄酮苷元与糖分子的水解反应。水解结束后，离子液体回收利用，环保安全。
本发明的有益效果：
本发明白骨壤果实黄酮类化合物利用高锰酸钾进行破壁，高剪切提取及利用羧基功能化离子液体/水双水相体系特异萃取和水解糖分子实现黄酮化合物的高效分离纯化的目的，其总黄酮含量可达80%~90%之间，该法具有操作周期短、分离效果好等优点。本发明所述双水相萃取采用离子液体作为体系之一，能重复回收利用，节约了成本，继续采用羧基功能化离子液体催化水解糖分子得到高纯度黄酮类化合物，减少了制备过程中有机溶剂的使用，更加有利于环保。
具体实施方式
实施例1：
（1）原料前处理：准确称取1.0kg水分活度≤0.5%的干燥白骨壤果实加入粉碎机中进行粉碎，过40和50目筛，得白骨壤果实粉末备用；
（2）高锰酸钾破壁：白骨壤果实粉末中加入0.5倍体积即500ml浓度为0.2%的高锰酸钾酸性溶剂，搅拌混匀后，减压脱气，形成真空，然后启动超声装置进行超声波处理5min，离心过滤，收集滤渣；
（3）高剪切提取：将收集的滤渣加入高剪切反应釜中，然后加入3l体积分数为50%的乙醇溶液，10000r/min，30℃条件下反应10min，反应结束后离心过滤，收集提取液，反应2次，合并提取液，减压浓缩并真空干燥得粉末a，称量并记录其质量为501.65g；
（4）双水相萃取：将粉末a加入1-羧乙基-3-甲基咪唑双（三氟甲烷磺酰）亚胺盐/水双水相体系中，其中双水相体系体积为2l，1-羧乙基-3-甲基咪唑双（三氟甲烷磺酰）亚胺盐的加入量为401.01g，粉末a加入量为501.65g，加水至刻度线，震荡10min使体系内可溶物质完全溶解后室温静置分层，其中上相为1-羧乙基-3-甲基咪唑双（三氟甲烷磺酰）亚胺盐与黄酮类化合物，下相为水，以及不溶物沉淀，离心过滤，保留双水相体系，除去沉淀；
（5）双水相水解：将含有黄酮类化合物的双水相体系使用恒温水浴锅进行加热，加热至温度95℃，并不断搅拌25min，使羧基功能化离子液体与黄酮类化合物分离，分离后的羧基功能化离子液体在高温条件下作为催化剂，催化黄酮苷元与糖分子的水解，黄酮苷元与糖分子水解后不溶于水，形成沉淀聚集在底部，糖分子溶解于水中，静置20min后离心，收集沉淀，其中沉淀中的主要成分为黄酮苷元，羧基功能化离子液体回收利用；
（6）将富含黄酮苷元的沉淀用清水洗涤3次，真空干燥得纯度为89.27%的黄酮类化合物提取物。
实施例2：
（1）原料前处理：准确称取0.5kg水分活度≤0.5%的干燥白骨壤果实加入粉碎机中进行粉碎，过80和100目筛，得白骨壤果实粉末备用；
（2）高锰酸钾破壁：白骨壤果实粉末中加入1倍体积即500ml浓度为0.5%的高锰酸钾酸性溶剂，搅拌混匀后，减压脱气，形成真空，然后启动超声装置进行超声波处理5min，离心过滤，收集滤渣；
（3）高剪切提取：将收集的滤渣加入高剪切反应釜中，然后加入5l体积分数为60%的乙醇溶液，20000r/min，50℃条件下反应5min，反应结束后离心过滤，收集提取液，反应2次，合并提取液，减压浓缩并真空干燥得199.53g粉末a；
（5）双水相萃取：将粉末a加入1-羧乙基-3-甲基咪唑硫酸氢盐/水双水相体系中，双水相体系体积为1l，加入350.01g1-羧乙基-3-甲基咪唑硫酸氢盐，199.53g粉末a，震荡15min使体系内可溶物质溶解完全，室温静置分层，其中上相为1-羧乙基-3-甲基咪唑硫酸氢盐与黄酮类化合物，下相为水，以及不溶物沉淀，离心过滤，保留双水相体系，除去沉淀；
（5）双水相水解：将含有黄酮类化合物的双水相体系使用恒温水浴锅进行加热，加热至温度90℃，并不断搅拌10min，使羧基功能化离子液体与黄酮类化合物分离，分离后的羧基功能化离子液体在高温条件下作为催化剂，催化黄酮苷元与糖分子的水解，黄酮苷元与糖分子水解后不溶于水，形成沉淀聚集在底部，糖分子溶解于水中，静置15min后离心，收集沉淀，其中沉淀中的主要成分为黄酮苷元，羧基功能化离子液体回收利用；
（6）将富含黄酮苷元的沉淀用清水洗涤3次，真空干燥得146.35g高纯度黄酮类化合物提取物。
实施例3：
（1）原料前处理：准确称取0.5kg水分活度≤0.5%的干燥白骨壤果实加入粉碎机中进行粉碎，过100目筛，得白骨壤果实粉末备用；
（2）高锰酸钾破壁：白骨壤果实粉末中加入1.5倍体积即750ml浓度为0.3%的高锰酸钾酸性溶剂，搅拌混匀后，减压脱气，形成真空，然后启动超声装置进行超声波处理5min，离心过滤，收集滤渣；
（3）高剪切提取：将收集的滤渣加入高剪切反应釜中，然后加入2.5l体积分数为80%的乙醇溶液，20000r/min，30℃条件下反应5min，反应结束后离心过滤，收集提取液，反应3次，合并提取液，减压浓缩并真空干燥得粉末a，称量并记录其质量为201.37g；
（4）双水相萃取：将粉末a加入1-羧甲基-3-甲基咪唑氯盐/水双水相体系中，双水相体系体积为1l，加入1-羧甲基-3-甲基咪唑氯盐420.05g，粉末a201.37g，震荡30min使体系内可溶物质完全溶解，室温静置分层，其中上相为1-羧甲基-3-甲基咪唑氯盐与黄酮类化合物，下相为水，以及不溶物沉淀，离心过滤，保留双水相体系，除去沉淀；
（5）双水相水解：将含有黄酮类化合物的双水相体系使用恒温水浴锅进行加热，加热至温度75℃，并不断搅拌30min，使羧基功能化离子液体与黄酮类化合物分离，分离后的羧基功能化离子液体在高温条件下作为催化剂，催化黄酮苷元与糖分子的水解，黄酮苷元与糖分子水解后不溶于水，形成沉淀聚集在底部，糖分子溶解于水中，静置20min后离心，收集沉淀，其中沉淀中的主要成分为黄酮苷元，羧基功能化离子液体回收利用；
（6）将富含黄酮苷元的沉淀用清水洗涤2次，真空干燥得179.02g高纯度黄酮类化合物提取物。。
实施例4：
（1）原料前处理：准确称取1.0kg水分活度≤0.5%的干燥白骨壤果实加入粉碎机中进行粉碎，过100目筛，得白骨壤果实粉末备用；
（2）高锰酸钾破壁：白骨壤果实粉末中加入1倍体积即1000ml浓度为0.4%的高锰酸钾酸性溶剂，搅拌混匀后，减压脱气，形成真空，然后启动超声装置进行超声波处理5min，离心过滤，收集滤渣；
（3）高剪切提取：将收集的滤渣加入高剪切反应釜中，然后加入5l体积分数为50%的乙醇溶液，10000r/min，40℃条件下反应7min，反应结束后离心过滤，收集提取液，反应2次，合并提取液，减压浓缩并真空干燥得粉末a，称量并记录其质量为470.36g；
（4）双水相萃取：将粉末a加入1-羧甲基-3-甲基咪唑溴盐/水双水相体系中，双水相体系体积为2l，1-羧甲基-3-甲基咪唑溴盐加入量为700.03g，粉末a加入量为470.36g，震荡20min，室温静置分层，其中上相为1-羧甲基-3-甲基咪唑溴盐与黄酮类化合物，下相为水，以及不溶物沉淀，离心过滤，保留双水相体系，除去沉淀；
（5）双水相水解：将含有黄酮类化合物的双水相体系使用恒温水浴锅进行加热，加热至温度95℃，并不断搅拌20min，使羧基功能化离子液体与黄酮类化合物分离，分离后的羧基功能化离子液体在高温条件下作为催化剂，催化黄酮苷元与糖分子的水解，黄酮苷元与糖分子水解后不溶于水，形成沉淀聚集在底部，糖分子溶解于水中，静置10min后离心，收集沉淀，其中沉淀中的主要成分为黄酮苷元，羧基功能化离子液体回收利用；
（6）将富含黄酮苷元的沉淀用清水洗涤3次，真空干燥得纯度为85.39%的黄酮类化合物提取物。
实施例5：
（1）原料前处理：准确称取1.0kg水分活度≤0.5%的干燥白骨壤果实加入粉碎机中进行粉碎，过50和60目筛，得白骨壤果实粉末备用；
（2）高锰酸钾破壁：白骨壤果实粉末中加入1.5倍体积即1500ml浓度为0.1%的高锰酸钾酸性溶剂，搅拌混匀后，减压脱气，形成真空，然后启动超声装置进行超声波处理5min，离心过滤，收集滤渣；
（3）高剪切提取：将收集的滤渣加入高剪切反应釜中，然后加入3l体积分数为55%的乙醇溶液，15000r/min，35℃条件下反应8min，反应结束后离心过滤，收集提取液，反应3次，合并提取液，减压浓缩并真空干燥得粉末a，称量并记录其质量为499.31g；
（4）双水相萃取：将粉末a加入1-羧乙基-3甲基咪唑硝酸盐/水双水相体系中，体系体积为2l，加入1-羧乙基-3甲基咪唑硝酸盐620.01g，粉末a加入量为499.31g，震荡25min，室温静置分层，其中上相为1-羧乙基-3甲基咪唑硝酸盐与黄酮类化合物，下相为水，以及不溶物沉淀，离心过滤，保留双水相体系，除去沉淀；
（5）双水相水解：将含有黄酮类化合物的双水相体系使用恒温水浴锅进行加热，加热至温度80℃，并不断搅拌15min，使羧基功能化离子液体与黄酮类化合物分离，分离后的羧基功能化离子液体在高温条件下作为催化剂，催化黄酮苷元与糖分子的水解，黄酮苷元与糖分子水解后不溶于水，形成沉淀聚集在底部，糖分子溶解于水中，静置15min后离心，收集沉淀，其中沉淀中的主要成分为黄酮苷元，羧基功能化离子液体回收利用；
（6）将富含黄酮苷元的沉淀用清水洗涤3次，真空干燥得纯度为81.92%黄酮类化合物提取物。