一种抗肿瘤的联合用药物的制作方法

本发明属于药物领域，具体涉及一种抗肿瘤的联合用药物。

背景技术：

恶性肿瘤是当前人类健康的主要杀手，是严重威胁人类生命的最主要的疾病之一。肿瘤综合治疗主要是外科手术、放射治疗和肿瘤化疗。药物在恶性肿瘤化疗中发挥着重要作用。近年来，抗肿瘤药物的研究与开发工作使肿瘤化疗取得很大进步，上世纪卡铂、紫杉醇等药物的应用，使某些特定肿瘤有了很高的治愈率。但由于抗肿瘤药物存在选择性差，毒副作用大，耐药性等缺陷，目前仍有半数以上肿瘤患者对治疗无反应或耐药而最终导致治疗失败，特别是实体肿瘤的治疗。

瑞香素(daphnetin)，化学名7,8-二羟基香豆素(7，8-dihydroxycoumarin)，又名祖师麻甲素，是香豆素类化合物的代表性单体成分，为我国自主研发的天然药物之一，是较早用于抗肿瘤研究的中药成分之一。

目前还未见将瑞香素与化疗药物联合使用来治疗肿瘤的相关报道。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了瑞香素在制备ido1抑制剂中的用途。

本发明还提供了一种抗肿瘤的药物组合物，它是由瑞香素和抗肿瘤药物组成。

进一步地，所述瑞香素与抗肿瘤药物的使用剂量比为1:(0.033～5)；其中，所述抗肿瘤药物为环磷酰胺、多柔比星、顺铂、紫杉醇；优选的，所述抗肿瘤药物为紫杉醇。

本发明还提供了前述的药物组合物的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：按照比例取瑞香素和抗肿瘤药物，制成溶液，混合，即可。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物制剂，它是以前述的药物组合为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

本发明还提供了一种抗肿瘤的联合用药物，它含有相同或者不同规格的同时或者分别给药的瑞香素和抗肿瘤药物，以及药学上可接受的载体。

进一步地，所述瑞香素与抗肿瘤药物的使用剂量比为1:(0.033～5)；其中，所述抗肿瘤药物为环磷酰胺、多柔比星、顺铂、紫杉醇；优选的，所述抗肿瘤药物为紫杉醇。

本发明还提供了瑞香素和抗肿瘤药物联用在制备抗肿瘤药物中的用途。

进一步地，所述瑞香素与抗肿瘤药物的使用剂量比为1:(0.033～5)；其中，所述抗肿瘤药物为环磷酰胺、多柔比星、顺铂、紫杉醇；优选的，所述抗肿瘤药物为紫杉醇。

进一步地，所述肿瘤选自乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤；优选的，所述肿瘤选自乳腺癌。

实验结果证明，瑞香素与其他抗肿瘤药物联合使用后具有显著的抗肿瘤作用。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为瑞香素对ido1酶的ic50。

图2为瑞香素抑制过表达的ido1。

图3为瑞香素下调ido1表达。

图4为瑞香素对hela细胞的增殖作用。

图5为不同浓度的瑞香素对mcf-7细胞增殖的影响。

图6为瑞香素与化疗药物联用对肿瘤细胞的影响。

具体实施方式

实施例1、瑞香素对ido1酶活性的影响

1实验材料

1.1细胞和质粒

人宫颈癌细胞hela、人胚肾细胞hek-293a购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心，由中国科学院成都生物研究所天然产物中心实验室保存；idocdna购自北京义翘神州科技有限公司。

1.2试剂

瑞香素(daphnetin)购自上海源叶生物科技有限公司；epacadostat购自上海蓝木化工有限公司；人干扰素ifn-γ购自南京金斯瑞生物科技有限公司；ido1兔多抗、gapdh兔多抗购自武汉三鹰生物技术有限公司；转染试剂lipofectamine2000购自赛默飞世尔科技公司；easyseewesternblotkit发光液购自北京全式金生物技术有限公司；增强型cck-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3仪器

verioskanflash多功能读数仪(thermofisher)；imagequantlas500一体化成像仪(gehealthcare)。

2实验方法

2.1细胞培养

人宫颈癌细胞hela、人胚肾细胞hek-293a均在dmem-高糖培养基(10％新生牛血清，100u/ml氨苄青霉素及100mg/ml链霉素)，5％co2，37℃细胞培养箱中培养。

2.2ido1抑制剂筛选

hela细胞按1.0×10⁵个/孔接种至48孔板，37℃培养过夜。每孔加入适量待测试药物，epacadostat作为阳性对照药，培养24h。每孔加入50ng/mlifn-γ培养24h以诱导细胞内ido产生。取100μl细胞培养液至离心管中，加入25μl30％的tca，50℃水浴30min，10000gpm离心10min，取100μl上清液至96孔板中，每孔加入100μl2％的对二甲氨基苯甲醛(pdab)，混匀后室温静置10min，多功能读数仪检测a492。

2.3免疫印迹分析

hela细胞按1.0×10⁶个/孔接种至6孔板，37℃培养过夜。每孔加入不同浓度瑞香素，epacadostat作为阳性对照药，培养24h。每孔加入50ng/mlifn-γ培养24h以诱导细胞内ido产生。吸去培养基，pbs漂洗细胞3次，加入适量ripa裂解液，冰浴30min裂解细胞，用细胞刮刀将细胞刮下，12000gpm离心，收集上清液为蛋白提取液。加入5×loadingbuffer沸水浴5min，制得蛋白样品。12％sds-page电泳分离蛋白，用半干法将蛋白转印至nc膜。转膜结束后，放入tbst配置的5％bsa中封闭2h。封闭后膜与一抗(1:1000稀释)4℃孵育过夜，用tbst漂洗3次，与hrp标记的二抗(1:5000稀释)在室温孵育2h后，tbst漂洗3次，按照easyseewesternblotkit发光液说明书进行显色，通过gehealth成像系统进行成像。

2.4hek-293a过表达ido

hek-293a细胞按1.0×10⁶个/孔接种至6孔板，37℃培养过夜。在转染前2h将培养液更换为无血清无双抗培养液。用125μlopti-mem稀释2.5μgidocdna，另用125μlopti-mem稀释5μllipofectamine2000，轻轻混匀，室温静置5min。将质粒稀释液滴加至稀释好的转染试剂中，室温静置20min，将混合液滴加至6孔板中，37℃培养6h更换为完全培养基，37℃继续培养24h过表达ido。

2.5hela细胞增殖

hela细胞按5000个/孔接种至96孔板，37℃培养过夜。加入不同浓度瑞香素，培养24h，每孔加入10％增强型cck-8溶液，在37℃继续培养0.5-1h。当培养液颜色变黄时，多功能读数仪检测450nm吸光度。

2.6数据统计与处理

所有实验均重复三遍，结果表示为平均值±标准差，运用graphpadprism软件进行单因素方差分析(oneway-anova)，p<0.05为具有显著性差异。

3实验结果

3.1ido1抑制剂筛选

从图1可以看出，用不同浓度的瑞香素检测对ifn-γ诱导的hela细胞表达ido1酶抑制作用，采用graphpadprism软件对ic50值进行计算。其中瑞香素的ic50值为16.50±0.33μm，说明瑞香素在体外具有良好的ido1酶抑制作用。

3.2hek-293a过表达ido1

ido1在肿瘤细胞中高表达，而在多数细胞之中处于沉默状态。在hek-293a中过表达ido1，检测瑞香素对ido1酶的抑制作用。pcmv3-ido1质粒转染至hek-293a细胞24h后，加入不同浓度的瑞香素处理6h，细胞上清液检测ido1活性，结果如图2所示，瑞香素均能够抑制过表达的ido1酶活性，并且随着浓度增加该抑制作用加强。以上结果表明，瑞香素可以直接抑制ido1的活性。

3.3ido1的免疫印迹

不同浓度的瑞香素处理hela细胞，westernblot检测ido1蛋白的表达情况，结果如图3所示。50ng/ml的ifn-γ可以促进ido1蛋白显著表达，而瑞香素可以明显地抑制ifn-γ上调ido1的作用，并且随着化合物浓度的增加，抑制作用越明显，以上结果表明，瑞香素抑制ido1活性很有可能是通过下调ido1的表达。

3.4hela细胞增殖

分别用不同浓度的瑞香素处理hela细胞24h，cck-8检测化合物对hela细胞增殖的影响，结果如图4所示。在低浓度下，瑞香素对hela细胞没有明显的细胞毒作用，表明在低浓度的条件下，化合物下调hela细胞的ido1的表达并不是因为对细胞的毒性作用引起的。

实施例2、瑞香素与抗肿瘤药物联合使用的实验

1实验材料

1.1细胞和动物

人乳腺癌细胞株mcf-7、mda-mb-231由美国国家癌症研究所cowan博士馈赠，由中国科学院成都生物研究所天然产物中心实验室保存；spf级icr健康雌性小鼠，体重18-22g，购自成都达硕实验动物有限公司，许可证号：syxk(川)2018-189。

1.2药品与试剂

增强型cck-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；瑞香素(daphnetin)购自上海源叶生物科技有限公司；人干扰素ifn-γ购自南京金斯瑞生物科技有限公司；环磷酰胺(cyclophosphamide,ctx)购自美国sigma公司；多柔比星(doxorubicin,dox)注射液购自上海旭东海普药业有限公司；顺铂(cisplatin,ddp)注射液购自江苏豪森药业集团有限公司；紫杉醇(paclitaxel,ptx)购自北京双鹭药业股份有限公司；注射用盐酸博来霉素(bleomycin,blm)购自海正辉瑞制药有限公司；rmpi1640培养基购自美国hyclone公司；优质胎牛血清(fetalbovineserum,fbs)购自上海生工生物工程股份有限公司。

2实验方法

2.1细胞培养

人乳腺癌mcf-7及mda-mb-231细胞均以含10％fbs的rmpi1640完全培养基，于37℃条件下在5％co2细胞培养箱中培养。

2.2原位乳腺癌小鼠模型建立及分组

收集对数生长期的mda-mb-231细胞悬液，与matrigel胶按1∶1混合，在无菌条件下以1×10⁷/0.2ml接种于icr健康雌性小鼠右侧第四对乳房垫下，连续培养16-20d。待造模成功后，将小鼠随机分为空白对照组、化疗药物组及化疗药与瑞香素联合用药组。

其中，化疗药物组及联合用药组化疗药物给药方式及途径如表1所示，联合用药组瑞香素采用口服缓释给药(10mg/kg/d)，空白对照组给予等量生理盐水。

表1不同化疗药物给药方式及途径

注：i.v.:intravenousinjection，静脉注射；qd:quaquedie，一天一次。

2.3细胞活力测定

取对数生长期的mcf-7细胞接种于96孔板(1.0×10³/孔)，待细胞贴壁后加入25ng/mlifn-γ孵育10–12h，弃去上清，加入生理盐水或不同浓度的药物继续培养，每组设6个复孔。待培养12h、24h、48h及72h后，每孔加入20μlcck-8溶液(5mg/ml)，避光温育4h后用酶标仪于450nm处测光密度值(opticaldensity,od)，实验重复3次，计算细胞抑制率(inhibitionrate,ir)。ir＝[(od对照组-od加药组)/od对照组]×100％。

2.4原位瘤体积测定

给药三周后，用游标卡尺测量各组动物瘤结节的长(l)和宽(w)，按椭球形体积公式(v＝lw²/2)计算肿瘤体积并求各组平均值，比较各治疗组的体积抑瘤率。抑瘤率(％)＝(空白对照组移植瘤体积－治疗组移植瘤体积)/空白对照组移植瘤体积×100％。

2.5统计学处理

应用spss15.0软件进行统计学处理，计量资料以mean±sd表示，两组以上数据比较采用单因素方差分析(one-wayanova)，组间比较采用t检验，p<0.05表示差异有统计学意义。

3实验结果

3.1瑞香素联合浓度的确定

用不同浓度的瑞香素处理mcf-7细胞72h，cck-8检测化合物对hela细胞增殖的影响。图5表明：瑞香素(2.5～640μmol·l^-1)可浓度依赖性地抑制mcf-7细胞的增殖。2.5μmol·l^-1瑞香素对mcf细胞的ir为(8.73±1.45)％，小于20％，被选择为联合浓度做后续实验。

3.2瑞香素可增强多种化疗药物的反应活性

表2不同化疗药物与瑞香素配伍对乳腺癌原位肿瘤的抑制作用

^**：p<0.05vs–daphnetingroups.

制备乳腺癌原位模型后，分别采用单纯化疗药、瑞香素与化疗药物联合用药后测定原位瘤体积。表2显示，与单纯化疗药物处理组相比，瑞香素与化疗药物联合处理组原位瘤体积减少，抑瘤率明显升高(p<0.05)，这表明瑞香素可提高肿瘤组织对抗肿瘤药物的敏感性。

3.3瑞香素可增强肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性

预先用ifn-γ诱导ido1蛋白表达后，以生理盐水、瑞香素、紫杉醇以及联合用药共同作用mcf-7细胞，并以cck-8检测细胞活力。图6表明，瑞香素只产生了轻微的抗肿瘤作用；而2.5μmol·l^-1瑞香素与紫杉醇联合应用后，紫杉醇对mcf-7的细胞毒性增强(p<0.05)，这表明ido抑制剂与化疗相结合可能是提高临床治疗乳腺癌的有效途径。

综上，瑞香素与其他抗肿瘤药物联合使用后具有显著的抗肿瘤作用，可提高肿瘤组织对抗肿瘤药物的敏感性，应用前景优良。