本发明属于功能材料技术领域，具体涉及一种具有抗氧化能力的细菌纤维素面膜及其制备方法。
背景技术：
随着生活水平的提高，人们对于美的追求也在不断提高，面膜作为一种最常见，也易携带的护肤品，对其需求量逐年上升。市场上销售的面膜主要有片状、膏状和泥状等，主流片状面膜以无纺布基为主。由于无纺布持水性低，容易造成精华浪费，另外，无纺布的皮肤贴合性能较差。细菌纤维素是一种天然纳米高聚物，其凭借良好的生物可降解性、较高的生物相容性和良好的持水性能等特点，成为面膜基材研究中的新宠。在细菌纤维素的培养过程中，产细菌纤维素菌株可利用多种碳源合成纤维素，另外，培养基中氮源和无机盐的量也是影响细菌纤维素产量和产率的主要因素。而目前细菌纤维素生产成本高，特别是其培养基碳源成本较高，效果不理想是影响细菌纤维素大规模工业化生产的重要因素。而牛奶中含有丰富的维生素、蛋白质、氨基酸和微量元素，具有护肤养颜的功效，由于牛奶的特性的限制，其保鲜期限通常较短，目前对于过期牛奶的处理未见系统的报道。
利用细菌纤维素膜作为基材，制备功能性的面膜是目前研究的热点，海南光宇生物科技有限公司公开了一种利用含有植物类总黄酮乙醇溶液作为营养液培养细菌纤维素，制备具有抗辐射能力的面膜的方法(2013，201310314954.5)，但是与总黄酮的含量相比，茶多酚的含量对总还原能力的相关性较强，对酪氨酸酶活性的抑制能力也较强，并且不同纯度的茶多酚表现出来的性能也是不同的。因此，开发出一种具有抗氧化能力和美白效果的细菌纤维素面膜是十分必要的，也是对面膜市场的补充。
技术实现要素：
为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种具有抗氧化能力的细菌纤维素面膜的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种由上述制备方法制得的具有抗氧化能力的细菌纤维素面膜。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种具有抗氧化能力的细菌纤维素面膜的制备方法，包括以下步骤：
(1)将牛奶、茶多酚、甘露醇、蛋白胨、酵母粉和硫酸镁混合均匀并溶解，调节ph值后，高温灭菌后加入乙醇制备成发酵培养基；
(2)选取能分泌细菌纤维素的活化木醋杆菌制备菌种种子液，将菌株浓度约为1×107个/ml的菌悬液按照2.00％-8.00％(v/v)的接种量均匀的接种到步骤(1)制得的发酵培养基中，发酵培养，发酵产物经清洗纯化、切割处理得到具有抗氧化能力的细菌纤维素面膜。
优选的，步骤(1)中所述牛奶包括过期的商业发酵酸奶，纯牛奶以及各类牛奶饮品中的一种。
本发明利用过期牛奶作为碳源，由于牛奶中富含碳和氮元素，利用过期牛奶培养细菌纤维素不仅可以实现废弃牛奶高值化利用，有效降低生产细菌纤维素的成本，还可以提高细菌纤维素的产量。此外，茶多酚作为茶叶的主要营养成分，抗氧化作用非常强，并且茶多酚对酪氨酸酶活性具有较好的抑制效果，能够有效的抑制细胞黑色素的形成和沉积，是一种天然的抗氧化剂，并且具有良好的美白作用。
优选的，上述过期牛奶过期时限为6个月以内(包括6个月)。
优选的，步骤(1)中所述茶多酚纯度为95％-99％。
优选的，步骤(1)中所述牛奶用量为0.50％-3.00％(w/v)，茶多酚用量0.01％-0.10％(w/v)，甘露醇、蛋白胨和酵母粉用量均为0.20％-1.00％(w/v)，硫酸镁用量为0.05％-0.20％(w/v)；所述乙醇加入量为0.10％-1.00％(指其在发酵培养基中的体积占比)。
优选的，步骤(1)中采用naoh溶液和hcl溶液调节ph值。更优选的，所述naoh溶液浓度为0.10mol/l，hcl溶液浓度为0.10mol/l。
优选的，步骤(1)中所述发酵培养基ph值为6.0-7.0。
优选的，步骤(1)中所述高温灭菌温度为121℃，处理时间为20min-60min。
优选的，步骤(2)中所述发酵培养方式为原位静态培养，温度为30℃，时间为5-10天。
优选的，步骤(2)中所述清洗纯化方法为：用0.10mol/l的naoh溶液煮沸30min至膜呈现半透明状取出，用0.10mol/l的hcl中和，然后用去离子水反复冲洗，直至中性。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)本发明采用废弃过期牛奶作为营养物质，实现了废物高值化再利用。
(2)原位静态培养制备抗氧化细菌纤维素工艺简单，易于操作，适于工业化生产；
(3)使用过期牛奶代替葡萄糖制备培养基，不仅可以提供足够的碳源还能补充培养基的氮源，可提高细菌纤维素膜的得率。
(4)本发明所采用的抗氧化剂茶多酚绿色环保，并且可使面膜具有抗氧化能力的同时具有一定的美白功效。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本发明所使用的木醋杆菌菌种均购自广东省微生物菌种保藏中心。
本发明中按照以下方法测试实施例和对照组制备的细菌纤维素膜的得率、酪氨酸酶抑制率和总抗氧化能力：
1、将处理后的细菌纤维素膜放入烘箱中烘至恒重，用分析天平测得其干重，细菌纤维素的产量的计算公式为：
bc产量(g/l)＝干膜质量/培养液体积
2、35℃恒温条件下，向10ml比色管中加入50u/ml酪氨酸酶溶液2.00ml，3.50ml磷酸盐缓冲液，4.00g/l的细菌纤维素溶液2.00ml，0.01mol/l的多巴溶液2.00ml，用超纯水定容，恒温2min，过滤后，紫外分光光度计在475nm处测定吸光度。计算公式为：
酪氨酸酶抑制率＝[1-(a3-a4)/(a1-a2)]*100％
a1—酪氨酸酶，不加细菌纤维素，只加多巴胺溶液吸光度；
a2—酪氨酸酶，不加细菌纤维素，不加多巴胺溶液吸光度；
a3—酪氨酸酶，加细菌纤维素，加多巴胺溶液吸光度；
a4—酪氨酸酶，加细菌纤维素，不加多巴胺溶液吸光度。
3、取0.50g/l的细菌纤维素溶液3ml于试管中，再加入3mlfrap工作液(0.2mol/l醋酸盐缓冲液∶10mmol/ltptz溶于40mmol/l盐酸∶20mmol/lfecl3＝10∶1∶1)，混匀后于37℃反应10min，紫外分光光度计测定594nm处吸光度。抗氧化活性以相同吸光度值的feso4当量浓度表示。
实施例1
分别取过期30天的纯牛奶5g、茶多酚0.1g、甘露醇5g、蛋白胨5g、酵母粉5g、mgso4·7h2o1g加入1000ml蒸馏水充分溶解，用0.1mol/l的naoh和0.1mol/l的hcl溶液调节ph值为6.8，在121℃的高温灭菌锅中20min，冷却至不烫手加入5ml无水乙醇，继续冷却至室温，得到发酵培养基。取100ml发酵培养基分装至250ml灭菌后的锥形瓶中，放置12h，无杂菌长出方可使用。将活化后的木醋杆菌菌悬液(约1×107个/ml)按照5％(v/v)的量接种到分装后的发酵培养基上，在30℃的恒温恒湿箱中培养5天。
对照组1：分别取葡萄糖5g、甘露醇5g、蛋白胨5g、酵母粉5g、mgso4·7h2o1g加入1000ml蒸馏水充分溶解，用0.1mol/l的naoh和0.1mol/l的hcl溶液调节ph值为6.8，在121℃的高温灭菌锅中20min，冷却至不烫手加入5ml无水乙醇，继续冷却至室温，得到发酵培养基。取100ml发酵培养基分装至250ml灭菌后的锥形瓶中，放置12h，无杂菌长出方可使用。将活化后的木醋杆菌菌悬液(约1×107个/ml)按照5％(v/v)的量接种到分装后的发酵培养基上，在30℃的恒温恒湿箱中培养5天。
表1不同发酵培养基制备细菌纤维素膜得率及其性能对比表
表1数据可以看出牛奶-茶多酚发酵培养基的细菌纤维素得率产量比葡萄糖发酵培养基的产量提高13％，牛奶-茶多酚发酵培养基的细菌纤维素膜具有抗氧化能力和酪氨酸酶抑制能力，酪氨酸酶抑制率为42.11％，总抗氧化能力frap值为146μmol/l。
实施例2
分别取过期30天纯牛奶10g、茶多酚0.2g、甘露醇5g、蛋白胨5g、酵母粉5g、mgso4·7h2o1g加入1000ml蒸馏水充分溶解，用0.1mol/l的naoh和0.1mol/l的hcl溶液调节ph值为6.8，在121℃的高温灭菌锅中20min，冷却至不烫手加入5ml无水乙醇，继续冷却至室温。取100ml发酵培养基分装至250ml灭菌后的锥形瓶中，放置12h，无杂菌长出方可使用。将活化后的木醋杆菌菌悬液(约1×107个/ml)按照5％(v/v)的量接种到分装后的发酵培养基上，在30℃的恒温恒湿箱中培养5天。
对照组2：分别取葡萄糖10g、甘露醇5g、蛋白胨5g、酵母粉5g、mgso4·7h2o1g加入1000ml蒸馏水充分溶解，用0.1mol/l的naoh和0.1mol/l的hcl溶液调节ph值为6.8，在121℃的高温灭菌锅中20min，冷却至不烫手加入5ml无水乙醇，继续冷却至室温，得到发酵培养基。取100ml发酵培养基分装至250ml灭菌后的锥形瓶中，放置12h，无杂菌长出方可使用。将活化后的木醋杆菌菌悬液(约1×107个/ml)按照5％(v/v)的量接种到分装后的发酵培养基上，在30℃的恒温恒湿箱中培养5天。
表2不同发酵培养基制备细菌纤维素膜得率及其性能对比表
表2数据可以看出牛奶-茶多酚发酵培养基的细菌纤维素得率产量比葡萄糖发酵培养基的产量提高9.8％，牛奶-茶多酚发酵培养基的细菌纤维素膜具有抗氧化能力和酪氨酸酶抑制能力，酪氨酸酶抑制率为46.21％，总抗氧化能力frap值为196μmol/l。
实施例3
分别取过期30天纯牛奶15g、茶多酚0.3g、甘露醇5g、蛋白胨5g、酵母粉5g、mgso4·7h2o1g加入1000ml蒸馏水充分溶解，用0.1mol/l的naoh和0.1mol/l的hcl溶液调节ph值为6.8，在121℃的高温灭菌锅中20min，冷却至不烫手加入5ml无水乙醇，继续冷却至室温，得到发酵培养基。取100ml发酵培养基分装至250ml灭菌后的锥形瓶中，放置12h，无杂菌长出方可使用。将活化后的木醋杆菌菌悬液(约1×107个/ml)按照5％(v/v)的量接种到分装后的发酵培养基上，在30℃的恒温恒湿箱中培养5天。
对照组3：分别取葡萄糖10g、甘露醇5g、蛋白胨5g、酵母粉5g、mgso4·7h2o1g加入1000ml蒸馏水充分溶解，用0.1mol/l的naoh和0.1mol/l的hcl溶液调节ph值为6.8，在121℃的高温灭菌锅中20min，冷却至不烫手加入5ml无水乙醇，继续冷却至室温，得到发酵培养基。取100ml发酵培养基分装至250ml灭菌后的锥形瓶中，放置12h，无杂菌长出方可使用。将活化后的木醋杆菌菌悬液(约1×107个/ml)按照5％(v/v)的量接种到分装后的发酵培养基上，在30℃的恒温恒湿箱中培养5天。
表3不同发酵培养基制备细菌纤维素膜得率及其性能对比表
表3数据可以看出牛奶-茶多酚发酵培养基的细菌纤维素得率产量比葡萄糖培养基的产量提高11％，牛奶-茶多酚发酵培养基的细菌纤维素膜具有抗氧化能力和酪氨酸酶抑制能力，酪氨酸酶抑制率为57.54％，总抗氧化能力frap值为277μmol/l。
实施例4
分别取过期30天纯牛奶25g、茶多酚0.3g、甘露醇5g、蛋白胨5g、酵母粉5g、mgso4·7h2o1g加入1000ml蒸馏水充分溶解，用0.1mol/l的naoh和0.1mol/l的hcl溶液调节ph值为6.8，在121℃的高温灭菌锅中20min，冷却至不烫手加入5ml无水乙醇，继续冷却至室温，得到发酵培养基。取100ml发酵培养基分装至250ml灭菌后的锥形瓶中，放置12h，无杂菌长出方可使用。将活化后的木醋杆菌菌悬液(约1×107个/ml)按照5％(v/v)的量接种到分装后的发酵培养基上，在30℃的恒温恒湿箱中培养5天。
对照组4：分别取葡萄糖25g、甘露醇5g、蛋白胨5g、酵母粉5g、mgso4·7h2o1g加入1000ml蒸馏水充分溶解，用0.1mol/l的naoh和0.1mol/l的hcl溶液调节ph值为6.8，在121℃的高温灭菌锅中20min，冷却至不烫手加入5ml无水乙醇，继续冷却至室温，得到发酵培养基。取100ml发酵培养基分装至250ml灭菌后的锥形瓶中，放置12h，无杂菌长出方可使用。将活化后的木醋杆菌菌悬液(约1×107个/ml)按照5％(v/v)的量接种到分装后的发酵培养基上，在30℃的恒温恒湿箱中培养5天。
表4不同发酵培养基制备细菌纤维素膜得率及其性能对比表
表4数据可以看出牛奶-茶多酚发酵培养基的细菌纤维素得率产量比葡萄糖培养基的产量提高14％，牛奶-茶多酚发酵培养基的细菌纤维素膜具有抗氧化能力和酪氨酸酶抑制能力，酪氨酸酶抑制率为61.39％，总抗氧化能力frap值为346μmol/l。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。