本发明涉及植物提取技术领域，具体是涉及一种连翘发酵原液及其制备方法。
背景技术：
随着人们生活水平的提高，肥胖已经成为一个全球性公共健康问题。据统计，目前全球已有15亿超重患者和5亿肥胖患者，且肥胖所带来的负面影响已经超过酗酒和吸烟。2013年6月，美国医学协会正式将肥胖视作一种疾病。过度肥胖会导致许多相关疾病，如ⅱ型糖尿病、心血管疾病、胆囊疾病、骨关节炎、阻塞性睡眠呼吸暂停以及癌症。
胰脂肪酶(pancreaticlipase,pl)是由胰腺合成并分泌，是水解膳食脂肪最主要的酶，它负责50％-70％膳食脂肪的分解和消化，食物中的脂肪被pl水解为单酰甘油和游离脂肪酸后，在肠道被吸收，然后再体内重新合成脂肪，造成脂肪堆积，最终可导致肥胖。如果存在有效物质阻断pl对脂肪的分解，机体对脂肪的吸收就会减少，从而可以预防肥胖或减轻肥胖患者体重。近年来，由于天然产物具有来源广、成本低、副作用小等特点，得到人们越来越多的关注。对天然产物中pl抑制剂的研究也甚为广泛，如荷叶、黄芩、荞麦等。
连翘(forsythiasuspensa(thunb.)vahl)为木犀科连翘属植物，分布于中国、韩国和日本等国。我国山西、河南、陕西、河北等地均有分布。在民间，人们常采集连翘嫩叶加工为保健茶饮用。连翘果实为一年一结，易受气候等因素影响，而连翘叶资源丰富，且受气候等条件影响较小，因而越来越多的学者开始注重连翘叶研究。连翘叶主要成分与连翘相似，都包含苷类、黄酮类、苯乙醇类、木质素类等，具有保肝、护心、抑菌、抗氧化及抗衰老等作用。2004年，侯改霞等发现连翘叶提取物具有降血脂作用(连翘叶提取物的降血脂和抗疲劳作用研究[d]2004)；2018年，周菲等研究连翘叶中含有多于总抑制胰脂肪酶活性的物质，具有减肥作用(不同连翘叶炮制品抑制胰脂肪酶活性比较[j]山西大学学报2018)。
植物活性成分因其高的安全性和功能活性，已明显地渗入到食品、医药、化妆品等领域。因此，利用各种提取技术从植物中提取具有高活性的成分已经成为目前的研究热点。传统的提取技术包括有机溶剂提取法、热水提取法、系统溶剂提取法等，但这些方法产品安全性低、耗时长、提取率低。安全性高、提取率高和环保的新型提取方法越来越受到人们关注。微生物法提取植物活性成分是利用微生物在生产过程中分泌的多种酶，从而对植物中的活性成分进行提取和修饰。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述问题而提供了一种连翘发酵原液及其制备方法，该制备方法获得抑制胰脂肪酶活性成分高，疗效好。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种连翘发酵原液，所述发酵原液的制备原料包括连翘干粉、水和菌液。
微生物法提取植物活性成分是利用微生物在生产过程中分泌的多种酶，从而对植物中的活性成分进行提取和修饰，本发明将连翘与菌液混合进行发酵，来获得连翘的活性成分，结果表明，采用本发明的方法获得的连翘发酵液对pl具有良好的抑制率，且通过hplc分析，得到其中含有对胰脂肪酶抑制作用山柰酚-3-o-芸香苷、咖啡酸、连翘苷a，且含量高，能够有效抑制肥胖。
优选地，所述连翘干粉：菌液：水的配比为(10～20)g：(5～10)ml：(250～300)ml。
优选地，所述连翘干粉、菌液质量体积比为15：10。本申请发明人经过大量研究发现，当菌液与连翘叶干粉添加比例为10ml：15g时，对胰脂肪酶活性抑制率最佳；当连翘叶干粉量添加较少时，可能得到的发酵液中的有效成分较少，而其添加量较多时，可能过多的连翘叶干粉抑制了菌种的发酵效果导致发酵得到的有效成分含量下降，故二者对胰脂肪酶的抑制效果下降。
优选地，所述连翘叶干粉、菌液质量体积比为15：(7.5～10)。
优选地，所述连翘干粉为连翘叶干粉。
优选地，所述菌液的制备方法为1)挑取乳酸乳球菌落，一环于液体培养基中，放入摇床中将菌种活化，得到活化后的乳酸乳球菌；2)将得到的活化后的菌液梯度稀释铺板，以便获取单菌落，得到纯化后乳酸乳球菌；3)将得到纯化后的菌种接种到培养基中，在25℃的摇床中培养，当od值＝0.5～1.0时，得到发酵菌菌液。
一种连翘发酵原液的制备方法，包括以下步骤：
1)将连翘干粉、水和菌液混合得到初始体系，对初始体系进行发酵培养，得到连翘发酵液；
2)高温灭菌后，将发酵液用滤膜过滤，除去杂质，得连翘发酵原液；
优选地，所述步骤1)将初始体系在30～45℃摇床中发酵36～72小时。
优选地，所述步骤2)将发酵产物在80～110℃下灭菌15～30min，使菌种失活，得到灭菌后的发酵产物；将灭菌后的发酵产物在3500r/min，离心10～15min，收集上层清液，将发酵液用孔径为0.22或0.45μm的滤膜过滤，除去杂质，得连翘发酵原液。
优选地，所述菌液浓度为(105～108)cfu/ml。
优选地，所述步骤1)将初始体系在45℃摇床中发酵36小时。
优选地，所述步骤2)将发酵产物在110℃下灭菌30min，使菌种失活，得到灭菌后的发酵产物；将灭菌后的发酵产物在3500r/min，离心10min，收集上层清液，将发酵液用孔径为0.22或0.45μm的滤膜过滤，除去杂质，得连翘发酵原液。
优选地，所述液体培养基：5.5％果糖作为碳源，8％氯化铵作为氮源，2％酵母膏，ph值为7.0。
优选地，所述菌液浓度为(105～108)cfu/ml；
优选地，所述菌液的ph值为5.5～7.5。
本发明的有益效果：使用本发明的方法有效将连翘叶中有效成分的提取，提高其药用价值；安全性高、耗时短、提取率高，同时得到抑制胰脂肪酶活性成分含量高，疗效好，本发明得到的连翘叶发酵原液，可供制成液体制剂减脂，以便进行涂抹外用，人体无不适感，且能够有效解决现有现有抑制肥胖的技术手段，主要靠药物或减少食物摄入量来进行，该方式易引起人们肠胃不适的问题。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明的连翘叶干粉的制备方法为将连翘叶用水清洗干净后，高温灭菌，烘干，粉碎，过筛50目，制得连翘叶干粉。
本发明所述的菌液各个参数为：菌种为乳酸乳球菌；菌液浓度为105～108cfu/ml；菌液的ph值可为5.5～7.5，具体可为6.0；发酵液培养温度为35～45℃，时间为30～50h；液体培养基：5.5％果糖作为碳源，8％氯化铵作为氮源，2％酵母膏，ph值为7.0。
菌液的制备过程：挑取乳酸乳球菌落，一环于液体培养基中，放入摇床中将菌种活化，得到活化后的乳酸乳球菌。将得到的活化后的菌液梯度稀释铺板，以便获取单菌落，得到纯化后乳酸乳球菌；将得到纯化后的菌种接种到培养基中，在25℃的摇床中培养，当od值＝0.5～1.0时，得到发酵菌菌液(菌种处在对数期，浓度为105～108cfu/ml)。
实施例1
作为本发明一种连翘发酵原液的制备方法的一种实施例，该连翘原液的制备方法包括以下步骤：
1)将10ml发酵菌菌液接种到10g的连翘叶干粉和300ml的水中，得到发酵体系；将发酵体系在30℃摇床中发酵72小时，得到发酵产物。
2)将发酵产物在110℃下灭菌30min，使菌种失活，得到灭菌后的发酵产物；将灭菌后的发酵产物在3500r/min，离心10min，收集上层清液，采用0.22或0.45μm的滤膜进行抽滤，得到滤液为连翘发酵原液。
实施例2
作为本发明一种连翘发酵原液的制备方法的一种实施例，该连翘原液的制备方法包括以下步骤：
1)将10ml发酵菌菌液接种到15g的连翘叶干粉和300ml的水中，得到发酵体系；将发酵体系在45℃摇床中发酵36小时，得到发酵产物。
2)将发酵产物在110℃下灭菌30min，使菌种失活，得到灭菌后的发酵产物；将灭菌后的发酵产物在3500r/min，离心10min，收集上层清液，采用0.22或0.45μm的滤膜进行抽滤，得到滤液为连翘发酵原液。
实施例3
作为本发明一种连翘发酵原液的制备方法的一种实施例，该连翘原液的制备方法包括以下步骤：
1)将10ml发酵菌菌液接种到20g的连翘叶干粉和300ml的水中，得到发酵体系；将发酵体系在45℃摇床中发酵36小时，得到发酵产物。
2)将发酵产物在100℃下灭菌20min，使菌种失活，得到灭菌后的发酵产物；将灭菌后的发酵产物在3500r/min，离心10min，收集上层清液，采用0.22μm的滤膜进行抽滤，得到滤液为连翘发酵原液。
实施例4
作为本发明一种连翘发酵原液的制备方法的一种实施例，该连翘原液的制备方法包括以下步骤：
1)将5ml发酵菌菌液接种到10g的连翘叶干粉和250ml的水中，得到发酵体系；将发酵体系在45℃摇床中发酵36小时，得到发酵产物。
2)将发酵产物在80℃下灭菌30min，使菌种失活，得到灭菌后的发酵产物；将灭菌后的发酵产物在3500r/min，离心10min，收集上层清液，采用0.22μm的滤膜进行抽滤，得到滤液为连翘发酵原液。
实施例5
作为本发明一种连翘发酵原液的制备方法的一种实施例，该连翘原液的制备方法包括以下步骤：
1)将7.5ml发酵菌菌液接种到15g的连翘叶干粉和275ml的水中，得到发酵体系；将发酵体系在40℃摇床中发酵48小时，得到发酵产物。
2)将发酵产物在110℃下灭菌15min，使菌种失活，得到灭菌后的发酵产物；将灭菌后的发酵产物在3500r/min，离心15min，收集上层清液，采用0.22或0.45μm的滤膜进行抽滤，得到滤液为连翘发酵原液。
实施例6
对本发明制备的连翘发酵原液的抑制酶活性测定
1.tris-hcl缓冲溶液的配制
精确称取6.057gtris-hcl，再用hcl将溶液调到ph＝8.0，用蒸馏水定容至500ml。
2.连翘叶发酵溶液的配制
将实施例1至5制得的连翘叶发酵原液浓缩至粘稠状，再冷冻干燥，得粗提取物，备用。
准确称取干燥连翘叶提取物0.1g与1.5ml离心管中，溶于1mldmso溶液中，充分溶解后得1ml0.1g/ml连翘提取物的母液，实验时在反应体系中加入20μl连翘叶提取物溶液，得浓度为2000μg/ml粗提取物溶液。
3.pl溶液的配制
准确称取5mgpl，溶于10mltris-hcl(ph＝8.0)缓冲液，振荡，充分溶解，即得0.5mg/mlpl溶液，现配现用。
4.pnpb溶液的配制
准确移取pnpb11μl，加5ml乙腈，即得浓度为12mmolpnpb溶液，作为底物。
5.pl活力检测
准确移取100μlpl溶液与1.5ml离心管中，加入20μl连翘叶粗提取物溶液，用tris-hcl缓冲液定容至900μl，充分摇匀。反应体系中以不加人酶溶液作为空白，以不加入粗提物作为正常组。分别点入96孔板，每个溶液设4个复孔，37℃下孵育15min，立即加入20μlpnpb溶液，用酶标仪进行检测。检测波长为400nm，每3min测定一个点，测定15min，记录数据，计算吸光度随时间的变化率k。根据如下公式计算抑制率。每个反应重复三次。
抑制率(％)＝(k正常组-k实验组)/k正常组*100％
测试结果如下表1：
表1
从结果可以看出：本发明的得到的发酵原液对pl良好的抑制率，当菌液与连翘叶干粉添加比例为10ml：15g时，对胰脂肪酶活性抑制率最佳；当连翘叶干粉量添加较少时，可能得到的发酵液中的有效成分较少，而其添加量较多时，可能过多的连翘叶干粉抑制了菌种的发酵效果导致发酵得到的有效成分含量下降，故二者对胰脂肪酶的抑制效果下降。
实施例8
对实施例1至5进行hplc分析
连翘中的各成分对胰脂肪酶抑制作用为山柰酚-3-o-芸香糖苷，橙皮苷，芦丁，咖啡酸，连翘酯苷a，本发明对实施例1至5制备的发酵原液进行成分分析。
将制得的连翘叶发酵原液浓缩至粘稠状，再冷冻干燥，得粗提取物，备用。
取50mg连翘叶粗提取物于1.5ml离心管中，加入1ml40％乙醇溶液振荡混匀，用针筒式滤膜过滤器将溶液过滤到玻璃瓶中，进行hplc分析。
hplc检测条件：用c18色谱柱进行分离，检测波长270nm，柱温25℃，流速0.8ml/min，流动相为甲醇(a)和0.3％醋酸水溶液(b)，梯度洗脱：0～8min，30％～33％a；8～24min，33％～40％a；24～39min，40％～48％a；39～55min，48％～64％a。
发酵原液中含有的成分主要为：山柰酚-3-o-芸香苷，连翘苷，咖啡酸，连翘苷a；
不同实施例得到的各成分含量如下表2:
表2
结果表明，本发明发酵效果良好，得到的山柰酚-3-o-芸香苷、咖啡酸、连翘苷a含量高，其中以实施例2发酵效果较好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。