黄连解毒鼻用温敏型凝胶及其制备方法与流程

本发明涉及中药
技术领域：
，尤其涉及一种黄连解毒鼻用温敏型凝胶及其制备方法。
背景技术：
：根据中医理论，黄连、黄芩、黄柏三药，简称“三黄”，是中医临床常用的清热解毒燥湿药，三者均性味苦寒，有清热燥湿，泻火解毒之功，对湿热蕴结所致的黄疸、痢疾或热毒炽盛引起的发热，便秘，口舌生疮等，三者常相互配伍应用，以提高清热解毒之力。黄芩善清上焦之火，黄连善清中焦之火，黄柏善清下焦之火。栀子，又名山栀，轻清上行，能泻肺火，去肌表热，在外感热病、表里有热之际，能起双解的作用；苦寒泄降，又能泄三焦火，凉血清心热，可用于热病心烦；血热妄行及热淋尿血等症。原位凝胶或称在体凝胶、环境敏感凝胶，是随着药用高分子材料学的发展而产生的新颖剂型，是指以溶液状态给药后立即在用药部位发生胶凝，从而形成非化学交联的半固体制剂。原位凝胶具有凝胶制剂高度亲水性的三维网络结构及良好的组织相容性，同时，独特的溶液——凝胶转变性质使其兼有制备简单、使用方便、与用药部位尤其是豁膜组织亲和力强、滞留时间长等优点。近年来，原位凝胶给药系统己经引起了各国学者的广泛关注，成为药剂学领域的研究热点之一。温敏型原位凝胶，贮藏条件和用药部位的温度差异可以使某些高分子溶液发生溶液凝胶的转变，形成凝胶。这些聚合物在结构上均包含一定比例的疏水和亲水嵌段，其热敏型的胶凝行为与不同性质的嵌段间、以及嵌段与溶剂间的相互作用有关。利用对热敏感的聚合物，可以研制成黏膜给药的制剂，如口腔，鼻腔，阴道，直肠等部位的给药。现有制备鼻用解毒温敏型凝胶主要姜黄素鼻用凝胶(如cn102406594)、黄芩提取物鼻用温敏型凝胶(如cn102349944)。姜黄素提取步骤繁琐，且在体外易氧化。黄芩提取物步骤繁琐，所得到的黄芩苷含量不高，存在的杂质易影响到疗效，且适用范围不宽。黄连、黄柏、黄芩、栀子目前尚未有报道用于鼻用温敏型凝胶。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明提供一种黄连解毒鼻用温敏型凝胶及其制备方法，以解决现有在体外不稳定、应用范围不宽、疗效不高等技术问题。为实现上述目的，一方面，本发明提供一种黄连解毒鼻用温敏型凝胶的制备方法，具体步骤如下：1)以重量份数计，取黄连20～50份、黄柏20～40份、5～10倍黄连和黄柏总体积的70％乙醇回流提取两次，合并两次滤液，制成浓缩液a；2)以重量份数计，取黄芩20～50份、栀子30～60份、5～10倍黄芩和栀子总体积的水煎煮三次，合并三次滤液，制成浓缩液b；3)取浓缩液a和浓缩液b各20份，加入泊洛沙姆40718～24份、泊洛沙姆1881～4份、聚乙二醇60001～4份，加去离子水使总重量至100份，分散均匀，4～10℃保存，得到澄清的黄连解毒温敏凝胶。优选地，步骤1)中，所述黄连的用量为45份，所述黄柏的用量为30份。优选地，步骤1)中，所述乙醇加入量为黄连和黄柏总体积的6倍。优选地，步骤1)中，所述回流提取时间为每次为1～3h；优选地，所述乙醇每次提取时间为1～2h；进一步优选地，乙醇每次提取时间为1.5h。优选地，步骤2)中，所述黄芩的用量为30份，所述栀子的用量为45份。优选地，步骤2)中，所述水加入量为黄芩和栀子总体积的8倍。优选地，步骤2)中，所述回流提取时间为每次为0.5～2h；优选地，所述乙醇每次提取时间为0.5h。优选地，步骤3)中，所述泊洛沙姆407的用量为20.4份，所述泊洛沙姆188的用量为2.1份，所述聚乙二醇6000的用量为2份。进一步地，本发明提供一种黄连解毒鼻用温敏型凝胶的制备方法，具体步骤如下：1)取黄连45g、黄柏30g，加6倍70％乙醇回流提取两次，每次1.5h，合并两次滤液，浓缩至100ml，为浓缩液a；2)取黄芩30g、栀子45g，加8倍水煎煮三次，每次0.5h，合并三次滤液，浓缩至100ml，为浓缩液b；3)精密量取浓缩液a和浓缩液b各20ml，加入p40720.4g，p1882.1g，peg60002g，加去离子水至100g，使其分散均匀，放置于4～10℃的冰箱中保存，至辅料完全溶解得到澄清的凝胶溶液，即得黄连解毒鼻用温敏凝胶。另一方面，本发明提供一种黄连解毒鼻用温敏型凝胶，其通过本发明的制备方法制备得到。本发明所制备的黄连解毒鼻用温敏型凝胶在制备药物中的用途。所述药物可用于由病毒和细菌引起的热性疾病。相比现有技术，本发明具有如下有益技术效果：1)本发明采用冷冻技术制备黄连解毒鼻用温敏型凝胶，其剂型使用方便，无需辅助医疗设备，即可将药物组分输送到病灶，疗效显著；2)本发明选择合适的载体，有利于制备的温敏型凝胶稳定，凝胶温度符合鼻腔内的温度要求，提高药物的生物利用度，利于药剂的疗效发生；本发明的制备步骤简单，无需繁复的提取步骤，工艺稳定，提取物杂质少，适于大生产；3)本发明药物药效明确，可控性强，常温安全稳定，刺激性小，抗菌消炎适用范围宽；4)本发明药物原料来源广泛，成本低廉，无需特殊处理。附图说明图1p407的用量(w/w)对胶凝温度t的影响。图2p188的用量(w/w)对胶凝温度t的影响。图3peg6000的用量(w/w)对胶凝温度t的影响。图4各因素交互作用响应曲面图。图5给药后蟾蜍纤毛形态光学显微镜观察结果(×400)；a生理盐水；b1％脱氧胆酸钠；c呋麻滴鼻液；d空白温敏凝胶；e黄连解毒鼻用温敏型凝胶。具体实施方式以下结合具体实施方式，对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为，本发所述主题范围仅限于以下实施例，所用化学品均可商购而得。材料与方法药材与试剂黄连、黄柏、黄芩、栀子，购自漳州市聚善堂药业有限公司；泊洛沙姆407(p407)，德国bsaf公司，批号wpak588b；泊洛沙姆188(p188)，德国bsaf公司，批号wpak527b；聚乙二醇6000，德国clariant公司，批号dea4006133；呋麻滴鼻液，无锡济民可信山禾药业股份有限公司，批号180406；脱氧胆酸钠，成都艾科达化学试剂有限公司，批号201710131；生理盐水，辰欣药业股份有限公司，批号1706222821。仪器数码显微镜，麦克奥迪实业集团有限公司，型号：ba310。动物中华大蟾蜍，普通级，体质量35±5g，雌雄各半，购自枣阳伟华蟾业有限公司。黄连解毒鼻用温敏凝胶的制备黄连、黄柏、加70％乙醇回流提取两次，合并两次滤液，浓缩至100ml，为浓缩液a；黄芩、栀子、加水煎煮三次，合并三次滤液，浓缩至100ml，为浓缩液b；取适量浓缩液a和浓缩液b混合，加入处方量的辅料p407、p188和peg6000，使其分散均匀，放置于4～10℃的冰箱中保存，至p407完全溶解得到澄清的凝胶溶液，即得黄连解毒温敏凝胶。黄连鼻用解毒温敏凝胶胶凝温度的测定采用搅拌子法测定胶凝温度。在小烧杯中装入温敏凝胶溶液20g和搅拌子，插入准确度为0.1℃的精密温度计，温度计的水银球完全浸没在凝胶液中，将其放入温度为10℃的水浴中，保持恒定转速，水浴持续缓慢升温，使凝胶的温度上升速率为1～2℃·min～1，将磁力搅拌子完全停止转动时的温度定义为胶凝温度(t)，每个样品平行测定3次，结果取其平均值。实施例1：1)黄连45g，黄柏30g，加6倍70％乙醇回流提取两次，每次1.5h，合并两次滤液，浓缩至100ml，为浓缩液a；2)黄芩30g，栀子45g，加8倍水煎煮三次，每次0.5h，合并三次滤液，浓缩至100ml，为浓缩液b；3)精密量取浓缩液a、b各20ml，加入p407、p1882g、peg60002g，加去离子水至100g，使其分散均匀，放置于4～10℃的冰箱中保存，至辅料完全溶解得到澄清的凝胶溶液，即得黄连解毒鼻用温敏凝胶。其中p407的用量分别为18g、20g、22g、或24g，考察其对胶凝温度的影响。实验结果表明，p188、peg6000用量不变时，胶凝温度与p407呈浓度依赖型，随着p407浓度的增加，t下降。当p407浓度为20％时，胶凝温度接近鼻腔温度。见图1。实施例2：过程与实施例1相同，不同之处在于：精密量取浓缩液a、b各20ml，加入p40720g、p188、peg60002g，加去离子水至100g，使其分散均匀，放置于4～10℃的冰箱中保存，至辅料完全溶解得到澄清的凝胶溶液，即得黄连解毒鼻用温敏凝胶。其中p188的用量分别为1g、2g、3g、或4g，考察其对胶凝温度的影响。p188的用量与胶凝温度呈正相关，随着p188的增加，t增加。p188浓度为2％时，胶凝温度接近鼻腔温度，见图2。实施例3：过程与实施例1相同，不同之处在于：精密量取浓缩液a、b各20ml，加入p40720g、p1882g、peg6000，加去离子水至100g，使其分散均匀，放置于4～10℃的冰箱中保存，至辅料完全溶解得到澄清的凝胶溶液，即得黄连解毒鼻用温敏凝胶。其中peg6000的用量分别为1g、2g、3g、或4g，考察其对胶凝温度的影响。peg6000的用量与胶凝温度(t)呈正相关，随着peg6000的增加，t增加。peg6000浓度为2％时，胶凝温度接近鼻腔温度，见图3。实施例4：box-behnken响应面法试验设计优化制备工艺在实施例1～3所述的单因素试验结果的基础上，以|t-33|为响应值y，分别考察p407(x1)、p188(x2)和peg6000(x3)的用量对胶凝温度的影响，建立三因素三水平box-behnken模型，优选制备工艺，试验因素与水平设计见表1，试验结果见表2。表1因素水平表表2box-behnken试验设计与结果1)模型拟合采用响应面分析软件designexpert8.0.6对试验数据进行多元拟合分析，得到综合评分的回归方程为：y＝640.93-64.3125x1+11.3425x2+3.6675x3-1.0875x1x2-0.6625x1x3+1.7x2x3+1.66375x12+1.78x22+1.58x32。表3回归模型方差分析表方差来源平方和自由度均方f值p值模型312.18934.69317.60<0.0001x151.01151.01467.02<0.0001x20.1010.100.930.3677x30.1510.151.380.2777x1x218.92118.92173.26<0.0001x1x37.0217.0264.30<0.0001x2x311.56111.56105.85<0.0001x12186.481186.481707.47<0.0001x2213.34113.34122.15<0.0001x3210.51110.5196.24<0.0001残差0.7670.11失拟项0.5930.204.590.0875净误差0.1740.04总误差312.9416回归方程中各变量对响应值影响的显著性用f检验来判定，概率p值小于0.05为显著，小于0.01为极显著。由表3可知，整体模型的p<0.0001，表明回归模型达到极高度水平，具有统计学意义。失拟项p值为0.0875，不显著(p>0.05)，说明非试验因素对试验结果的影响不大。该模型的决定系数r2(r-square)＝0.9976，调整后的决定系数r2(adj.r-square)＝0.9944，表明胶凝温度的预测值和实际值之间有较好的拟合度。说明应用响应面法优化的黄连解毒温敏凝胶制备工艺是可行的。由表3中p值可知，x1、x1x2、x1x3、x2x3、x12、x22、x32对y的影响达到极显著，表面试验因素对响应值不是简单的线性关系，二次项对响应值也有很大的关系。2)因素间交互作用及分析图4显示了p407、p188和peg6000任意两个变量之间交互作用的三维曲线图。由于胶凝温度越接近33℃越好，即响应值y|t-33|越小越好，因此图4均为开口向上的凹型曲面，说明响应值存在极低值。根据软件分析结果，得到最佳工艺为：p40720.41％(w/w)，p1882.10％(w/w)，peg60001.99％(w/w)。为方便操作，将最佳工艺调整为：p40720.4％(w/w)，p1882.1％(w/w)，peg60002％(w/w)。实施例51)黄连45g，黄柏30g，加6倍70％乙醇回流提取两次，每次1.5h，合并两次滤液，浓缩至100ml，为浓缩液a；2)黄芩30g，栀子45g，加8倍水煎煮三次，每次0.5h，合并三次滤液，浓缩至100ml，为浓缩液b；3)精密量取浓缩液a、b各20ml，加入p40720.4g，p1882.1g，peg60002g，加去离子水至100g，使其分散均匀，放置于4～10℃的冰箱中保存，至辅料完全溶解得到澄清的凝胶溶液，即得黄连解毒鼻用温敏凝胶。测定胶凝温度进行3批验证性试验，胶凝温度分别为32.8℃、33.1℃、33.3℃，|t～33|平均值为0.20℃，与预测值0.19℃接近，说明本发明提供的工艺稳定可行。实施例6：黄连解毒温敏凝胶治疗变应性鼻炎的药效学研究1方法1.1变应性鼻炎豚鼠的分组及模型的建立将32只豚鼠随机分为4组，分别设为空白对照组(a组)、模型对照组(b组)、黄连解毒鼻用温敏凝胶组(c组)、阳性对照组(布地奈德鼻喷雾剂，d组)1.2基础致敏造模组每只豚鼠以卵清蛋白(ova)0.5mg作抗原，氢氧化铝粉末30mg作佐剂，加生理盐水1ml形成混悬液，腹腔注射，隔日一次，共7次。空白对照组以同等量生理盐水替代ova，方法不变。1.3激发腹腔注射致敏后的第4天，豚鼠取头低位，用微量加样器每侧鼻腔滴以配制成2％浓度的ova溶液50μl激发，隔日1次，共5次。激发时间为当日第1次滴鼻给药1h后。a组豚鼠以同等量生理盐水替代ova，方法和步骤相同。1.4给药方法于第7次致敏注射后的第2天开始给药，豚鼠取头低位，用微量加样器将药液50ul滴入豚鼠鼻孔/每侧，双侧均滴，a和b组滴生理盐水，c组滴黄连解毒鼻用温敏凝胶，每日3次，连续14d；d组滴布地奈德鼻喷雾剂，每日1次，连续14d。2观察指标及检测项目2.1ar病模行为学指标评分参照1997年(海口)修订的全国变应性鼻炎诊断及疗效评定标准，每次卵清蛋白双侧鼻腔滴鼻激发后，观察记录30min内豚鼠喷嚏、搔鼻次数、流涕量，采用叠加法计算总分，总分≥5分表示造模成功。①喷嚏：一次连续3-9个≥1分，10-14≥2分，≥15个为3分。②鼻痒：搔鼻2-3次为1分，3-5次≥2分，5次以上为3分。③流涕：流至鼻孔为1分，超过前鼻孔为2分，流涕满面为3分。2.2血液检测指标在第11天治疗结束后，禁食过夜，次日断头采集血液标本，按试剂盒说明书的要求进行测定。2.2.1血清lte4测定取血清标本，用elisa法于波长450nm的酶标仪上检测。根据lte4试剂盒内附的标准品血清测定的od值结果，得出标准曲线，再通过测定各豚鼠血清lte4的od值，算出各豚鼠的血清lte4抗体浓度。2.2.2血清ige测定方法同上，用elisa法于波长450nm的酶标仪上检测。血清ige抗体浓度计算方法同上。3统计学方法结果以表示，以spss16.0统计软件包分析。4结果4.1各组豚鼠行为学评分表4各组豚鼠给药后行为学评分注：与模型组比较：**p<0.01，*p<0.05造模动物在第1次给ova溶液滴鼻激发后，就出现轻微的喷嚏、搔鼻和流涕的症状，随着激发次数的增加，症状逐渐加剧，第4次激发时，出现了典型的变应性鼻炎症状。空白对照组未出现喷嚏、搔鼻和流涕等症状给药第7天开始，黄连解毒鼻用温敏凝胶组和布地奈德鼻喷雾剂组的鼻炎症状逐渐减轻；至给药第14天，其鼻炎症状明显缓解。黄连解毒鼻用温敏凝胶组和布地奈德鼻喷雾剂组与模型组比较均有显著性差异。黄连解毒鼻用温敏凝胶组与布地奈德鼻喷雾剂组之间无显著性差异。结果见表4。4.2各组豚鼠血清lte4、ige指标的变化表5豚鼠血清中lte4、ige的含量注：与模型组比较：**p<0.01，*p<0.05由表5可知，与空白对照组相比，各组血清中lte4、ige的含量显著性增高，说明造模成功；与模型对照组比较，治疗组干预治疗后lte4、ige的含量低于模型组。结果表明，黄连解毒鼻用温敏凝胶能在一定程度上缓解喷嚏、鼻痒、流涕等症状，能抑制炎症介质的释放。实施例7：体外抗菌对比试验取大肠杆菌atcc25923、金黄色葡萄球菌atcc25922、溶血性链球菌分别接种于普通琼脂平板、血平板，37℃培养18～24h，挑取单个菌落接种血清肉汤中，37℃孵育箱孵育溶血性链球菌18h，其余菌种孵育6h，培养6h，取0.1ml加2ml血清肉汤作为试验用原菌液，约为106个/ml。将本发明实施例5中制得的黄连解毒鼻用温敏型凝胶分别加水稀释成0.25g/ml，隔水高压灭菌。采用两倍稀释法将试验样品用血清肉汤做空白对比稀释。取试验用菌液向放置好的各试验管内分别滴加0.1ml，混合后取出一菌环，点种血平板，37℃培养4h，观察细菌生长情况，以判断各试验样品体外抑菌强度，结果见表6。表6各实验样品对常见细菌的体外抑菌作用空白对比液实施例5大肠杆菌+-金黄色葡萄球菌+-溶血性链球菌+-“+”表示有细菌生长，“-”表示完全抑菌实施例8：粘膜纤毛毒性作用评价采用在体蟾蜍上颚模型法。选择体重30～40g的蟾蜍30只，随机分为5组，每组6只。首先用探针破坏蟾蜍的脑和脊髓，大头针使其仰卧固定在手术板上，口腔张开，裸露出上颚。其次滴加药液0.5ml至上颚黏膜，使药液完全浸没上颚，充分接触30min。用生理盐水将药液充分冲洗净后，用眼科剪刀和镊子小心地分离上颚黏膜约3mm×3mm。分离后立即用生理盐水洗净血块及粘连组织等，黏膜纤毛面向上平铺于载玻片上，表面滴加1～2滴生理盐水，盖上盖玻片。最后将玻片于40×10倍生物显微镜下观察纤毛摆动情况。观察结束后将玻片置于加有蒸馏水的层析缸中，密闭(环境温度20～25℃，水蒸气近饱和状态)。每隔适当时间将玻片取出，观察纤毛摆动情况，直至纤毛摆动停止，记录从给药开始至纤毛停止摆动所持续时间。据文献报道，盐酸麻黄碱是公认无纤毛毒性的，本文选择市售呋麻滴鼻液(含1％盐酸麻黄碱)作为阴性对照品，以有严重纤毛毒性的脱氧胆酸钠作为阳性对照品，以生理盐水作为空白对照，分别评价黄连解毒温敏凝胶、空白温敏凝胶的鼻腔纤毛毒性。实验设计见表7。表7药物对蟾蜍上颚黏膜毒性实验分组纤毛毒性评价方法纤毛持续运动时间的百分率(ppv)＝给药组的纤毛持续运动时间/生理盐水对照组的纤毛持续运动时间。ppv越高，表示药物对纤毛运动影响越小，也就是对纤毛毒性越小。结果见表8。结果1)蟾蜍上颚黏膜观察结果采用具有拍照功能的数码显微镜，观察给予各受试药液后的纤毛形态(×400)，见图5。显微镜下观察结果显示，生理盐水组和呋麻滴鼻液组纤毛清晰完整，排列整齐，有规律的向同一方向摆动，纤毛运动活跃，呈“风吹麦浪”式摆动，且摆动频率极快(见图a、c)；给予脱氧胆酸钠后纤毛停止摆动、纤毛边缘基本脱离，粘膜受损较严重，部分基部裸露(见图b)，表明脱氧胆酸钠对黏膜组织有严重的破坏作用，对纤毛运动有严重的不可逆的抑制作用；空白温敏凝胶和黄连解毒温敏凝胶组纤毛较清晰，纤毛运动较活跃(见图d、e)，说明黄连解毒汤和辅料对鼻纤毛的毒性没有或很小，几乎可忽略不计，可以用于鼻腔给药系统。2)对纤毛持续运动时间(pvd)和持续运动百分率(ppv)的影响表8黄连解毒温敏凝胶对蟾蜍纤毛运动时间的影响(n＝6，)结果显示，生理盐水对纤毛运动无明显影响，持续运动时间为565.2分钟，给予1％脱氧胆酸钠的持续运动时间与生理盐水组相比有显著差别，表明其对蟾蜍上颚纤毛有较强的毒性；给予空白温敏凝胶的纤毛运动时间相对生理盐水的百分率分别为93.1％，空白凝胶对纤毛运动有一定的影响，这也可能与p407、p188等辅料的黏度较大有关；给予黄连解毒温敏凝胶，其最初形态和随后的变化趋势与空白凝胶的变化相似，说明该温敏凝胶无明显的纤毛毒性，可以用于鼻腔给药。本发明通过选择p407、p188、peg6000三者在凝胶中所占有的含量，制备出具有高效生物利用度和稳定性的温敏凝胶，相比其他剂型(例如固体分散剂)，其生物利用度接近静脉注射，稳定性高于静脉注射。从本发明对p407、p188、peg6000三者的比例筛选可知，特定的比例才能达到黄连解毒鼻用温敏型凝胶的凝胶温度要求。相比现有技术的剂型(例如固体分散剂)，单纯的全身给药治疗效果不如局部治疗或合并局部治疗效果佳，这是因为有些局部血液循环不够丰富等原因决定的。基于此，本发明对于器官-鼻的疾病，直接制备局部用药的温敏型凝胶，直接使鼻的局部病变组织接触凝胶而被黏膜吸收，提高疗效。对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。当前第1页12