仿骨哈弗斯系统生物活性支架及其制备方法和应用与流程

本发明涉及仿骨哈弗斯系统生物活性支架及其制备方法和应用，属生物材料领域。

背景技术：

目前由创伤、炎症、骨肿瘤的手术治疗所导致的大段骨缺损的修复与再生是临床治疗骨缺损的难点之一。而骨组织工程和生物材料相结合的骨组织工程支架是研究骨缺损修复的热点。目前骨组织工程支架主要分为三大类，包括金属支架、高分子支架和生物陶瓷支架[1]，其中生物陶瓷支架由于其优异的抗压强度和生物活性而成为研究大段骨缺损修复的热点材料。制备陶瓷支架材料的工艺有很多种，如传统的造孔剂法、模版法、气泡法等。然而，这些方法都存在着许多不足之处。造孔剂法制备出的支架孔大小不均一，孔道之间不够连通；而模版法和气泡法制备的支架，力学强度又相对较低，无法满足骨修复材料的要求，而3d打印技术制备的生物陶瓷支架由于精度高，形状尺寸高度可控而成为制备复杂结构生物陶瓷支架的首选[2]。但是目前挤出式的3d打印技术仍不能一次性制备出仿骨哈弗斯系统结构的生物陶瓷支架。

以长骨为例，骨的结构包括皮质骨、松质骨以及中央的骨髓腔，皮质骨位于最表层，由紧密排列的骨板构成，成人的皮质骨占骨骼总重的80％，是骨骼承受扭曲应力、弯曲应力和压应力的基础[3]。在内、外环骨板之间有许多纵向圆筒状结构，称为哈弗斯系统(harversiansystem)，其中轴是一条纵行的管道，称为哈弗斯管(harversiancanal)，内有为骨细胞提供营养和氧气的毛细血管[4]。机体的绝大多数组织细胞由血液供应氧气和养料，由于受组织中氧气扩散作用的限制，细胞的存活范围局限于邻近毛细血管100～200μm的区域[5]，因此骨组织的血管化是十分必要的。松质骨由许多片状和针状的骨小梁相互交织成网状结构，这种结构使其具有良好的抗冲击性能，同时松质骨的自我代谢速率快，刺激成骨作用好。

现有技术文献：

[1]dengc,yaoq,fengc,lij,wangl,chengg,etal.3dprintingofbilineageconstructivebiomaterialsforboneandcartilageregeneration.advancedfunctionalmaterials2017；27:1703117.

[2]zhangw,fengc,yangg,lig,dingx,wangs,etal.3d-printedscaffoldswithsynergisticeffectofhollow-pipestructureandbioactiveionsforvascularizedboneregeneration.biomaterials2017；135:85-95.

[3]buckdw,2nd,dumanianga.bonebiologyandphysiology:parti.thefundamentals.plasticandreconstructivesurgery2012；129:1314-20.

[4]wegstug,baih,saize,tomsiaap,ritchiero.bioinspiredstructuralmaterials.natmater2015；14:23-36.

[5]carmelietp,jainrk.angiogenesisincancerandotherdiseases.nature2000；407:249.。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种仿骨哈弗斯系统生物活性支架及其制备方法和应用。

一方面，本申请提供一种仿骨哈弗斯系统生物活性支架，其包括：中空柱、位于中空柱的中空腔内的网状结构、以及形成于中空柱的实心部分内的一个以上的管，所述生物活性支架的材质为生物活性材料。

本发明的生物活性支架模拟了骨的哈弗斯系统结构，其中，中空柱类似于具有承重作用的皮质骨致密结构，网状结构类似于具有成骨作用的松质骨网状结构，管类似于具有成血管作用的哈弗斯管，该支架具有促进成骨及成血管的潜能，可用于骨缺损修复。

较佳地，所述中空柱、网状结构和管是一体化的。

较佳地，所述中空柱的内径为3～20mm，厚度为3～10mm。

较佳地，所述网状结构由多个针状或片状的梁相互交织而成，优选地，所述梁的直径为200～500μm。

较佳地，所述管沿中空柱的轴向延伸，优选地，所述管沿中空柱的轴向部分地贯穿所述中空柱的实心部分，即单侧贯穿所述中空柱的实心部分，非贯穿一侧仍为实心结构，其轴向长度为0.5～1mm。

较佳地，所述管之间相互连通。

本发明中，可以通过调节所述管的直径和/或数量来调节所述支架的抗压强度和/或孔隙率，优选地，所述管的数量为2～8个，所述管的直径为0.3～1.6mm。

较佳地，所述生物活性材料为生物陶瓷或金属。

第二方面，本申请提供上述仿骨哈弗斯系统生物活性支架的制备方法，其包括以下步骤：

利用光固化3d打印技术制备支架坯体；

将所得支架坯体烧结，得到所述仿骨哈弗斯系统生物活性支架。

根据本发明，利用光固化3d打印技术，可以精确可控地制备出仿骨哈弗斯系统生物活性支架。

较佳地，利用三维制图软件进行模型设计，导出为stl格式文件，将stl文件导入光固化打印机中的软件进行切片处理，生成tdp格式文件并导入打印机用于打印。优选地，所述三维制图软件为3dsmax软件或cad。

第三方面，本申请提供上述仿骨哈弗斯系统生物活性支架在制备骨缺损修复材料中的应用。

本发明的生物活性支架很好地模拟了骨的哈弗斯系统结构及生理环境，具有促进成骨及成血管的潜能，可用于骨缺损修复。

附图说明

图1为不同哈弗斯管径与管数量的仿骨哈弗斯系统镁黄长石支架光学照片。

图2为支架电镜照片，(a)(b)(c)依次为设计直径0.8mm，1.2mm，1.6mm的支架哈弗斯管部分，(d)为支架的松质骨部分，(e)为支架的烧结情况，可以看出，支架烧结致密。

图3中的(a)为不同哈弗斯管直径的支架抗压强度测试，可以看出支架抗压强度随哈弗斯管径降低而降低；(b)为不同哈弗斯管数量的支架抗压强度测试，可以看出支架抗压强度随哈弗斯管数量增加而提高。

图4中的(a)为不同哈弗斯管直径的支架孔隙率测试，可以看出支架孔隙率随哈弗斯管径增加而提高；(b)为不同哈弗斯管数量的支架孔隙率测试，可以看出支架孔隙率随哈弗斯管数量增加而提高。

图5中的(a)为不同哈弗斯管数量的支架负载的hbmsc单培养、huvec单培养及两种细胞共培养1，3，7天的增殖结果，可以看出共培养组的增殖效果明显优于单培养组。(b)共培养组不同天数的增殖效果明显。

图6中的(a)为不同哈弗斯管直径的支架负载的hbmsc单培养、huvec单培养及两种细胞共培养1，3，7天的增殖结果，可以看出共培养组的增殖效果明显优于单培养组。(b)共培养组不同天数的增殖效果明显。

图7为共培养组培养1天的黏附情况共聚焦显微照片，(a)(b)(c)依次为设计直径0.8mm，1.2mm，1.6mm的支架哈弗斯管部分，负载huvec，(d)为支架的松质骨部分，负载hbmsc，可以看出共培养的两种细胞生长状态良好。

图8为共培养组培养1天的黏附情况扫描电镜照片，(a)(b)为支架松质骨部分，负载hbmsc，(c)(d)为支架哈弗斯管部分，负载huvec，可以看出共培养的两种细胞生长状态良好，细胞铺展，伪足丰富。

图9为单培养及共培养组培养三天的成骨及成血管相关基因表达。(a)共培养组相比单培养组成骨相关基因col-1，bmp2，alp表达量明显上升；(b)共培养组相比单培养组成血管相关基因ve-cad，enos，vegf表达量明显上升。

具体实施方式

以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图和下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

在此公开了一种仿骨哈弗斯系统生物活性支架(以下简称支架)，其模仿人和动物骨骼的三部分结构：具有承重作用的皮质骨致密结构、具有成骨作用的松质骨网状结构以及具有成血管作用的哈弗斯系统管状结构。

图1示出本发明一实施方式的支架的光学照片。如图1所示，该支架包括：中空柱、位于中空柱的中空腔内的网状结构、以及形成于中空柱的实心部分内的一个以上的管。

中空柱仿皮质骨致密结构。支架的各部分的尺寸及比例是可调的。例如，中空柱的内径可为3～20mm，厚度可为3～10mm，高度可为2.5～40mm。

网状结构仿松质骨结构，其可由多个针状或片状的梁相互交织而成。一个示例中，网状结构由多层不同取向的梁阵列沿中空柱轴向层叠而成。梁的直径可以根据需要调节，例如可为0.2～1mm。

网状结构可与中空柱一体化。即网状结构可与中空柱的内壁相连，例如构成网状结构的各梁的两端都位于中空柱的内壁上。

管可以是形成在中空柱的实心部分内的空腔。管可为仿哈弗斯管结构，其可沿中空柱的轴向延伸。优选实施方式中，管沿中空柱的轴向部分地贯穿中空柱。即管并未完全轴向贯穿中空柱的实心部分。也就是说，管的一端向外开口，另一端封闭。封闭端实心部分的轴向长度可为0.5～1mm，保证烧结过程不会使封闭端出现裂纹或缺口从而导致细胞悬液从底部渗漏，影响细胞接种密度，超过1mm会影响管的长度从而使细胞接种量变少。而管的长度只要大于或等于2mm即可用于接种细胞。例如，管的长度可为中空柱长度的2/3～39/40。

中空腔可以与管同样地，一端向外开口，另一端封闭，且中空腔与管的开口端为同一端。同样地，中空腔封闭端的轴向长度可为0.5～1mm，开口端长度可大于或等于2mm。

管之间可相互连通，例如通过类似于伏克曼管(volkmanncanal)的横向管道连通。另外，优选地，管与中空柱的中空腔不连通。

根据上述结构，支架精确地模仿骨的多级结构的同时模仿了骨的生理环境，中空柱实心部分的管模仿哈弗斯管，且管之间是连通的，但与中空腔内的网状结构是不连通的，保证在接种细胞时管内细胞与网状结构内细胞不直接接触，从而实现非接触式共培养，精确地模拟了位于哈弗斯管内细胞与松质骨内细胞在生理环境下不直接接触的事实，为研究体外细胞非接触式共培养提供了具有生物活性的细胞容器。

管的直径可调，例如可在0.3～1.6mm范围内调节。管的数量也可调，例如可在2～8的范围内调节。通过调节管的直径和/或数量，可以调节支架的抗压强度和/或孔隙率。另外，通过调节网状结构的网孔形状和/或大小等，也可以调节支架的抗压强度和/或孔隙率。一些实施方式中，支架的抗压强度为14.8～21.9mpa，孔隙率为25％～34％。

另外，各管的直径可以相同也可以不同。优选实施方式中，直径相同的多个管绕中空柱的中心轴均匀排列，以保证管对轴向应力的均匀分散。

本发明中，支架的材质为生物活性材料，例如为生物陶瓷、金属等。生物陶瓷例如可举出镁黄长石(ca2mgsi2o7)、磷酸三钙(β-tcp)、白硅钙石(ca7mgsi4o16)、羟基磷灰石(ca10(po4)6(oh)2)、硅酸钙(ca2sio4)等。金属例如可举出铁等。

本发明一实施方式中，利用光固化3d打印技术制备支架。以下，作为示例，具体说明支架的制备方法。

首先，制备含有生物活性材料和光敏树脂的浆料。一个示例中，将生物活性材料、烧结助剂和光敏树脂按照质量比1：(0.25～0.5)：(0.6～1)混合球磨得到浆料。烧结助剂可以是生物玻璃粉例如45s5生物玻璃粉、52s4.6生物玻璃粉、55s4.3生物玻璃粉、60s3.8生物玻璃粉等。光敏树脂可以采用本领域公知的光敏树脂，例如聚氨酯丙烯酸酯、环氧丙烯酸酯或环氧树脂等。

并且，生成三维打印文件用于3d打印。一实施方式中，利用三维制图软件进行模型设计，然后进行切片处理，生成三维打印文件。例如可通过如下方式生成三维模型文件：利用三维制图软件进行模型设计，导出为stl格式文件，将stl文件导入光固化打印机中的软件进行切片处理，生成tdp格式文件并导入打印机用于打印。三维制图软件例如可采用3dsmax软件、cad等。

然后，将浆料导入光固化打印机进行打印，得到支架坯体。

然后，将支架坯体进行烧结，得到支架。烧结制度可根据材料选择，例如可在1100～1350℃煅烧3～5小时。

可以将具有成骨作用的细胞例如人骨髓间充质干细胞(hbmsc)和具有成血管作用的细胞例如人脐静脉内皮细胞(huvec)分别接种于支架的松质骨部分(网状结构)和哈弗斯管部分(管)，构成支架负载的两种细胞的共培养体系。结果发现，相比于单独培养，共培养组增殖效果更明显，且成骨相关基因col-1，bmp2，alp及成血管相关基因ve-cad，enos，vegf表达量明显提高。因此，在此公开的仿骨哈弗斯系统生物活性支架与hbmsc和huvec的共培养体系很好地模拟了骨的哈弗斯系统结构及生理环境，具有促进成骨及成血管的潜能，能够用作修复大段骨缺损的植入材料。

在此公开了制备仿骨哈弗斯系统的生物活性支架，通过光固化3d打印技术一次性打印出尺寸、孔径精确可控的仿皮质骨、松质骨以及哈弗斯管结构一体化的生物活性支架。并通过模拟体内生理环境，构建多种成骨、成血管相关细胞的共培养体系，证实了这种具有骨哈弗斯系统结构生物活性支架的成骨、成血管性能。

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

实施例1

利用3dsmax软件设计支架模型，设计尺寸为直径10mm，高度3mm圆柱状仿骨哈弗斯系统结构支架，其中哈弗斯管直径分为1.6mm，1.2mm，0.8mm三种，哈弗斯管数量为8个。将绘制好的支架模型输出为stl格式文件并导入光固化打印机(购自北京十维科技有限责任公司，型号为autocera-m)自带的软件进行切片处理，生成tdp格式文件并导入打印机。

纯镁黄长石粉体(购自昆山华侨科技新材料有限公司)60g，与1.5g45s5生物玻璃粉体(购自昆山华侨科技新材料有限公司)，41g光敏树脂(环氧丙烯酸树脂，购自金华万豪配件有限公司)混合球磨得到光敏陶瓷浆料，将配置好的浆料置于打印机中进行打印得到支架材料。

将打印好的支架在1350℃煅烧3小时，得到纯的镁黄长石陶瓷支架。

实施例2

利用3dsmax软件设计支架模型，设计尺寸为直径10mm，高度3mm圆柱状仿骨哈弗斯系统结构支架，其中哈弗斯管直径为1.6mm，哈弗斯管数量分为2个，4个，8个三种。将绘制好的支架模型输出为stl格式文件并导入光固化打印机自带的软件进行切片处理，生成tdp格式文件并导入打印机。

纯镁黄长石粉体50g，与1.25g45s5生物玻璃粉体，51.25g光敏树脂混合球磨得到光敏陶瓷浆料，将配置好的浆料置于打印机中进行打印得到支架材料。

将打印好的支架在1350℃煅烧3小时，得到纯的镁黄长石陶瓷支架。

实施例3

利用3dsmax软件设计支架模型，设计尺寸为直径10mm，高度3mm圆柱状仿骨哈弗斯系统结构支架，其中哈弗斯管直径为1.6mm，哈弗斯管数量分为2个，4个，8个三种。将绘制好的支架模型输出为stl格式文件并导入光固化打印机自带的软件进行切片处理，生成tdp格式文件并导入打印机。

纯β-tcp粉体(购自昆山华侨科技新材料有限公司)50g，与50g光敏树脂混合球磨得到光敏陶瓷浆料，将配置好的浆料置于打印机中进行打印得到支架材料。

将打印好的支架在1100℃煅烧3小时，得到纯的β-tcp陶瓷支架。

将所得的支架进行表征以及生物活性、成骨和成血管性能的评价，具体如下。

图1为不同哈弗斯管径与管数量的仿骨哈弗斯系统镁黄长石支架光学照片，可以看出该支架具有仿骨哈弗斯系统结构。

图2为支架电镜照片，(a)(b)(c)依次为实施例1中设计的直径0.8mm，1.2mm，1.6mm的支架哈弗斯管部分，(d)为支架的松质骨部分，(e)为支架的烧结情况，可以看出，支架烧结致密。

通过如下方法测试支架抗压强度：将支架制备成直径为10mm，高度为11mm的圆柱状样品(该尺寸为烧结前的尺寸，即设计尺寸，烧结过后为直径8mm，高度9mm左右的陶瓷支架，且所有用来表征的支架都是烧结过的)测得支架直径d，利用万能材料试验机以0.5mm/min的加载速度均匀加载至支架破碎，记录最大载荷p，抗压强度σc的计算公式为σc＝4p/πd²，每组样品数量为6个。图3中的(a)为实施例1所得的不同哈弗斯管直径的支架抗压强度测试，可以看出支架抗压强度分别为20.2mpa、20.8mpa、18.6mpa，管直径与实心部分厚度(中空柱的壁厚)的比值分别为0.53，0.4，0.26，当管直径与厚度比值在0.4时抗压强度达到峰值。图3中的(b)为实施例2所得的不同哈弗斯管数量的支架抗压强度测试，可以看出支架抗压强度分别为14.6mpa、17.6mpa、20.2mpa，随哈弗斯管数量增加而提高。

通过如下方法测试支架孔隙率：采用阿基米德排水法，将陶瓷支架于100℃干燥过夜，称得干重m1，然后将支架浸泡在去离子水中，抽真空至无气泡产生，取出支架称得湿重m2，最后将支架浸泡在去离子水中测得浮重m3，孔隙率p的计算公式为p＝(m2-m1)/(m2-m3)×100％，每组样品数量为6个。图4中的(a)为实施例1所得的不同哈弗斯管直径的支架孔隙率测试，可以看出支架孔隙率分别为27.5％、30.1％、33.9％，随哈弗斯管径增加而提高；(b)为不同哈弗斯管数量的支架孔隙率测试，可以看出支架孔隙率分别为22％、24.6％、33.9％，随哈弗斯管数量增加而提高。

支架负载的成骨与成血管相关细胞三维共培养体系的建立

模仿骨的生理环境，将不同哈弗斯管径与管数量的镁黄长石支架与人骨髓间充质干细胞(hbmsc)和人脐静脉内皮细胞(huvec)共培养，将hbmsc接种于支架松质骨部分，将huvec接种于支架哈弗斯管内，构成支架负载的hbmsc和huvec的共培养体系。

支架负载的细胞共培养体系的成骨及成血管分化潜能研究

研究不同哈弗斯管管径与管数量的镁黄长石支架对两种细胞共培养及单独培养的粘附、增殖以及成骨和成血管相关基因表达的影响。

图5中的(a)为实施例2所得的不同哈弗斯管数量的支架负载的hbmsc单培养、huvec单培养及两种细胞共培养1，3，7天的增殖结果，可以看出共培养组的增殖效果明显优于单培养组。图5中的(b)为共培养组不同天数的增殖结果，可以看出明增殖效果明显。

图6中的(a)为实施例1所得的不同哈弗斯管直径的支架负载的hbmsc单培养、huvec单培养及两种细胞共培养1，3，7天的增殖结果，可以看出共培养组的增殖效果明显优于单培养组。图6中的(b)为共培养组不同天数的增殖结果，可以看出明增殖效果明显。

图7为共培养组培养1天的黏附情况共聚焦显微照片，(a)(b)(c)依次为实施例1中的设计直径0.8mm，1.2mm，1.6mm的支架哈弗斯管部分，负载huvec，(d)为支架的松质骨部分，负载hbmsc，可以看出共培养的两种细胞生长状态良好。

图8为共培养组培养1天的黏附情况扫描电镜照片，(a)(b)为支架松质骨部分，负载hbmsc，(c)(d)为支架哈弗斯管部分，负载huvec，可以看出共培养的两种细胞生长状态良好，细胞铺展，伪足丰富。

图9为单培养及共培养组培养三天的成骨及成血管相关基因表达。(a)共培养组相比单培养组成骨相关基因col-1，bmp2，alp表达量明显上升；(b)共培养组相比单培养组成血管相关基因ve-cad，enos，vegf表达量明显上升。

以上结果表明负载共培养细胞的支架能够显著地促进两种细胞的增殖，促进hbmsc的成骨分化和huvec的成血管分化。