本发明涉及一种用于易损斑块的纳米药物。
背景技术:
动脉粥样硬化引起的心肌梗死和心源性猝死等急性心血管事件已成为危害人类健康的头号杀手,而动脉粥样硬化易损斑块所导致的斑块破裂以及继发血栓形成是引起急性心血管事件的主要因素。易损斑块的病理学特征包括:薄纤维帽、巨大的坏死核心、斑块内炎性细胞大量浸润、平滑肌和胶原纤维减少。其中,单核巨噬细胞通过吞噬氧化低密度脂蛋白形成泡沫细胞,参与脂质核心的形成和发展,同时释放大量的炎症因子诱发斑块的炎症反应,使斑块稳定性降低,易于破裂。因此,在发病前预先识别易损斑块,评估患者心血管事件风险并进行有效干预至关重要。
在治疗方面,目前用于易损斑块造成动脉管腔狭窄的主要手段包括药物干预和手术治疗。药物干预包括口服降脂类药物、抗血小板及抗凝药物,手术主要为经皮冠状动脉血管成形术及冠状动脉搭桥术。其中口服药物的靶向性较差,没有针对易损斑块进行特异性的有效治疗,而手术为有创手段,有可能在病变部位造成进一步机械性损伤,且价格昂贵。
光动力治疗(pdt)已广泛应用于皮肤恶性肿和多种非肿瘤疾病的治疗,其优势在于创伤小,选择性高,仅针对光照区域内的病变组织进行治疗而不影响病灶周围正常组织,且治疗强度可随时调整,并定期进行规律治疗。但pdt难以用于心血管疾病的治疗中,其原因在于:一、光的穿透深度有限,不易穿透进病灶部位;二、斑块面积较小,其治疗参数难以确定。因而对光敏剂种类的选择、剂量和光照的强度及作用时间都提出了严峻的考验。
在诊断方面,目前临床上用于诊断易损斑块的影像学手段包括光学相干断层成像(oct)和血管内超声(ivus)等。其中,ivus可显示斑块内部的结构和性质。oct可评估斑块的性质和稳定性,区分纤维斑块、钙化斑块和富含脂质的斑块等,具有分辨率高和穿透力强的特点。然而这些检查手段都是有创的,难以在早期无创动态监测易损斑块的发生和发展的过程,也不适合用于易损斑块早期精准筛查。
分子影像技术可以在生物活体状态从分子水平监测疾病相关标志物的动态变化,反映疾病的病理演变过程,同时还可针对特异性分子靶点有效干预,对易损斑块进行治疗。近年来,分子影像技术越来越多的运用于心血管疾病的研究中。但目前用于研究的纳米材料主要有以下不足:第一、很多重金属材料和荧光剂毒性大,临床应用可能性小;第二、材料结构稳定性差,且进入生物体内后滞留时间短,不易观察;第三、纳米材料粒径过大,不易进入斑块内部,无法对斑块灵敏识别及有效治疗。
技术实现要素:
鉴于上述问题,本发明的第一方面旨在提出一种用于易损斑块的纳米药物,其使得易损斑块的光动力治疗成为可能。
本发明的用于易损斑块的纳米药物,其中包含有icg,icg在检查阶段作为荧光剂,在治疗阶段作为光敏剂。
优选地,所述纳米药物被hsa包载。
优选地,所述hsa耦联有ce6。
优选地,所述hsa耦联有opn的活性短肽。
优选地,所述opn的活性短肽的氨基酸序列为:leu-arg-ser-lys-ser-arg-ser-phe-gln-val-ser-asp-glu-gln-tyr-pro-asp-ala-thr-asp-glu。
优选地,所述纳米药物中还包含有tpz,tpz作为乏氧细胞增敏剂。
本发明的第二方面旨在提出一种用于易损斑块的纳米药物,其能够对易损斑块进行治疗。
本发明的用于易损斑块的纳米药物,其中包含有tpz,tpz作为乏氧细胞增敏剂。
优选地,所述纳米药物被hsa包载。
优选地,所述hsa耦联有opn的活性短肽。
优选地,所述opn的活性短肽的氨基酸序列为:leu-arg-ser-lys-ser-arg-ser-phe-gln-val-ser-asp-glu-gln-tyr-pro-asp-ala-thr-asp-glu。
本发明的第三方面旨在提出一种用于光动力治疗的光敏剂,提高提高光动力治疗时光在组织中的穿透深度。
icg(吲哚菁绿)是一种近红外染料,它是为数不多的被美国fda批准应用临床的染料,安全性高。icg多用于荧光剂,用于近红外荧光/光声成像。本发明中,icg不但可以在检查阶段作为荧光剂使用,而且在治疗阶段还可以作为光敏剂使用,使得光动力治疗可以被应用于心血管疾病的治疗。
tpz(替拉扎明)目前已成熟用于临床抗肿瘤治疗,安全性高且效果良好,但尚未用于动脉粥样硬化的治疗,本发明中将tpz用作治疗易损斑块的乏氧细胞增敏剂,有效增加易损斑块治疗效率。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的靶向荧光/磁共振双模态载药纳米颗粒的扫描电镜照片。
图2为本发明实施例1制备的载药纳米颗粒形成的纳米体系的水合粒径分布图。
图3为本发明实施例1制备的载药纳米颗粒在250nm-850nm之间的紫外吸收光谱。
图4为本发明实施例1制备的载药纳米颗粒在不同时长808nm激光照射下产生的单线态氧含量。
图5为巨噬细胞与吞噬氧化低密度脂蛋白(ox-ldl)后形成的泡沫细胞对非靶向纳米药物(nnps)、主动靶向纳米药物(fnps)及竞争抑制组(fnps+opnpeptide)的摄取情况。
图6为cck-8实验验证单纯培养基组(control)、单纯激光照射组(laser),及在不同浓度下,无光照包载tpz纳米药物组(nps)、光照下不包载tpz纳米药物(nps(tpz-)+laser)和光照下包载tpz纳米药物组(nps+laser)对巨噬细胞的杀伤能力。
图7为非靶向纳米药物(nnps)与主动靶向纳米纳米药物(fnps)对健康小鼠(control)和颈动脉易损斑块模型小鼠(as)活体荧光成像图。
图8为非靶向纳米药物(nnps)与主动靶向纳米纳米药物(fnps)对健康小鼠(control)和颈动脉易损斑块模型小鼠(as)活体磁共振成像图。
图9为在光照前后,无光照包载tpz纳米药物组(nps)、光照下不包载tpz纳米药物(nps(tpz-)+laser)和光照下包载tpz纳米药物组(nps+laser)治疗后颈动脉易损斑块模型小鼠活体磁共振成像图;
图10为实施例1的制备流程示意图。
具体实施方式
下面,结合附图,对本发明进行详细说明。
本发明中用到的各种材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到。
实施例1:
本发明的纳米药物,由人血清白蛋白(hsa)分别与二氢卟吩e6(ce6)和能特异性结合opn的活性短肽(氨基酸序列为leu-arg-ser-lys-ser-arg-ser-phe-gln-val-ser-asp-glu-gln-tyr-pro-asp-ala-thr-asp-glu)相耦联,再通过静电作用力共包载吲哚菁绿(icg)和替拉扎明(tpz),最终形成纳米颗粒。hsa是骨架材料载体;ce6可螯合mn2+对斑块行磁共振成像;opn活性短肽用于靶向易损斑块;icg既可对斑块荧光成像,又是光动力治疗的光敏剂;tpz是乏氧细胞增敏剂,能够在光动力治疗后斑块内部呈乏氧状态时,进一步杀伤细胞,发挥治疗作用,目前已成熟用于临床抗肿瘤治疗,安全性高且效果良好,但尚未用于动脉粥样硬化的治疗。
其中先将opn短肽通过traut’sreagent巯基化后与hsa上的马来酰亚胺基共价连接;在催化剂作用下,ce6上的羧基活化后与hsa上的氨基共价连接:再通过静电作用力于pbs溶液中共包载icg和替拉扎明tpz。
上述步骤包括:
hsa与ce6的耦联方法如下:
(1)称取0.01mmol的ce6(5.97mg),超声溶于100uldmso中;
(2)待edc恢复室温后打开,称取0.01mmol(1.92mg),超声溶于100uldmso;
(3)称取0.011mmol的nhs(1.27mg);
(4)将edc溶液移入ce6溶液中,剧烈震荡10s,而后用混合液震荡溶解nhs,避光摇动30min,以完成ce6上羧基活化的过程;
(5)称取40mghsa,溶于2mlpbs溶液(1x,ph7.4);
(6)待活化完成后,将第(4)步的混合液迅速加至hsa溶液中,充分震荡20s,室温避光摇晃过夜;
(7)第二天,将混合液离心(15000g,5min),除去沉淀,收集上层的液体;
(8)向混合液中加入pbs,使其总体积达20~40ml(即hsa浓度在1~2mg/ml之间),然后用分子量为30kd的超滤管进行离心纯化三次,以除去游离的ce6;
(9)将最后得到的hsa-ce6溶于2mlpbs中,然后测定其紫外吸光度值,对其中的hsa和ce6进行定量。
hsa与opn活性短肽耦联方法如下:
(1)opn活性短肽的巯基化:
优选地,opn活性短肽与traut’sreagent摩尔比为1:2,分别称取0.02mmolopn活性短肽(50mg)与0.04mmoltraut’sreagent(5.6mg)。将50mgopn活性短肽溶于5mlsbbuffer(0.2m,ph8),将5.6mgtraut’sreagent溶于1mlsbbuffer(0.2m,ph8)。将两者混合后,室温震荡反应1h,移至4℃保存待用;
(2)hsa与sulfo-smcc连接:
优选地,sulfo-smcc与hsa摩尔比为7.5:1,称取40mghsa溶于pbs溶液(0.1m,ph7.4),取2mgsulfo-smcc溶于0.2mldmso,混合后室温下搅拌反应30min。而后使用分子量为30kd的超滤管离心纯化三次,以除去游离的sulfo-smcc;
(3)hsa-smcc上的马来酰亚胺与opn活性短肽上的巯基耦联:
取1.8ml第(1)步巯基化后的opn活性短肽溶液加入4mlhsa-smcc溶液中,室温下搅拌反应2h。然后使用分子量为30kd的超滤管离心纯化三次,最终溶于4ml的超纯水中。此时hsa-opnpeptide终浓度约为10mg/ml;
icg-tpz-hsa-ce6-opnpeptide纳米药物(fnps)的制备:
(1)配制10%hsa溶液1ml;
(2)每次hsa与ce6耦联后,测定其紫外吸光度值得出hsa浓度。优选地,设定hsa-ce6,hsa-opnpeptide,10%hsa三种溶液中hsa的质量比为3:5:2,hsa总质量为30mg。根据其各自浓度算出相应体积;
(3)高温消毒蒸干后的玻璃小瓶中放入磁子,依次加入上一步算得体积的三种溶液,然后加入pbs溶液(1x,ph7.4),使溶液总体积为4ml。将小瓶置于磁力搅拌器上搅拌;
(4)称取2mgicg超声震荡溶于20μldmso;
(5)称取2mgtpz超声震荡溶于20μldmso;
(6)将10μlicg溶液与40μltpz溶液在搅拌状态下逐滴缓慢加入第(3)步hsa溶液中;
(7)将20μl戊二醛加入2mlpbs溶液中(1x,ph7.4),充分震荡溶解后,取200μl缓慢加入上述溶液中,避光搅拌30h。
(8)使用分子量为100kd的超滤管离心纯化三次,最终溶于1mlpbs溶液中(1x,ph7.4)。
图1是上述载药纳米颗粒的扫描电镜照片(ht-7700,hitachi),可见纳米颗粒粒径均一,大小约为20nm。
图2是上述载药纳米颗粒水合粒径分布图(nanozs,malvern),可见粒径分布以20-40nm之间为主,体系较稳定,不易发生集聚现象。
图3为上述载药纳米颗粒在250-850nm间的紫外吸收光谱(uv-1800,mapada),在278nm、420nm、475nm和780nm处分别测得hsa、ce6、tpz和icg的特征吸收峰,可见纳米颗粒制备成功,且可通过紫外吸收光度值测出各组分的浓度。
图4为上述载药纳米颗粒在不同时长808nm激光照射下产生的单线态氧含量。可见随时间延长,载药纳米颗粒在激光照射下能够迅速产生大量单线态氧,随后逐渐趋于稳定。
实施例2:
icg-tpz-hsa-ce6非靶向纳米药物(nnps)的制备:其中hsa与ce6耦联方法与实施例1中相同。
(1)配制10%hsa溶液1ml;
(2)每次hsa与ce6耦联后,测定其紫外吸光度值得出hsa浓度。优选地,设定hsa-ce6与10%hsa溶液中hsa的质量比为3:7,hsa总质量为30mg。根据其各自浓度算出相应体积;
(3)高温消毒蒸干后的玻璃小瓶中放入磁子,依次加入上一步算得体积的两种溶液,然后加入pbs溶液(1x,ph7.4),使溶液总体积为4ml。将小瓶置于磁力搅拌器上搅拌;
(4)称取2mgicg超声震荡溶于20μldmso;
(5)称取2mgtpz超声震荡溶于20μldmso;
(6)将10μlicg溶液与40μltpz溶液在搅拌状态下逐滴缓慢加入第(3)步hsa溶液中;
(7)将20μl戊二醛加入2mlpbs溶液中(1x,ph7.4),充分震荡溶解后,取200μl缓慢加入上述溶液中,避光搅拌30h。
(8)使用分子量为100kd的超滤管离心纯化三次,最终溶于1mlpbs溶液中(1x,ph7.4)。测定其紫外吸收光度值,分别对其中hsa、ce6、tpz和icg进行定量。计算各自浓度。
实施例3:
icg-hsa-ce6-opn不包载tpz纳米药物(nps(tpz-))的制备:其中hsa与ce6耦联方法和hsa与opn活性短肽耦联方法与实施例1中相同。
(1)配制10%hsa溶液1ml;
(2)每次hsa与ce6耦联后,测定其紫外吸光度值得出hsa浓度。优选地,设定hsa-ce6,hsa-opnpeptide,10%hsa三种溶液中hsa的质量比为3:5:2,hsa总质量为30mg。根据其各自浓度算出相应体积;
(3)高温消毒蒸干后的玻璃小瓶中放入磁子,依次加入上一步算得体积的三种溶液,然后加入pbs溶液(1x,ph7.4),使溶液总体积为4ml。将小瓶置于磁力搅拌器上搅拌;
(4)称取2mgicg超声震荡溶于20μldmso,取10μl在搅拌状态下逐滴缓慢加入第(3)步hsa溶液中;
(5)将20μl戊二醛加入2mlpbs溶液中(1x,ph7.4),充分震荡溶解后,取200μl缓慢加入上述溶液中,避光搅拌30h。
(6)使用分子量为100kd的超滤管离心纯化三次,最终溶于1mlpbs溶液中(1x,ph7.4)。测定其紫外吸收光度值,分别对其中hsa、ce6和icg进行定量。计算各自浓度。
实验1:巨噬细胞和泡沫细胞对上述三项实施例制得纳米药物的摄取实验。
方法如下:
(1)巨噬细胞选用raw264.7细胞系,以1×105密度接种于数块共聚焦皿中。待细胞贴壁后,将其中一半共聚焦皿中raw264.7细胞系与低密度脂蛋白ox-ldl(80μg/ml)共孵育24h构建泡沫细胞模型。
(2)将各皿细胞分为六组进行对比,单纯培养基不含纳米药物+巨噬细胞组(medium)、非靶向纳米药物(nnps)+巨噬细胞组、主动靶向性纳米药物(fnps)+巨噬细胞组、非靶向纳米药物(nnps)+泡沫细胞组、主动靶向性纳米药物(fnps)+泡沫细胞组、opn活性短肽+主动靶向性纳米药物(fnps)+泡沫细胞组,纳米药物浓度均为30μg/ml,与细胞共孵育6小时。
(3)pbs溶液(1x,ph7.4)洗去纳米药物后,用4%多聚甲醛固定细胞10min。
(4)用dapi染色10min,pbs溶液(1x,ph7.4)清洗两遍后,置于共聚焦显微镜下观察不同分组的细胞摄取情况。
实验结果如图5所示,泡沫细胞对主动靶向性纳米药物(ox-ldl+fnps)的摄取明显高于其他组,说明opn活性短肽具有良好识别泡沫细胞的能力,进而验证本申请的靶向opn纳米药物可准确识别动脉易损斑块中的泡沫细胞。
实验2:cck-8实验检测不同组纳米药物对巨噬细胞的杀伤能力。
方法如下
(1)设置五个处理组,分别为单纯培养基组(control)、单纯激光照射组(laser),及在不同浓度下,无光照包载tpz纳米药物组(nps)、光照下不包载tpz纳米药物(nps(tpz-)+laser)和光照下包载tpz纳米药物组(nps+laser)。
(2)在96孔板每孔中加入100μlraw264.7细胞悬液,待细胞贴壁后将不同浓度包载和不包载tpz的纳米药物100μl加入各孔中,每组设置6个复孔,置于细胞培养箱中24小时。
(3)光照组每孔用808nm激光(1w/cm2)照射5min.
(4)用pbs溶液(1x,ph7.4)清洗后,加入新鲜培养基。
(5)每孔迅速加入10ulcck-8溶液,2小时后用酶标仪测定各孔溶液在450nm处吸光度,得到细胞存活率。
结果如图6所示,单纯纳米药物组随浓度上升细胞存活率均在80%以上,说明本申请所述纳米药物细胞毒性小,安全性高。单纯光照对细胞杀伤小,但在光照下纳米药物组的细胞杀伤能力显著提高,且包载tpz纳米药物对巨噬细胞的杀伤效果更强。证明本申请所述纳米药物在光动力治疗下对动脉易损斑块中靶向的泡沫细胞有很强的杀伤能力,同时包载的tpz能显著增强此杀伤效果,从而提高斑块的稳定性。
实验3:小鼠在体荧光和磁共振成像实验。
方法如下:
(1)5-7周龄雄性apoe-/-小鼠(n=30),通过单侧放置颈动脉缩窄环+高脂高胆固醇饮食喂养20周以上构建小鼠颈动脉易损斑块模型。雄性c57小鼠普通饲料喂养做为对照。
(2)随机将模型鼠分成两组,分别为主动靶向性纳米药物组(as+fnps)和非靶向性纳米药物组(as+nnps)。健康c57小鼠体内注入主动靶向性纳米药物(control+fnps)。通过尾静脉注射将各组纳米药物注入小鼠体内,分别记录注射前、注射后15min、1h、2h、4h、8h、12h及24h个时间点的小鼠荧光成像信号和mri成像信号。
如图7和图8所示,注入主动靶向性纳米药物的c57小鼠和注入非靶向性纳米药物的模型小鼠颈动脉部位没有观察到明显的荧光信号,磁共振成像中颈动脉斑块信号随时间变化并无显著增强。而在注入主动靶向性纳米药物的模型小鼠颈动脉部位可观测到明显的荧光信号且在30min时最强,而后随时间延长信号逐渐衰减。在磁共振成像中也可看到颈动脉斑块处信号在24h时显著增强。
实验4:磁共振成像下评估纳米药物对小鼠颈动脉易损斑块的治疗效果。
方法如下:
(1)小鼠颈动脉易损斑块模型的构建与实施例6中所述方法相同。
(2)治疗前,先对每只小鼠行磁共振成像,检测其颈动脉狭窄情况。
(3)设置三个处理组,分别为无光照包载tpz纳米药物组(nps)、光照下不包载tpz纳米药物(nps(tpz-)+laser)和光照下包载tpz纳米药物组(nps+laser)。
(4)将各组纳米药物(100μg/ml,150μl)通过尾静脉注入小鼠体内,光照组在2小时后将808nm激光照射于小鼠颈动脉区域(1w/cm2,5min)。
(5)隔日重复第(3)步操作,连续治疗两周后,再次对小鼠进行磁共振成像,检查颈动脉狭窄情况有无改善。
结果如图9所示,单纯纳米药物治疗组(nps)和不包载tpz纳米药物光动力治疗组(nps(tpz-)+laser)小鼠颈动脉狭窄情况无明显变化,而包载tpz纳米药物光动力治疗组(nps+laser)小鼠颈动脉狭窄情况有所改善。
在诊断层面,本发明基于分子影像技术平台,选择可识别动脉粥样硬化易损斑块内泡沫细胞的opn活性短肽为靶向分子,并采用生物相容性高的人血清白蛋白(hsa)作为载体,设计并构建了可用于早期预警易损斑块的荧光/磁共振双模态纳米药物。通过静脉注射方式进入机体内,结合荧光和磁共振成像,实现解剖与功能两个层面识别的互补,提高了诊断的敏感性和特异性。克服了临床上用于诊断易损斑块的影像学手段都为有创检查,且难以在早期无创动态监测易损斑块的发生和发展过程的缺陷。
在治疗层面,本发明所述纳米药物通过包载光敏剂icg和乏氧增敏剂tpz对易损斑块进行光动力治疗,经细胞和动物实验都证实主动靶向性的纳米药物能够大量被泡沫细胞摄取,并在808nm激光照射下大量杀伤泡沫细胞,提高斑块稳定性,减小斑块面积,缓解动脉狭窄情况。与临床上现有的治疗手段相比,经济安全,具有可以针对易损斑块进行特异性的有效治疗,并且创伤小,对斑块周围正常组织和细胞没有损伤的优势。为光动力治疗用于动脉粥样硬化易损斑块的临床应用和推广提供了可靠地实验数据支撑。