本发明涉及作物提取
技术领域：
，尤其是涉及一种黄麻叶中黄酮醇类组分的提取方法及其提取物和应用。
背景技术：
黄麻属于一年生双子叶植物，叶片为卵圆形或披针形，颜色为绿色或微红色，含有黄酮醇类等化学成份，常见黄酮醇类有异槲皮素、槲皮素和山奈酚等组分，具有抗炎、解痉、止咳平喘等重要的药用价值。如何从黄麻中提取出上述黄酮醇类组分，对深度开发黄麻作物极其重要。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种黄麻叶中黄酮醇类组分的提取方法，所述提取方法能够深度提取到黄麻叶中的异槲皮素、槲皮素和山奈酚，所述提取方法收率高，工艺简单，条件温和。本发明的第二目的在于提供一种采用所述黄麻叶中黄酮醇类组分的提取方法提取得到的提取物，所述提取物中异槲皮素、槲皮素和山奈酚的含量高，具有优异的自由基活性清除的效果，以及酪氨酸酶活性抑制作用，能够起到抗炎、抗氧化和美白等功效。本发明的第三目的在于提供一种所述提取物的应用，所述提取物具有优异的清除自由基的能力，对羟自由基、dpph自由基和超氧阴离子自由基均具有较好的清除效果，为功能性食品、美容产品提供基础。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：黄麻叶中黄酮醇类组分的提取方法，包括如下步骤：以含醇的溶液作为提取液对黄麻叶进行回流提取。本发明以含醇的溶液作为提取液，对黄麻叶进行提取，主要以醇溶出黄麻叶中的异槲皮素、槲皮素和山奈酚，避免采用纯水进行提取时，水溶性物质大量溶出，造成的提取物成分复杂，提纯困难，并且活性偏低的问题。优选的，所述提取液中，醇的体积分数为60-90％。本发明中，提取液中，醇的体积分数对于提取过程十分重要。当醇的体积分数在上述范围内，能够在保证提取出黄麻叶中异槲皮素、槲皮素和山奈酚的同时，避免溶出水溶性物质使活性偏低以及增加提纯难度。如果醇的体积分数过低时，提取物中水溶性物质溶出过多，提取物活性偏低，并且给提纯造成困难；如果醇的体积分数过高时，提取物中的物质结构容易被破坏，使得活性物质减少。并且，采用上述提取液，能够提取出特定量的异槲皮素、槲皮素和山奈酚，三者协同配合具有不同的功效。优选的，所述含醇的溶液为含醇的水溶液。优选的，所述醇包括甲醇和乙醇。更优选的，所述醇为甲醇。采用甲醇和乙醇能够兼顾溶出异槲皮素、槲皮素和山奈酚，溶出一定量的异槲皮素、槲皮素和山奈酚后，三者相互作用，最大化清除自由基的效果以及酪氨酸酶的抑制作用。其中，采用含一定体积分数的甲醇的水溶液作为提取液，提取得到的提取物对自由基的清除能力优异且对酪氨酸酶的抑制作用显著。优选的，所述提取液为体积分数为70％的甲醇的水溶液。采用上述提取液，对黄麻叶进行提取，能够提取得到特定量的异槲皮素、槲皮素和山奈酚，三者协同作用，使得对羟自由基、超氧阴离子自由基和dpph自由基的清除能力可达到97.61％、62.66％和88.15％。优选的，所述提取液为体积分数为90％的甲醇的水溶液。采用上述提取液，对黄麻叶进行提取，能够提取得到特定匹配量的异槲皮素、槲皮素和山奈酚，三者协同作用，对酪氨酸酶活性的抑制作用最佳，可达到85.56％。优选的，所述黄麻叶与提取液的比例为1g﹕(20-40)ml，优选为1g﹕(25-35)ml，更优选为1﹕30ml。优选的，所述回流提取的温度为70-90℃，优选为75-85℃，更优选为80℃。所述回流提取的温度影响整个提取过程，综合考虑溶出目标物，并避免杂质的溶出等多种因素；通过配合上述提取温度和提取液成分，能够兼顾提取溶出黄麻叶中的特定成分异槲皮素、槲皮素和山奈酚，并避免溶出其它水溶性物质，降低活性。优选的，所述回流提取的时间为1-3h，优选为1.5-2.5h，更优选为2h。优选的，提取后，离心除去沉淀，收集液体。更优选的，所述离心的转速为6000-10000rpm/min，优选为8000rpm/min；所述离心的时间为5-15min，优选为10min。本发明通过设置特定的检测条件，同步检测出提取物中异槲皮素、槲皮素和山奈酚的含量。具体的，流动相为体积比为55﹕45的甲醇和质量分数为0.5％的磷酸；流速为0.8ml/min，柱温：25℃；紫外检测波长：360nm；进样量：20μl。通过外标法，配制一定比例和浓度的异槲皮素、槲皮素和山奈酚的混合标准液，采用相同的hplc检测条件测定，计算出提取物中的异槲皮素、槲皮素和山奈酚的含量。本发明还提供了一种采用所述黄麻叶中黄酮醇类组分的提取方法提取得到的提取物。所述提取物中包括异槲皮素、槲皮素和山奈酚。其中，所述异槲皮素的浓度为30-93μg/ml，所述槲皮素的浓度为1-5μg/ml，所述山奈酚的浓度为0.1-4μg/ml。上述提取物，对于酪氨酸酶活性的抑制率可达85.56％，对羟自由基、超氧阴离子自由基和dpph自由基的清除能力可达到97.61％、62.66％和88.15％，具有优异的抑制酪氨酸酶的活性和清除自由基活性的效果。本发明还提供了一种所述提取物在清除自由基方面的应用。优选的，所述自由基包括羟自由基、超氧阴离子自由基和dpph自由基中的一种或多种。优选的，所述提取物在制备清除自由基的保健食品和/或化妆品中的应用。如在食品和/或化妆品中添加所述提取物作为活性成分，能够赋予食品和/或化妆品一定的清除自由基的作用。与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)本发明所述的提取方法，能够深度提取到黄麻叶中的异槲皮素、槲皮素和山奈酚，收率高，工艺简单，条件温和；(2)本发明所述的提取方法，能够兼顾从黄麻叶中提取得到的异槲皮素、槲皮素和山奈酚的量，使得所述异槲皮素的浓度为30-93μg/ml，所述槲皮素的浓度为1-5μg/ml，所述山奈酚的浓度为0.1-4μg/ml；(3)采用本发明所述的提取方法提取得到的提取物，通过特定量的异槲皮素、槲皮素和山奈酚三者协同作用，具有优异的清除自由基的能力以及酪氨酸酶活性抑制作用，对羟自由基、dpph自由基和超氧阴离子自由基均具有较好的清除效果；(4)本发明所述的提取物可用于制备具有清除自由基功效以及抑制酪氨酸酶活性功效的保健食品和/或化妆品。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明实施例提供以含不同体积分数的醇的水溶液提取黄麻叶得到的提取物对羟自由基的清除率；图2为本发明实施例提供以含不同体积分数的醇的水溶液提取黄麻叶得到的提取物对超氧阴离子自由基的清除率；图3为本发明实施例提供以含不同体积分数的醇的水溶液提取黄麻叶得到的提取物对dpph自由基的清除率；图4为本发明实施例提供以含不同体积分数的醇的水溶液提取黄麻叶得到的提取物对酪氨酸酶活性的抑制率。具体实施方式下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本发明各实施例的黄麻叶，采摘于湖南长沙实验基地种植的黄麻叶，长果种，叶龄60d。本发明采用的部分仪器信息如下：液相色谱仪：dionexultimate3000；c18柱：hermohypersilbdsc18柱(250mm×4.6mm，5μm)；紫外检测器：vwd-3400紫外检测器。实施例1本实施例提供了一种黄麻叶中黄酮醇类组分的提取方法，步骤如下：(1)将黄麻叶洗净，50℃烘干，粉碎制成黄麻叶粉，所述黄麻叶粉的平均粒径为0.35±0.02mm；(2)称取1g黄麻叶粉置于圆底烧瓶中，置于30ml体积分数为70％的甲醇的水溶液中，于80℃条件加热回流提取2h后，冷却至室温；(3)将提取后的物质于8000r/min离心10min，除去沉淀，收集液体，即得提取物。实施例2本实施例提供了一种黄麻叶中黄酮醇类组分的提取方法，步骤如下：(1)将黄麻叶洗净，50℃烘干，粉碎制成黄麻叶粉，所述黄麻叶粉的平均粒径为0.35±0.02mm；(2)称取1g黄麻叶粉置于圆底烧瓶中，置于30ml体积分数为60％的甲醇的水溶液中，于80℃条件加热回流提取2h后，冷却至室温；(3)将提取后的物质于8000r/min离心10min，除去沉淀，收集液体，即得提取物。实施例3本实施例提供了一种黄麻叶中黄酮醇类组分的提取方法，步骤如下：(1)将黄麻叶洗净，50℃烘干，粉碎制成黄麻叶粉，所述黄麻叶粉的平均粒径为0.35±0.02mm；(2)称取1g黄麻叶粉置于圆底烧瓶中，置于30ml体积分数为80％的甲醇的水溶液中，于80℃条件加热回流提取2h后，冷却至室温；(3)将提取后的物质于8000r/min离心10min，除去沉淀，收集液体，即得提取物。实施例4本实施例提供了一种黄麻叶中黄酮醇类组分的提取方法，步骤如下：(1)将黄麻叶洗净，50℃烘干，粉碎制成黄麻叶粉，所述黄麻叶粉的平均粒径为0.35±0.02mm；(2)称取1g黄麻叶粉置于圆底烧瓶中，置于30ml体积分数为90％的甲醇的水溶液中，于80℃条件加热回流提取2h后，冷却至室温；(3)将提取后的物质于8000r/min离心10min，除去沉淀，收集液体，即得提取物。实施例5本实施例提供了一种黄麻叶中黄酮醇类组分的提取方法，步骤如下：(1)将黄麻叶洗净，50℃烘干，粉碎制成黄麻叶粉，所述黄麻叶粉的平均粒径为0.35±0.02mm；(2)称取1g黄麻叶粉置于圆底烧瓶中，置于30ml体积分数为60％的乙醇的水溶液中，于80℃条件加热回流提取2h后，冷却至室温；(3)将提取后的物质于8000r/min离心10min，除去沉淀，收集液体，即得提取物。实施例6本实施例提供了一种黄麻叶中黄酮醇类组分的提取方法，步骤如下：(1)将黄麻叶洗净，50℃烘干，粉碎制成黄麻叶粉，所述黄麻叶粉的平均粒径为0.35±0.02mm；(2)称取1g黄麻叶粉置于圆底烧瓶中，置于30ml体积分数为70％的乙醇的水溶液中，于80℃条件加热回流提取2h后，冷却至室温；(3)将提取后的物质于8000r/min离心10min，除去沉淀，收集液体，即得提取物。实施例7本实施例提供了一种黄麻叶中黄酮醇类组分的提取方法，步骤如下：(1)将黄麻叶洗净，50℃烘干，粉碎制成黄麻叶粉，所述黄麻叶粉的平均粒径为0.35±0.02mm；(2)称取1g黄麻叶粉置于圆底烧瓶中，置于30ml体积分数为80％的乙醇的水溶液中，于80℃条件加热回流提取2h后，冷却至室温；(3)将提取后的物质于8000r/min离心10min，除去沉淀，收集液体，即得提取物。实施例8本实施例提供了一种黄麻叶中黄酮醇类组分的提取方法，步骤如下：(1)将黄麻叶洗净，50℃烘干，粉碎制成黄麻叶粉，所述黄麻叶粉的平均粒径为0.35±0.02mm；(2)称取1g黄麻叶粉置于圆底烧瓶中，置于30ml体积分数为90％的乙醇的水溶液中，于80℃条件加热回流提取2h后，冷却至室温；(3)将提取后的物质于8000r/min离心10min，除去沉淀，收集液体，即得提取物。比较例1比较例1参考实施例1的制备方法，区别在于：采用纯水作为提取液，提取温度为80℃。实验例1为了对比说明本发明各实施例和比较例的提取方法的区别，对采用各实施例和比较例的提取方法提取得到的提取物的成分进行测试，测试结果见表1，测试方法如下：混合标准液配制：准确称取异槲皮素2.2mg、槲皮素2.0mg、山奈酚1.8mg，混合、甲醇溶液超声溶解，定容至25ml，0.45μm滤膜过滤，适度稀释倍数用作hplc检测分析对照；标准液测试得到的峰面积y与浓度x的线性回归方程分别如下：异槲皮素：y＝1.1923x+0.9108，r2＝0.9965；槲皮素：y＝0.7164x+0.3155，r2＝0.9990；山奈酚：y＝0.8433x+0.3758，r2＝0.9991。分别取各实施例和比较例制备得到的提取物，取1ml用0.45μm滤膜过滤，采用hplc检测分析；hplc检测条件：流动相：v(甲醇)﹕v(0.5％磷酸)＝55﹕45；流速：0.8ml/min；柱温：25℃；紫外检测波长：360nm；进样量：20μl。表1不同处理的提取物中的组分含量结果实验例2为了对比说明本发明各实施例和比较例的提取方法的区别，对采用各实施例和比较例的提取方法提取得到的提取物对自由基的清除率进行测试，测试结果如图1-3以及表2所示，测试方法如下：清除羟自由基活性的测定方法：分别取各实施例和比较例制备得到的提取物2ml于试管中，依次加入6mmol/l的feso4、6mmol/l的h2o2溶液各2ml，摇匀，室温静置10min；再加入6mmol/l水杨酸溶液2ml，摇匀，静置30min，510nm处测吸光度；同时设置空白对照；按照公式计算清除率：羟自由基清除率(％)＝[1-(ai-aj)/a0]×100％其中，ai为feso4+h2o2+提取物样品+水杨酸各2ml的吸光度；aj为feso4+h2o2+样品+水各2ml的吸光度；a0为feso4+h2o2+水+水杨酸各2ml的吸光度。清除超氧阴离子自由基活性的测定方法：分别取各实施例和比较例制备得到的提取物0.2ml加入至装有5.7ml的tris-hcl缓冲液(50mmol/l、ph＝8.20)中，于25℃保温10min，然后加入0.1ml邻苯三酚(6mmol/l、预热至25℃)，立刻摇匀后用紫外-可见分光光度计测定反应1min时320nm处的吸光度；同时设置空白对照；按照公式计算清除率：超氧阴离子自由基清除率(％)＝[(ae-as)/ae]×100％其中，as为tris-hcl+样品+邻苯三酚测定反应1min时的吸光度；ae为tris-hcl+水+邻苯三酚测定反应1min时的吸光度。清除dpph自由基活性的测定方法：分别取各实施例和比较例制备得到的提取物1ml至装有1ml的0.2mmol/l的dpph(二苯代苦味酰肼自由基)液中，室温下静置30min，517nm处测吸光度；同时设置空白对照；按照公式计算清除率：dpph自由基清除率(％)＝[1-(am-an)/ac]×100％其中，am为1mldpph+1ml样品的吸光度；an为1ml无水乙醇+1ml样品的吸光度；ac为1mldpph+1ml无水乙醇的吸光度。表2不同处理的提取物的清除自由基活性测试结果编号羟自由基清除率(％)dpph清除率(％)超氧阴离子清除率(％)实施例197.6188.1562.66实施例286.2384.7428.21实施例388.0886.1920.91实施例466.0784.506.42实施例555.7482.0241.90实施例695.8085.2743.61实施例762.9288.6335.21实施例878.5685.3946.26比较例195.9684.841.35实验例3为了对比说明本发明各实施例和比较例的提取方法的区别，对采用各实施例和比较例的提取方法提取得到的提取物对酪氨酸酶活性的抑制率进行测试，测试结果如图4和表4所示，测试方法如下：分别按照表3中的用量取l-酪氨酸(1.5mmol/l)、磷酸盐缓冲液pbs(0.2mol/l、ph＝6.8)及各实施例和比较例得到的提取物样品于4个ep管(t1、t2、t3、t4)中，混匀，37℃恒温10min后，在t2、t4中分别加入酪氨酸酶(200u/ml)，反应10min，475nm处测吸光度。表3酪氨酸酶活性抑制测定时反应液组成按照公式计算酪氨酸酶活性抑制率，抑制率＝[1-(at4-at3)/(at2-at1)]×100％其中，at1为未加样品和未加酪氨酸酶的反应液的吸光度；at2为未加样品和加酪氨酸酶的反应液的吸光度；at3为加样品和未加酪氨酸酶的反应液的吸光度；at4为加样品和加酪氨酸酶的反应液的吸光度。表4不同处理的提取物的抑制酪氨酸酶活性测试结果最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。当前第1页12