一种缓解三氧化二砷诱发的心脏毒性综合征的药物组合物及其用途的制作方法

本发明涉及一种药物组合物，特别是涉及一种缓解三氧化二砷诱发的心脏毒性综合征的药物组合物及其用途。本发明属于生物医药技术领域。

背景技术：

三氧化二砷(ato)，民间俗称“砒霜”，在华夏文明史上长期扮演着毒药的角色。其实，除去作为一种毒药，“砒霜”记载于古代医疗典籍中亦用于治疗疾病，外用可蚀疮和去腐，内服能杀虫、截疟以及祛痰平喘。20世纪70年代，首次发现三氧化二砷可用于治疗白血病，并且发现对急性早幼粒细胞白血病的疗效最好。此后，三氧化二砷便正式成为临床治疗白血病的特效药。

随着对ato不断深入地研究发现，三氧化二砷不仅对白血病有治疗效果，对全世界死亡率排名第三的肝癌也有极强的抑制作用，并且最近一项研究表明，ato辅助治疗优于单独采用一线治疗手段经动脉化疗栓塞(transarterialchemoembolization,tace)治疗，特别是在已发生肺部(癌细胞)转移的患者中，ato联合tace治疗使临床受益率更高。尽管三氧化二砷抗肿瘤作用较强，但治疗疾病时部分患者会出现大量的不良反应，其中心脏毒性是ato临床使用限制性的一大重要原因，尤其是其导致严重复杂性心律失常。

其中，长qt间期综合征是一种先天或后天性的心脏电生理障碍，其临床特征为在心电图上显示延长的qtc间期和异常的t波，通常和快速性心律失常有着密不可分的关系，具体表现为尖端扭转型室性心动过速(torsadesdepointes,tdp)并且是可自我终止性的，因此常导致晕厥和猝死的发生。不同的lqt治疗方法存在着一定的差异，这是由于各类lqt亚型的特征以及其对药物的敏感性不同造成的。临床一线治疗药β受体阻断剂，如普萘洛尔对lqt1患者治疗效果最好。

本发明通过研究发现，β受体阻滞剂普萘洛尔可有效缓解三氧化二砷对心肌离子通道的干扰作用而缓解三氧化二砷诱发的心脏毒性综合征，为心脏保护提供了一种基于心肌电生理的治疗策略，同时为临床上β受体阻滞剂或钙通道拮抗药等抗心律失常药和三氧化二砷的联合应用提供了新的理论依据。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种缓解三氧化二砷诱发的心脏毒性综合征的药物组合物及其用途。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明通过心电图测定、膜片钳检测、real-timepcr和westernblot等多种实验技术发现β受体阻滞剂普萘洛尔能够通过改善三氧化二砷对心肌离子通道的干扰作用而缓解三氧化二砷诱发的心脏毒性综合征。

因此，在上述研究的基础上，本发明提出了β受体阻滞剂在制备缓解三氧化二砷诱发的心脏毒性综合征药物中的用途。

其中，优选的，所述的β受体阻滞剂为普萘洛尔。

进一步的，本发明还提出了一种缓解三氧化二砷诱发的心脏毒性综合征的药物组合物，所述的药物组合物由β受体阻滞剂以及三氧化二砷组成。

其中，优选的，所述的β受体阻滞剂为普萘洛尔。

其中，优选的，三氧化二砷与普萘洛尔的质量比为0.3:1-4。

更进一步，本发明还提出了所述的药物组合物在制备缓解三氧化二砷诱发的心脏毒性综合征药物中的用途。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明提出了一种缓解三氧化二砷诱发的心脏毒性综合征的药物组合物及其用途，本发明通过细胞实验和动物实验证明，β受体阻滞剂普萘洛尔与三氧化二砷的联合用药方式能有效缓解三氧化二砷诱发的心脏毒性综合征，从而降低三氧化二砷产生的副作用和治疗费用，增加临床上使用三氧化二砷抗肿瘤的用药安全性。此外，本发明为心脏保护提供了一种基于心肌电生理的治疗策略，同时为临床上β受体阻滞剂或钙通道拮抗药中一种或多种抗心律失常药与三氧化二砷联合应用提供了新的理论依据。

附图说明

图1是β受体阻滞剂普萘洛尔改善三氧化二砷诱发小鼠qtc间期延长的作用。

图1a是对照组、三氧化二砷组、三氧化二砷和普萘洛尔共同给药组(5、10和20mg/kg)小鼠心电代表图；

图1b是对照组、三氧化二砷组、三氧化二砷和普萘洛尔共同给药组(5、10和20mg/kg)小鼠qtc间期统计图，n＝4，^**p<0.01和对照组比较，^#p<0.05和三氧化二砷组比较，^##p<0.01和三氧化二砷组比较，^###p<0.001和三氧化二砷组比较；

图2是普萘洛尔改善三氧化二砷对小鼠急性分离心室肌细胞apd90的作用；

图2a是对照组、三氧化二砷组、三氧化二砷和普萘洛尔共同给药组(5、10和20mg/kg)小鼠心室肌细胞apd90代表图；

图2b是对照组、三氧化二砷组、三氧化二砷和普萘洛尔共同给药组(5、10和20mg/kg)小鼠心室肌细胞apd90统计图，n＝6，^***p<0.001和对照组比较，^###p<0.001和三氧化二砷组比较；

图3是普萘洛尔改善三氧化二砷对小鼠乳鼠心肌细胞apd90的作用；

图3a是对照组、三氧化二砷组、三氧化二砷和普萘洛尔共同给药组(0.1、1和10μm)小鼠乳鼠心肌细胞apd90代表图；

图3b是对照组、三氧化二砷组、三氧化二砷和普萘洛尔共同给药组(0.1、1和10μm)小鼠乳鼠心肌细胞apd90统计图，n＝6，^*p<0.05和对照组比较，^##p<0.01和三氧化二砷组比较；

图4是普萘洛尔改善三氧化二砷对小鼠心肌组织kcnq1表达的抑制作用，分为对照组、三氧化二砷组、同时给予三氧化二砷和普萘洛尔(5、10和20mg/kg)组；

图4a是小鼠心肌组织kcnq1mrna相对表达水平，n＝3，gapdh为内参，^*p<0.05和对照组比较，^###p<0.001和三氧化二砷组比较；

图4b是kvlqt1蛋白相对表达水平，n＝3，^***p<0.001和对照组比较；^###p<0.001和三氧化二砷组比较；

图5是普萘洛尔改善三氧化二砷对小鼠乳鼠心肌细胞kcnq1表达的抑制作用，分为对照组、三氧化二砷组、同时给予三氧化二砷和普萘洛尔(0.1、1和10μm)组；

图5a小鼠乳鼠心肌细胞kcnq1mrna的表达水平，n＝3，^***p<0.001和对照组比较；^###p<0.001和三氧化二砷组比较；

图5b小鼠乳鼠心肌细胞kvlqt1蛋白相对表达水平；gapdh为内参，数据以x±sem表示；^***p<0.001和对照组比较；^###p<0.001和三氧化二砷组比较；n＝3。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

下列实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或生产厂家所建议的条件进行操作。

实验所用的药品为本发明所涉及的药物组合β受体阻滞剂或钙通道拮抗药等抗心律失常药中的一种或多种与三氧化二砷。

动物实验剂量选择：小鼠随机分为五组，即对照组，三氧化二砷(1.5mg/kg)，以及给予三氧化二砷(1.5mg/kg)的同时给予低剂量(5mg/kg)、中剂量(10mg/kg)和高剂量(20mg/kg)普萘洛尔(propranolol)。

依次对五组小鼠进行心电图测定、膜片钳检测、real-timepcr和westernblot实验。

细胞实验剂量选择：分为五组，即对照组，三氧化二砷(2.5μm)，以及给予三氧化二砷(2.5μm)的同时给予低剂量(0.1μm)、中剂量(1μm)和高剂量(10μm)普萘洛尔(propranolol)。

依次对五组进行膜片钳检测、real-timepcr和westernblot实验。

实施例1：心电图测定

小鼠应用三溴乙醇(阿佛丁)麻醉后，仰位固定于手术台上，将针形电极插入四肢皮下，bl-420s生物机能实验系统电极的正极连于左下肢，负极连于右上肢，记录标准二导联心电图。根据bazett公式，小鼠qtc＝qt/(rr/100)1/2。

心电图测定结果显示，与对照组相比，三氧化二砷明显延长心脏qtc间期；而联合应用普萘洛尔(5、10和20mg/kg)时，普萘洛尔呈浓度依赖性地改善三氧化二砷延长心脏qt间期的毒副作用，n＝4，^**p<0.01和对照组比较，^#p<0.05和三氧化二砷组比较，^##p<0.01和三氧化二砷组比较，^###p<0.001和三氧化二砷组比较(图1a，图1b)

实施例2：膜片钳检测

1、玻璃微电极拉制，应用全细胞膜片钳技术记录单个细胞的离子通道电流。

2、全细胞膜片钳记录

打开总稳压电源，打开不间断电源，按顺序打开电脑、微操控制器开关、数模转换器开关、放大器开关和显微镜开关，打开氮气和相应的软件程序，开始实验。

在bath模式下安装电极，电极入液后，显示电极阻值(2-4mω)。若电极入液后显示overload，则应将电极迅速出水，调节基线至overload消失。

切换至patch模式，给予负压吸引并维持负压。

切换至cell模式，采用电流钳模式记录apd。apd记录结束后需记录最大膜电容。数据存于相应文件夹，待后续数据分析。

实验结束依次关闭软件程序、放大器开关、数模转换器开关、微操开关、电脑、显微镜和氮气。

膜片钳检测结果显示，普萘洛尔能够抑制三氧化二砷对小鼠急性分离心室肌细胞apd延长作用，n＝6，^***p<0.001和对照组比较，^###p<0.001和三氧化二砷组比较(图2a，图2b)；普萘洛尔能够改善三氧化二砷对小鼠乳鼠心肌细胞apd90的作用，n＝6，^*p<0.05和对照组比较，^##p<0.01和三氧化二砷组比较(图3a，图3b)

实施例3：real-timepcr实验

1、rna提取

心肌细胞用pbs冲洗后，加入1mltrizol，冰上裂解10min。转移到1.5mlep管中，加入300μltrizol研磨，后补充700μltrizol冰上裂解10min。此后二者提取步骤相同。每管加入300μl氯仿，混匀，冰上放置10min。4℃12000rpm，离心15min。离心期间，标记对应数量的ep管，并加入400μl预冷的异丙醇。离心结束，取300-400μl上层水相于加有异丙醇的管内，混匀。冰上放置10min，4℃12000rpm，离心15min，离心结束，弃上清，沉淀即为rna。每管加入1ml75％乙醇，将沉淀重悬，洗涤，4℃12000rpm，离心10min。弃上清，留下底部rna沉淀。将ep管倒置于滤纸上晾干10min，根据沉淀加入10-30μl预热至65℃的depc水，混匀。使用nanodrop2000检测rna纯度及浓度。a260/a280数值在1.80-2.00之间的rna纯度符合要求。

2、逆转录

采用toyoborevertraaceqpcrrt试剂盒，以500ngrna为模板逆转录成cdna，根据toyoborevertraaceqpcrrtkit操作步骤进行实验。反应程序：37℃15min，98℃5min，4℃holding。cdna可于-20℃保存。

3、主要引物序列设计和检测

引物由invitrogen公司合成。应用所选引物对昆明小鼠乳鼠心肌细胞和昆明小鼠心肌组织进行real-timepcr检测，并绘制熔解曲线以验证扩增产物特异性。

4、real-timepcr

采用toyoborealtimepcrmastermix进行实验。体系包括：realtimepcrmastermix10μl，depc水6μl，cdna2μl，上下游引物各1μl。反应条件为95℃1min，95℃15s，60℃15s，72℃45s共40个循环。以管家基因gapdhmrna水平作为细胞内总rna含量的对照标准。每次real-timepcr检测结果都进行重复试验。用循环数(cyclethreshold,ct)值及2^-δδct的方法计算目的基因相对含量。相对mrna表达水平以2^-δδct表示，△△ct＝(ct目的-ct内参)实验组-(ct目的-ct内参)对照组。

real-timepcr实验结果显示普萘洛尔对小鼠心肌组织和小鼠乳鼠心肌细胞的kcnq1的rna表达有均有上调作用n＝3，^*p<0.05和对照组比较，^***p<0.001和对照组比较，^###p<0.001和三氧化二砷组比较(图4a，图5a)；

实施例4：westernblot检测

1、细胞蛋白提取

弃去细胞培养液，用预冷的pbs清洗3次，尽量吸干液体。12孔细胞培养板每孔加入80μl预冷的含1％蛋白酶抑制剂(pi)的细胞裂解液(ripa)。细胞用刮刀刮下，吸入ep管内。冰上裂解10min，20hz超声3次，每次5s，间隔3min。超声破裂细胞后，细胞悬液经12000rpm，4℃离心15min。上清即为提取蛋白，吸出上清-80℃保存。

2、组织蛋白提取

心肌组织剪成碎块，加入预冷的含1％蛋白酶抑制剂(pi)的细胞裂解液(ripa)，研磨成匀浆。冰上裂解10min，40hz超声3次，每次5s，间隔3min。超声破裂组织后，13500rpm，4℃离心15min。上清即为提取蛋白，-80℃保存。

3、电泳

处理蛋白样品。通过蛋白浓度计算出蛋白的质量，将80-100μg蛋白与6×上样缓冲液(loadingbuffer)混合均匀，总体积一致(一般不超过20μl)，不足者用含1％蛋白酶抑制剂的ripa补齐，样品100℃变性10min，迅速置于冰上冷却。

将干净的胶板固定在支架上。依据博士德凝胶试剂盒说明，进行4ml浓缩胶和10ml10％分离胶配制。10％分离胶，依次加入各试剂充分混匀，倒入胶板中，当分离胶的上沿距短玻璃上沿2cm时停止倒胶，用无水乙醇封闭。浓缩胶，依次加入各试剂充分混匀，待分离胶凝固后，在胶与水的交界处可见明显的折线。弃去胶板中的乙醇，倒入配好的浓缩胶并立即插入梳子，梳子齿下端距分离胶的上沿约1cm。待浓缩胶凝固后，安装电泳装置，倒入电泳缓冲液，拔出梳子，将处理好的各组分蛋白按照同样的体积依次进行上样。样品在浓缩胶时保持电压为70mv(约30min)，样品达到分离胶时电压改为110mv，电泳直至溴芬蓝前沿至胶的底端，停止电泳，取出玻璃胶板。

4、转膜

剪取与分离胶大小相当的滤纸，根据实验要求剪裁大小适中的nc膜。滤纸和nc膜在转移缓冲液中浸泡至湿透。按要求切割凝胶，按从下自上，从负极到正极将海绵、六层滤纸、凝胶、nc膜、六层滤纸和海绵按顺序装好。将冰盒装入缓冲液槽，注满4℃预冷的转膜缓冲液，将整个装置放在冰浴中，连接好转膜电极恒流300ma，转膜60min。

5、封闭

将nc膜用tbs-t清洗，将洗好的膜剪右下角作为记号后置于5％的脱脂奶粉(tbs-t配制)中室温封闭2h。

6、显色

tbs-t洗膜3次，每次5-10min。分别加入相应的一抗，室温孵育4h或4℃孵育过夜。tbs-t洗膜3次，每次5-10min。加入二抗室温孵育1h。辣根过氧化物酶hrp-ecl发光法显色。bio-rad凝胶成像系统对蛋白表达进行检测，并用quantityone软件对数据进行分析。

westernblot实验结果显示普萘洛尔能够改善ato对kcnq1的表达抑制作用，n＝3，^***p<0.001和对照组比较；普萘洛尔可以改善三氧化二砷对小鼠心肌及小鼠乳鼠心肌细胞kcnq1的抑制作用，n＝3，^***p<0.001和对照组比较；^###p<0.001和三氧化二砷组比较(图4b，图5b)。