黄蜀葵花提取物在制备防治抗生素滥用引发的肠道菌群失调药物中的应用的制作方法

本发明涉及黄蜀葵花及其提取物在制药领域的用途，特别是黄蜀葵花提取物在制备治疗和/或预防抗生素滥用引发的肠道菌群失调药物中的应用。
背景技术：
：肠道菌群在人体健康中发挥着重要作用。近年来，有关肠道菌群的研究日益成为科学家们感兴趣的焦点。肠道菌群是人体肠道的正常微生物，种类繁多，数量超过人体自身细胞的10倍以上。据估算，一个正常成人体内，肠道菌群总重量可达1-1.5kg。肠道菌群可以影响体重和消化能力，抵御感染和自身免疫病的患病风险，除此之外，还与一些内分泌代谢性疾病、肾脏疾病、神经性疾病、心血管疾病、呼吸系统疾病以及癌症的发生密切相关。肠道菌群按一定的比例组合，各菌间互相制约，互相依存，在质和量上形成一种生态平衡，一旦机体内外环境发生变化，如长期应用广谱抗生素，敏感肠菌被抑制，未被抑制的细菌而乘机繁殖，从而引起菌群失调，其正常生理组合被破坏，而产生病理性组合，引起临床症状就称为肠道菌群失调症。抗生素为人类征服感染发挥了巨大的作用，然而，近年来随着抗生素在临床的广泛使用，其弊端也日益显露出来。抗生素滥用导致人体肠道微生态的失调、肠道菌群的构成和功能发生改变。一方面干扰甚至破坏生态屏障，使病原菌得以在肠道定植和繁殖；另一方面使对抗生素敏感的厌氧菌减少甚至消失，而耐药菌却大量增殖成为优势菌，继而导致严重腹泻，甚至造成二重感染。微生态制剂可以增加肠道内有益菌的数量和活力，抑制致病菌的生长，帮助恢复正常的菌群平衡，是肠道菌群失调症的主要防治手段。目前，国内外研究开发的具有调节肠道菌群功能的微生态制剂主要有两种：一是益生菌制剂，主要是以双歧杆菌和各种乳酸菌为主，二是有益菌增殖促进剂，即通过这类物质使机体自身的生理性固有的菌增殖，形成以有益菌占优势的肠道生态环境。然而，微生态制剂用于预防和治疗肠道菌群失调症有一定的不足和局限性，如：微生态制剂的预防效果好于治疗，作用发挥较慢，故应长时间连续饲喂，才能达到预期效果；对储存条件要求较高，保质期相对较短，要保证细菌的活力，微生态制剂一般要求在低温、干燥处短期保存等。口服是中药的经典给药方式，进入消化道的药物不可避免与肠道微生物接触，对肠道菌群结构产生调节作用或其他影响。研究发现有些补益类中药会促进肠道内某些益生菌的生长、繁殖，而某些清热解毒类中药会抑制一些有害菌的生长、繁殖等。同时肠道微生物可通过还原反应、水解反应等方式对中药进行代谢转化，再被人体吸收从而达到治疗效果，因此肠道菌群与中药的药效关系存在着密切的联系。黄蜀葵花为锦葵科植物黄蜀葵abelmoschusmanihot(l.)medic的干燥花，是我国传统的药物。具有清热利湿、消炎解毒之功效，主淋证、吐血、衄血、崩漏、胎衣不下、痈肿疮毒、水火烫伤等。中国专利93110506.4公开了一种利用黄蜀葵花粗提物作为药物活性成分的治疗原发性肾小球疾病及乳糜尿的药物；中国专利200410035741.x提供了一种黄蜀葵花总提取物的提取制备方法；中国专利200610097615.6公开了一种黄蜀葵花总提取物用于制备治疗肾炎药物；中国专利200810017174.3公开了一种黄蜀葵花总提取物用于制备治疗尿路感染包括膀胱炎和尿道炎的新用途；中国专利201310645683.1公开了黄蜀葵花及其提取物在制备防治炎性肠病药物中的应用。目前尚未有黄蜀葵花用于预防和/或治疗肠道菌群失调相关疾病的报道。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，开发出黄蜀葵花提取物在制备防治抗生素滥用引发的肠道菌群失调药物中的新用途。为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：黄蜀葵花提取物在制备防治抗生素滥用引发的肠道菌群失调药物中的应用。其中，所述黄蜀葵花提取物通过如下方法制备得到：将黄蜀葵花干燥后，采用乙醇加热回流提取，滤去沉淀，减压回收乙醇，并浓缩药液。优选地，每次采用黄蜀葵花10份，加入15重量倍份的乙醇进行提取，加热回流的温度为85℃，每次提取时间为1小时，共提取3次。浓缩至每1ml药液相当于3g黄蜀葵花饮片量。进一步地，可以将所述黄蜀葵花提取物和药学上可接受的载体制备成颗粒剂、片剂、胶囊剂或者口服液制剂。在制备成片剂时，将黄蜀葵花提取物添加载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然而压片制成片剂。制备成颗粒剂时，将黄蜀葵花提取物添加载体乳糖或玉米淀粉，制粒，整粒，干燥，制成颗粒剂。制备成胶囊剂时，将黄蜀葵花提取物添加载体乳糖或玉米淀粉，制粒，整粒，干燥，然后装胶囊制成胶囊剂。在制备成口服液制剂时，取黄蜀葵花提取物，加入单糖浆，并加纯水至每毫升相当于饮片1g，分装，灭菌，即得口服液制剂。有益效果：本发明和现有技术相比具有以下优点：(1)实验结果表明，本发明提供的黄蜀葵花提取物能够有效维护主体肠道菌群的平衡，有助于肠道内优势菌群结构恢复和菌群多样化。(2)黄蜀葵花提取物能够有效改善肠道菌群的代谢情况，促进具有保护肠粘膜完整性功能的短链脂肪酸的产生。(3)黄蜀葵花提取物能够调节肠道th17/treg等免疫细胞比例的平衡。(4)本发明提供的具有防治肠道菌群失调相关疾病的复方组合物，可以方便和药物载体制备成多种剂型，临床上服用方便，并且使用安全，长期服用无毒副作用。附图说明图1a是黄蜀葵花提取物对小鼠肠道菌群失调的影响情况(门水平)。图1b是黄蜀葵花提取物对小鼠肠道菌群失调的影响情况(属水平)。图2是黄蜀葵花提取物对小鼠肠道菌群代谢产物丁酸产生的影响。图3a是黄蜀葵花提取物对小鼠肠系膜淋巴结th17细胞比例的影响。图3b是黄蜀葵花提取物对小鼠肠系膜淋巴结treg细胞比例的影响。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1黄蜀葵花提取物的制备方法，包括以下步骤：取黄蜀葵花10份，加入15重量倍份的乙醇，加热回流提取3次，每次1小时。合并提取液，减压回收乙醇，并继续浓缩每1ml药液相当于3g黄蜀葵花饮片量，室温放置24小时，去除沉淀，得黄蜀葵花提取物。实施例2黄蜀葵花提取物对抗生素处理诱发小鼠肠道菌群紊乱的改善作用研究。1、实验材料1.1实验用药物及试剂：黄蜀葵花原药材及其实施例1制备得到的黄蜀葵花提取物；盐酸林可霉素(批号0110192，100mg/ml)，头孢唑啉钠(批号0110112，100mg/ml)，氨苄西林钠(批号0107102，100mg/ml)，江西国药有限公司；无水乙醇(产品编号e111963，cas:64-17-5)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。1.2实验用动物及饲养：balb/c小鼠，4-6周龄，由南京大学模式动物所提供；全价营养颗粒饲料：由江苏省协同医药生物技术有限公司提供；饲养条件：室温20±2℃，湿度55-65％，明暗交替，光度适度，通风洁净良好。2、实验方法2.1抗生素处理诱发小鼠肠道菌群失调的造模方法。小鼠分为三组，每组8只，分别为正常组，抗生素处理模型组，以及黄蜀葵花提取物治疗组。先采集正常小鼠粪便,检测其肠道菌的数量和组成，随即抗生素处理模型组小鼠和黄蜀葵花提取物治疗组小鼠灌胃给予抗生素溶液(用ph7.4的生理盐水配制的盐酸林可霉素，头孢唑啉钠及氨苄西林钠的混合液，三种抗生素的浓度均为100mg/ml)，0.2ml/只，每天2次，连续3天。经检测小鼠肠道出现菌群失调，抗生素处理模型组小鼠给予生理盐水灌胃，另其自然恢复，黄蜀葵花提取物治疗组小鼠灌服黄蜀葵花提取物，0.2ml/只，每天2次，连续5天。于最后1次给受试物24小时后，无菌采取小鼠粪便。2.2黄蜀葵花提取物对抗生素处理诱导小鼠肠道菌群失调的治疗作用。根据qiagen粪便dna提取试剂盒操作程序分离纯化肠道菌dna，采用pcr技术检测r16sdna拷贝数。16spcr引物由测序接头引物、index和v3区引物组成。将纯化后的16srrna-v3区的pcr产物进行测序，测序平台为illuminamiseq。将测序数据上传至服务器端进行数据分析，预处理去除低质量序列，按照rrna发现、聚类和鉴定步骤进行分析。计算每个样本的操作分类单元数量，绘制稀疏曲线(特定的分类单元代表某特定物种)；计算单个样本的shannon指数(指数越大表示该样本中的物种越丰富)。在门、属等不同分类水平上统计样本的物种丰度，并行聚类分析。综合应用运算分类单位聚类分析、多样性分析和分类学分析等生物信息技术解析肠道菌群的结构、多样性和丰度，评价不同组别肠道菌群结构差异。2.3黄蜀葵花提取物对抗生素处理诱导小鼠肠道菌群代谢紊乱的影响。采用上述造模和给药的方法，收集小鼠的粪便。配制不同浓度的标准品溶液(多种短链脂肪酸混标)。称取100mg粪便于ep管中，加入1mlnaoh溶液(0.005m)，匀浆，13000rpm离心10min，取上清600μl置于无菌的ep管中，并加入10μld3-己酸内标溶液(500μg/ml)，涡旋混匀。取混合液置于玻璃离心管中，加入300μl超纯水，涡旋混匀后依次加入500μl1-丙醇/吡啶混合液(3:2v/v)、100μl氯甲酸丙酯，涡旋、超声后加入300μl正己烷溶液，涡旋、离心取上清进样，gc-ms检测并分析。2.4黄蜀葵花提取物对小鼠肠系膜淋巴结免疫细胞比例的影响。取出小鼠的肠系膜淋巴结，剪碎，过筛网，将其分离成单细胞悬液，裂解红细胞，重悬在流式细胞检测缓冲液中。加入不同浓度和荧光标签的流式抗体，对免疫细胞进行染色，并分析各组免疫细胞的变化情况：巨噬细胞(cd11b+f4/80+)、中性粒细胞(ly6c-ly6g+cd11b+)、th17细胞(cd4+il-17+)、treg细胞(cd4+cd25+foxp3+)。3、实验结果3.1黄蜀葵花提取物对抗生素处理诱导小鼠肠道菌群失调的影响情况。16srrna高通量测序结果表明，抗生素处理导致小鼠肠道菌群紊乱，黄蜀葵花提取物治疗可显著逆转该现象。我们进一步分析了黄蜀葵花提取物对肠道菌群多样性、丰富度以及群落结构组份的影响，发现黄蜀葵花提取物能够显著增加肠道菌群的多样性(out)和丰富度。门水平上(图1a)，抗生素处理导致小鼠粪便中firmicute菌门相对丰度降低，黄蜀葵花提取物治疗组小鼠粪便中firmicutes菌门相对丰度升高；verrucomicrobia、deferribacteres、proteobacteria菌门的相对丰度抗生素处理前后无显著性差异。属水平上(图1b)，抗生素处理导致小鼠粪便中alistipes、lachnospiraceae菌属相对丰度降低，黄蜀葵花提取物治疗后三者的相对丰度均回复至正常水平。抗生素处理组小鼠粪便中bacteroides相对丰度升高，黄蜀葵花提取物治疗后降低至正常水平。3.2黄蜀葵花提取物对抗生素处理诱导小鼠肠道菌群代谢紊乱的影响情况。gc-ms检测图2结果表明，抗生素处理组小鼠粪便中短链脂肪酸特别是丁酸的含量显著降低，短链脂肪酸具有肠粘膜保护作用，黄蜀葵花提取物治疗组小鼠粪便中丁酸的含量显著增高至接近正常组含量。3.3黄蜀葵花提取物对小鼠肠系膜淋巴结免疫细胞的影响情况。抗生素处理的模型组小鼠肠系膜淋巴结中巨噬细胞、中性粒细胞比例显著升高；黄蜀葵花提取物治疗组小鼠肠系膜淋巴结中巨噬细胞、中性粒细胞比例显著下调(表1)。抗生素处理组小鼠肠系膜淋巴结中th17细胞比例升高，treg细胞比例减少；黄蜀葵花提取物治疗组小鼠肠系膜淋巴结中th17细胞比例显著降低(图3a)，treg细胞比例明显升高至接近正常水平(图3b)。treg细胞是起到抗炎作用的免疫细胞，因此该实验结果表明黄蜀葵花提取物可以调控th17和treg的平衡，增强机体免疫细胞抗炎的能力。表1黄蜀葵花提取物对小鼠肠系膜淋巴结免疫细胞比例的影响组别巨噬细胞中性粒细胞th17treg正常对照组0.22％0.31％0.12％5.13％抗生素处理模型组1.96％1.41％3.40％2.40％黄蜀葵花提取物治疗组0.45％0.27％1.41％4.22％本发明提供了黄蜀葵花提取物在制备防治抗生素滥用引发的肠道菌群失调药物中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。当前第1页12