烯丙基硫醚在制备铜绿假单胞菌群体感应系统淬灭剂中的应用的制作方法

本发明属于有害微生物防控技术领域，具体涉及烯丙基硫醚在制备铜绿假单胞菌群体感应系统淬灭剂中的应用。

背景技术：

群体感应系统广泛存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中，其中尤以铜绿假单胞菌的群体感应系统研究的最为透彻。铜绿假单胞菌已知的群体感应系统有三个，分别是las、rhl和pqs系统。其中，las系统由lasi和lasr组成，lasi是信号分子的合成酶，合成3-氧十二烷酰高丝氨酸内酯(3-oxododecanoyl-homoserinelactone，3oc12-hsl)，lasr是该信号分子的受体。与las系统相似，rhl系统由rhli和rhlr组成，rhli是信号分子的合成酶，合成丁基高丝氨酸内酯(butryl-homoserinelactone，c4-hsl)，rhlr是该信号分子的受体。在pqs系统中，phna、phnb、pqsa、pqsb、pqsc、pqsd和pqsh共同催化hhq和pqs信号分子的合成，pqsr是信号分子的受体。las、rhl和pqs三个群体感应系统，共同调控着胞外蛋白酶lasa、弹性蛋白酶lasb、绿脓菌素和生物膜等铜绿假单胞菌的毒力因子的产生。

大蒜是常见的食物，其用作民间医药的历史已有几千年。现代科学研究证明，大蒜精油中含硫化合物具有较强的抗菌消炎作用，对多种细菌、真菌和病毒均有抑制作用。烯丙基硫醚(diallylsulfide，das)是大蒜精油中一种含硫丰富的化合物。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种烯丙基硫醚在制备铜绿假单胞菌群体感应系统淬灭剂中的应用。

本发明通过实验表明，das不会抑制铜绿假单胞菌pao1菌株的生长，但能够显著抑制该菌群体感应系统中关键基因的转录，并抑制群体感应系统调控的毒力基因的转录。

因此，本发明的第一个目的是提供烯丙基硫醚在制备铜绿假单胞菌群体感应系统淬灭剂中的应用。

所述的铜绿假单胞菌优选为铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)pao1。

本发明的第二个目的是提供烯丙基硫醚在制备抑制铜绿假单胞菌群体感应系统调控的毒力因子产生的药物中的应用。

所述的毒力因子优选为胞外蛋白酶lasa、弹性蛋白酶lasb、绿脓菌素、生物膜、几丁质酶chic或外毒素a。

所述的铜绿假单胞菌优选为铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)pao1。

本发明发现das不会抑制铜绿假单胞菌pao1菌株的生长，但能够显著抑制该菌的三个群体感应系统las、rhl和pqs，同时抑制由这三个群体感应系统调控的毒力因子的产生，包括胞外蛋白酶lasa、弹性蛋白酶lasb、绿脓菌素、生物膜以及几丁质酶chic和外毒素a等。因此可用于制备抑制铜绿假单胞菌毒力因子和群体感应系统的淬灭剂。

附图说明：

图1是das作用下铜绿假单胞菌pao1的生长曲线；

图2是das对铜绿假单胞菌群体感应系统关键基因及其调控的毒力基因表达的影响。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

pao1菌[铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)pao1]悬液的制备：将指数生长期的pao1培养液取样，离心，用pbs缓冲液洗涤一次，重悬于pbs中，并将菌浓度稀释至10⁸cfu/ml，得到pao1菌悬液。

1.das[烯丙基硫醚]对铜绿假单胞菌pao1生长的影响实验

分别向5支试管中加入lb培养基、das，并接入指数生长期的pao1菌悬液，总体积均为10ml，使pao1的菌浓度均为10⁶cfu/ml，das的浓度分别为0(对照)、0.14mg/ml、0.56mg/ml、1.11mg/ml、2.23mg/ml和4.45mg/ml。将几个实验组分别取样加入到自动生长曲线测定仪(bioscreenc)专用的蜂窝培养板中，每孔加入350μl的培养液，每个实验组三个平行。将蜂窝培养板置于自动生长曲线测定仪中，37℃振荡培养3天，每小时测定一次od600。以od600为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制das作用下pao1的生长曲线，以此研究das对pao1生长的影响。结果如图1所示。

2.das[烯丙基硫醚]对铜绿假单胞菌群体感应系统关键基因及其调控的毒力基因表达的影响实验

向50ml无菌lb液体培养基中加入处于对数生长期的pao1菌悬液，使菌液终浓度为10⁶cfu/ml。加入das，使得终浓度为0(对照组三个生物学重复分别命名为a1、a2、a3)和0.56mg/ml(实验组三个生物学重复分别命名为b1、b2、b3)；将各组置于37℃、180rpm条件下培养5h；离心并收集菌体，-80℃速冻后备用。

使用trizol(thermo公司)的试剂盒提菌体总rna。提取后用超微量分光光度计(implen,munich,德国)检测rna的纯度。每份rna样品的a260/a280值应该在1.8～2.0之间。使用primescriptrtmastermix试剂盒(takara，大连，中国)及etc811pcr仪(北京东胜创新生物科技有限公司进行反转录及实时荧光定量pcr扩增。q-pcr反应体系采用takara的sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(codeno.rr820a)，pcr程序为95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环；根据genbank网站上已发布10个基因序列，利用primerpremier5.0软件设计出进行q-pcr的引物，同时将16srrna基因作为内参基因，引物序列参数见表1。

表1实时荧光定量pcr使用的基因及其引物序列

实验结果：

不同浓度das作用下铜绿假单胞菌pao1的生长曲线结果如图1所示。实验结果显示，0.16-4.45mg/ml的das处理组与对照组中铜绿假单胞菌pao1的生长曲线没有显著的差异，均呈现了典型的生长曲线，包括延滞期、指数生长期、稳定期和衰亡期，因该生长曲线是以菌液的od600值为纵坐标，反映的是活细菌和死细菌的总吸光值，所以衰亡期不明显。因此，对照组和加入不同浓度das的实验组，铜绿假单胞菌pao1的生长动力学无显著差异，das不会抑制pao1菌株的生长。

从图2可以看出，das处理5h后，铜绿假单胞菌pao1菌株的三个群体感应系统的关键基因的转录水平均呈现了不同程度的下调，包括las系统的信号分子受体基因lasr，rhl系统的信号分子合成酶基因rhli及其信号分子受体基因rhlr，以及pqs系统的信号分子合成酶基因pqsa及其信号分子受体基因pqsr等。同时，das处理5h后，由铜绿假单胞菌三个群体感应系统共同调控的毒力基因的转录水平也出现了不同程度的下调，包括胞外蛋白酶基因lasa，弹性蛋白酶基因lasb，绿脓菌素合成基因phzm，生物膜形成相关基因psla，以及几丁质酶基因chic和外毒素基因toxa等。由此可见，das能够抑制铜绿假单胞菌的三个群体感应系统las、rhl和pqs，同时抑制由这三个群体感应系统调控的毒力因子的产生，从而能够控制铜绿假单胞菌的毒力和致病力。

综上的实验结果表明，低浓度的das不会抑制铜绿假单胞菌pao1菌株的生长(图1)，但能够抑制该菌的三个群体感应系统las、rhl和pqs(图2)，同时抑制由这三个群体感应系统调控的毒力因子的产生(图2)，从而能够控制铜绿假单胞菌pao1的毒力和致病力。