硫酸化紫锥菊多糖作为雏鸡免疫增强剂的应用的制作方法

本发明涉及兽医免疫制剂技术领域，更具体地，涉及硫酸化紫锥菊多糖作为雏鸡免疫增强剂的应用。

背景技术：

近些年来，我国养禽业的发展在不断壮大，但是在大量养殖的过程中容易出现大批量的病害，例如，鸡在养殖过程中，夏季高温容易引起的热应激，导致其免疫功能下降，引发一系列疾病；尤其是雏鸡，由于其自身免疫力本来就偏差，在养殖的过程中，饲料的改变、鸡舍的温湿度和外环境条件的变化很容易引起免疫力低下，影响其生长速度，而且容易发生一些免疫抑制性疾病，可使雏鸡的免疫力更差，发病率上升，疾病治疗困难，且使料肉比、料蛋比提高，造成养殖困难，养殖成本升高，严重影响养禽业的发展。

当前，国内外对免疫抑制性疾病主要以免疫预防为主，但免疫时容易引起较大的应激反应，如果机体的免疫力较低，有时还会激发疾病的发生。中药多糖因具有改善机体免疫功能、抗病毒、抗氧化、抑制肿瘤生长、抗衰老等广泛的生物活性，且具有绿色天然、毒副作用小、不易产生耐药性等特点，受到国内外学者的广泛研究，成为兽医领域研究的热点。

大量研究表明，许多中药及其有效成分具有一定的免疫增强作用，但是它们的作用较弱，尤其是中药，由于成分复杂，质量难以控制，国外难以接受。因此，有必要提高中药多糖的免疫作用，使其适合兽医临床上推广应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术中的不足和缺陷提供硫酸化紫锥菊多糖作为雏鸡免疫增强剂的应用。本发明通过对紫锥菊多糖进行硫酸化，制备得到硫酸化紫锥菊多糖，并测试其对于雏鸡的免疫力改善作用，结果表明硫酸化紫锥菊多糖可明显增加雏鸡外周血淋巴细胞和外周血细胞因子，提升雏鸡的免疫力，且维持雏鸡各脏器在健康水平；由此表明硫酸化紫锥菊多糖是一种安全、有效、质量可控的雏鸡免疫增强剂，在兽医临床方面具有潜在的应用价值。

本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：

硫酸化紫锥菊多糖作为雏鸡免疫增强剂的应用。以环磷酰胺为免疫抑制剂进行造模，对于造模后免疫力低下的雏鸡，硫酸化紫锥菊多糖可明显增加雏鸡外周血淋巴细胞和外周血细胞因子，提升雏鸡的免疫力，表明硫酸化紫锥菊多糖可作为雏鸡免疫增强剂进行应用。

本发明同时还保护硫酸化紫锥菊多糖在制备雏鸡免疫力增强药物或饲料中的应用。

优选地，所述硫酸化紫锥菊多糖在制备增加雏鸡外周血淋巴细胞药物或饲料中的应用。

优选地，所述硫酸化紫锥菊多糖在制备增加雏鸡外周血细胞因子药物或饲料中的应用。

优选地，所述外周血细胞因子为il-2、il-6或ifn-γ中的一种或多种。

硫酸化紫锥菊多糖作为环磷酰胺拮抗剂的应用也在本发明的保护范围内。

本发明所述硫酸化紫锥菊多糖通过以下过程制备得到：

s1.紫锥菊多糖的提取和纯化：采用水煎醇沉法从紫锥菊全株中提取紫锥菊总多糖，再采用sevage法去除多糖中的蛋白质、deae-52纤维素柱纯化，冷冻干燥，得到纯化紫锥菊多糖；

s2.紫锥菊多糖的硫化：采用氯磺酸-吡啶法对紫锥菊多糖进行硫酸化修饰，将带有搅拌子和冷凝装置的三颈烧瓶置冰水浴中；先加入预冷的无水吡啶100ml，搅拌使之充分冷却；再将16.7ml氯磺酸逐滴加入，见烧瓶中出现大量淡黄色固体，停止反应，酯化试剂制备完成；称取3g经纯化的紫锥菊多糖置锥形瓶中，加入适量n,n-二甲基甲酰胺；将上述酯化试剂倒入到锥形瓶中，盖紧瓶塞；将锥形瓶放在80℃水浴锅中的振荡反应3h；反应结束后，取出锥形瓶冷却至室温，用5mol·l-1的naoh溶液中和至ph＝7；边振摇锥形瓶边缓慢加入3～4倍体积的无水乙醇，使乙醇终浓度在80％，静置24h；抽滤取沉淀，加适量水溶解沉淀后，装入透析袋，先用自来水流水透析48h，再用蒸馏水透析24h，合并透析液减压浓缩，冷冻干燥，制得硫酸化紫锥菊多糖。

用改良苯酚-硫酸法和超声酸性铬酸钡法测定，制备得到的紫锥菊多糖中多糖质量占比为30.00％，硫酸根质量占比35.00％。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所述硫酸化紫锥菊对于因采用环磷酰胺为免疫抑制剂进行造模后免疫力低下的雏鸡，可明显增加雏鸡外周血淋巴细胞和外周血细胞因子，提升雏鸡的免疫力，表明硫酸化紫锥菊多糖可作为雏鸡免疫增强剂进行应用。

附图说明

图1为epp及sepp对免疫抑制鸡外周血血清中il-2含量的影响。

图2为epp及sepp对免疫抑制鸡外周血血清中il-6含量的影响。

图3为epp及sepp对免疫抑制鸡外周血血清中ifn-γ含量的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1

硫酸化紫锥菊多糖的制备，具体过程如下：

(1)紫锥菊多糖的提取和纯化：采用水煎醇沉法从紫锥菊全株中提取紫锥菊总多糖，673g紫锥菊全株，80％的乙醇浸泡过夜，70℃水浴回流2次(每次1h)，用纱布包裹药材，用水反复煎煮2次，武火加热至沸腾，文火维持其沸腾，合并两次煎煮所得药液，浓缩，使生药浓度达到1g/ml，4500r/min，离心5min，除杂，取上清反复醇沉3次，冷冻干燥得紫锥菊多糖样品；再采用sevage法去除多糖中的蛋白质、deae-52纤维素柱纯化，冷冻干燥，得到纯化紫锥菊多糖(epp)；

(2)紫锥菊多糖的硫化：采用氯磺酸-吡啶法对紫锥菊多糖进行硫酸化修饰，并优化修饰工艺条件，修饰后的多糖经透析纯化，冷冻干燥，制得硫酸化紫锥菊多糖(sepp)。

用改良苯酚-硫酸法和超声酸性铬酸钡法测定，制备得到的硫酸化紫锥菊多糖中多糖质量占比为30.00％，硫酸根质量占比35.00％。

实施例2应用例

1、免疫抑制模型制备

以环磷酰胺免疫抑制剂进行造模，环磷酰胺免疫抑制主要是通过环磷酰胺代谢产物磷酰胺氮芥和丙烯醛发挥作用。其代谢产物能够与dna产生共价结合，引起dna双链断裂、烷基化，蛋白质与dna交叉连接，从而干扰细胞生长繁殖。造模后的雏鸡免疫系统的免疫功能和活性降低，抵抗疾病的能力低下，容易受到病原微生物感染的状态。

具体的造模过程如下：320羽1日龄岭南黄公鸡，适应性饲养14d后，随机分成8个组，每组40只，分别为生理盐水对照组(nc)、环磷酰胺组(cy)、sepph组、seppm组、seppl组、epph组、eppm组、eppl组，除nc组外，其余的7组分别采用肌肉注射cy进行造模，连续注射3d，每天的注射量为80mg/kg，nc组连续3d注射等量生理盐水。

其中sepph组、seppm组和seppl组分别代表给药硫酸化紫锥菊多糖的高剂量组、中剂量组和低剂量组，给药剂量分别为每次灌胃10mg/kg、5mg/kg和2.5mg/kg；epph组、eppm组和eppl组，分别代表给药紫锥菊多糖(为进行硫酸化处理)的高剂量组、中剂量组和低剂量组，给药剂量分别为每次灌胃10mg/kg、5mg/kg和2.5mg/kg。本实施例所采用的紫锥菊多糖和硫酸化紫锥菊多糖均为实施例1制备得到。

给药过程：nc组连续3d注射等量生理盐水，其余的7组分别采用连续3d肌肉注射cy进行造模，第3d后24h开始给药，给药剂量见表1所示。

表1试验分组与处理

给药后每天观察鸡群的生长情况，分别在首次给药后第7、14、21和28d记录每组肉鸡体重情况，各组随机选取5只鸡，称量体重，采取肝、脾、肾，称量并记录重量，统计并计算脏器指数。统计结果见表2所示。

表2sepp和epp对cy免疫抑制鸡体重和脏器指数的影响

注：同列肩标相同字母或没有字母者表示差异不显著(p>0.05)，肩标不同字母者表示差异显著(p<0.05)。

由表2可知，试验期间cy造模后雏鸡体重低于nc组，而各sepp、epp给药组雏鸡体重均高于cy组，其中在首次给药7d、21d时，各sepp、epp给药组雏鸡体重均显著高于cy组(p<0.05)，而与nc组差异不显著(p>0.05)；比较试验期间cy造模后雏鸡免疫器官脏器指数结果发现，给药7d后肝指数、脾指数、肾指数均低于nc组，其中脾指数与肾指数显著低于nc组(p<0.05)，而各sepp给药组在给药7d后雏鸡肝指数、脾指数、肾指数均与nc组无显著差异(p>0.05)。

2、硫酸化紫锥菊多糖对鸡外周血淋巴细胞增殖测定

在首次给药后第7、14、21和28d，各组随机选取5只鸡无菌心脏采血，用预先准备好的hank’s液倍比稀释采集的血样，将倍比稀释后的血样小心缓慢以1:1加在淋巴细胞分离液上层，2000r/min，离心10min，吸取中间层乳白色云雾状细胞，用hank’s洗涤2次，1500r/min，离心10min，加入含2％双抗和10％胎牛血清的rpmi1640培养液。将上述得到的淋巴细胞的浓度调整为2×10⁶个/ml，加入96孔细胞版，每孔100μl，置于37℃，5％co2培养箱中培养44h，每孔加入mtt30μl(5mg/ml)，继续培养4h，在酶标仪上测定a570值。检测结果见表3所示。

表3sepp和epp对免疫抑制鸡外周血淋巴细胞转化的影响

注：同表2。

由表3可知，试验期间造模后cy组雏鸡外周血淋巴细胞转化作用低于nc组，而各给药治疗组均能提高造模后雏鸡外周血淋巴细胞转化作用；在首次给药第7d时，seppm与eppm组的外周血淋巴细胞a570值显著高于cy组(p<0.05)；14d时，sepph组淋巴细胞a570值最高，其中sepph、seppm组和epp各组的淋巴细胞a570值均显著高于cy组(p<0.05)；21d时，sepph组淋巴细胞a570值最高，其中sepph、seppm和epp各组的淋巴细胞a570值显著大于cy组；28d时，seppl组淋巴细胞a570值最高且显著高于cy组(p<0.05)。

3、硫酸化紫锥菊多糖对鸡外周血细胞因子测定

在首次给药后第7、14、21及28d，分别每组随机选取5只鸡心脏采血3ml，室温下析出血清，用2ml离心管分装，分别用于elisa法测定血清中细胞因子il-2、il-6及ifn-γ。

测试结果如图1至3所示，图1至图3分别为鸡外周血血清中il-2、il-6及ifn-γ的含量结果。图1至图3中的字母标注含义同表2中一致。

从图1中可知，通过比较各组鸡外周血血清中il-2含量，试验期间cy造模后鸡外周血血清中il-2含量降低，给药治疗后鸡外周血血清中il-2含量升高。首次给药7d时，nc组、sepph组、seppm组和epph组il-2含量均高于cy组；14d时，sepp各组和epp各组il-2含量显著高于cy组(p<0.05)；21d时，seppl组il-2含量最高且显著高于nc组和cy组(p<0.05)；28d时，seppl组il-2含量最高。

从图2中可知，比较各组鸡外周血血清中il-6含量，试验期间cy造模后鸡外周血血清中il-6含量降低，给药治疗后鸡外周血血清中il-6含量升高。首次给药7、14、28d时，各sepp组和epp组il-6含量升高，但与cy组差异不显著；21d时，epp各组、seppm组和seppl组显著高于cy组和nc组(p<0.05)。

由图3比较各组鸡外周血血清中ifn-γ含量可知，试验期间cy造模后鸡外周血血清中ifn-γ含量降低，给药治疗后鸡外周血血清中ifn-γ含量升高。

综上所述，epp及sepp均能显著提高cy诱导免疫抑制鸡体重、肝指数、脾指数和肾指数，以及提高外周血淋巴细胞增殖，sepp的红外光谱中，在808.98cm^-1处出现强的伸缩振动峰，为c-o-so3有关的对称性c-o-s吸收峰，表明epp硫酸化修饰成功sepp作用明显优于epp。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。