一种干附片的新型炮制方法与流程

本发明涉及干附片炮制技术领域，具体涉及一种干附片的新型炮制方法。

背景技术：

附子为毛茛科植物乌头aconitumcamichaelidebx的子根加工品，味辛甘，性大热，有毒，归心、肾、脾经，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛等功效；附子为有毒中药的代表，其主要毒性成分为双酯型生物碱，经炮制后此类成分可水解转化为单酯型生物碱，或进一步转化为醇胺类生物碱，毒性大大降低；2015版《中国药典》规定这些附子加工品的总双酯型乌头碱含量≤0.01％、总单酯型乌头碱含量≥0.01％方可达到安全用药标准；新鲜附子具有“隔夜腐”的特性，采收后需要立即做防腐处理；目前传统的防腐处理包括以下三种方式：低温保藏、晾干烘干和高浓度胆巴浸泡；附子亩产高，单价较低，低温保藏虽然技术可行，但由于成本高昂，在实际生产中难以大量应用。晾干的成本低，烘干的成本较高，实际中容易操作，但由于干附子加工黑顺片的工艺不成熟，目前只有零星应用；高浓度胆巴浸泡成本低，农户与附子加工企业均可实施，是目前附子加工行业主要防腐模式；胆附子炮制流程主要包括胆巴浸泡、切片、清水漂洗、开水煮、高温蒸、烘干和晾干等；已有的研究表明10％浓度的胆巴浸泡一周后基本可以达到短期防腐的目的，但附子采收季节短，采收后加工企业往往需要将附子长时间浸泡在20％-40％的胆巴溶液中陆续加工，最长浸泡可以达到9-12个月，从而在有限的加工能力下，达到延长加工周期、降低成本的目的；但已有的研究表明，胆巴浸泡附子后，随着浸泡时间延长，胆巴在附子内的积累量增多，胆巴为氯化钙为主成分的金属盐，附子内高浓度的胆巴残留在后续的多次漂洗后能达到胆巴残留安全量的范围，但随之会造成乌头碱等药效成分的大量流失。有文献记载，附子在炮制生产过程中，生物碱的减少主要在于胆巴水泡损失31.6％、漂片损失33.6％和水解损失16.19％，生物碱损失总量达81.39％，导致加工后的附片药效成分生物碱的含量难以达到药典的标准，少次清洗虽然能降低药效成分的流失，但胆巴高残留的附片入药食用后易引发胃部灼烧、痉挛等消化道不良反应；因此无胆附子的加工开发对于附子的安全用药具有重要的现实意义。

基于干附子进行附片的加工已陆续的出现，有相关研究指出，新鲜附子切片晾干，制得干附片在200℃干热烘制7.5min、30min和60min，总双酯型乌头碱含量和总单酯型乌头碱含量均可达到2015版《中国药典》的标准，120℃湿热蒸制60min、90min和120min后，总双酯型生物碱含量和总单酯型生物碱含量可达到2015版《中国药典》的标准；但该方法中，用新鲜附子直接切片后，切面表面在空气中会很快褐变，后续炮制的黑顺片外观要求达不到2015版《中国药典》中规定的“外皮黑褐色，切面暗黄色，油润具光泽，半透明状”的要求；关于新鲜附片的褐变的抑制，已有用抗褐变剂vc处理和烫漂处理的研究，但只能在一定程度上钝化多酚氧化酶的活性，抑制褐变能力有限，而阶段升温灭酶切片烘干在隔绝氧气的情况下时多酚氧化酶逐步钝化至灭活，能够最大限度抑制褐变，但对设备要求极高，工业化生产难以大规模应用；此外，有研究对同一来源与不同来源的干附子进行清洗，加0.67倍清水真空闷润1.5h，126℃、0.15mpa蒸制，70℃低温烘干后，附片双酯型生物碱总量达到2015版《中国药典》的要求，但“表面黑红色，外皮黑色，有油润光泽，半透明，断面黑红色”，单酯型生物碱总量也难以达到2015版《中国药典》要求。因此研发设备要求低、工艺简单高效、低成本，符合药典要求的附片加工工艺对附子行业具有重要的现实意义。

用干附片的炮制不存在浸泡胆巴与漂洗的过程，因此药效成分在保留的同时也使大量毒性成分残留在附片中，增加了附片使用的风险。酶法提取已广泛应用于中药有效成分的提取中，具有高效性和专一性，因其可直接针对细胞壁作用，通过降解细胞壁中纤维素、果胶等成分，使细胞内容物迅速溶出，进入提取溶剂中，提高提取效率，缩短提取时间，加之反应条件温和，不易破坏药效成分；已有研究指出运用酶解提取贝母中的生物碱后由0.0765％上升到了0.1065％。因此酶法应用于干附片的炮制有望促进其毒性成分的浸出以达到减轻用药风险的目的；此外，在附子炮制过程中特定辅料的加入可进一步达到增效减毒的目的；在附子的炮制过程中传统药方中可加入人参，干姜，黄芪，桂枝，白术，肉桂等，在缓解附子毒性的同时辅佐其药效的有效发挥起到温阳驱寒，固表止汗，强心通脉，驱寒燥湿，散寒止痛等功效；一种基于传统回阳救逆四逆汤的配方中，应用淡附片300g，干姜200g，炙甘草300g，由于附子大辛大热，温通下焦，其中干姜辛温，辅佐附子荡涤寒邪，甘草则可起到固护阴液缓姜附燥烈之性，缓附子之毒，温健脾阳，调中补虚的功效；已有报道指出，生姜榨汁，生姜煮汁，干姜煮汁与附子同煎或是生姜片拌附子与干姜片拌附子的手段，可使附子中毒性三种双酯型生物碱成分含量大幅度降低，并在此基础上保留或增加附子中单酯型生物碱成分；同时甘草-附子合煎液与甘草-附子合并液较附子单煎液中生物碱变化与姜-附子配伍呈现相似的趋势，且附子-甘草合煎液能在一定程度上减缓附子中6种生物碱类成分在大鼠体内的吸收，进一步达到减毒的目的；因此，在炮制过程中加入可与附子配伍的辅料进一步缓解附子的毒性，且在一定程度上增加其药用价值。

除生物碱外，附子多糖是附子的另一大类药效成分，近年来逐渐受到关注，附子多糖具有调节免疫、抗肿瘤、保护心肌细胞、降血脂等作用，有研究指出，在附子多糖对h22和s180荷瘤小鼠抗肿瘤作用研究中，附子多糖可以延长荷瘤小鼠的存活时间，提高淋巴细胞转化率和nk细胞活性，上调抑癌基因p53和fas的表达，提高肿瘤细胞凋亡率；同时附子多糖可减少缺氧/复氧心肌细胞丙二醛的生成和乳酸脱氢酶的释放，促进金属硫蛋白的合成，清除活性氧，从而对氧化应激损伤的心肌细胞起到保护作用；因此在炮制过程中关注生物碱含量的同时，注重对附子多糖含量的保留或提高，对于提高附子的药用价值具有重要的意义。

因此，在附子炮制过程中结合生化手段与传统中医验方所得的无胆饮片，具有极高的市场价值和广阔的发展前景。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种干附片的新型炮制方法。本发明要解决的技术问题通过以下技术方案实现：

一种干附片的新型炮制方法，包括以下步骤：

(1)将附子切成附片，在附片上均匀喷洒抗氧化剂后晾干；

(2)将晾干后的附片均匀喷洒清水使得干附片表面充分湿润；对湿润后的附片均匀喷洒由果胶酶和纤维素酶混合而成的混合酶进行酶解处理，对酶解处理后的附片进行超声恒温恒湿处理；

(3)对所述步骤(2)处理后的附片喷撒由甘草粉和干姜粉混合而成的混合粉，搅拌至附片表面挂粉均匀且不出现掉粉现象；

(4)将挂粉均匀的附片高压蒸制；

(5)蒸制后的附片晾干至恒重后即得附子炮制成品。

进一步的，所述步骤(1)中抗氧化剂为1％(w/v)抗坏血酸、米糠素、芝麻酚和茶多酚质量比1:1:1:1的混合物。

进一步的，所述步骤(2)中酶解处理温度为50℃，所述酶解处理的ph值为5.0；所述超声恒温恒湿处理的处理时间为60min。

进一步的，所述步骤(2)中酶解反应所用溶解酶的缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，其ph值范围为3.0-.0.5。

进一步的，所述果胶酶和纤维素酶的质量比为1:1，所述果胶酶和纤维素酶的总用量为0.6-1.0g/100g。

进一步的，所述步骤(3)中甘草粉与干姜粉的质量比为1-2:1。

进一步的，所述步骤(4)中高压蒸制处理时间为20-30min，高压蒸制温度为121℃。

与现有技术相比，本发明炮制方法具有以下有益效果：

与传统附子炮制方法相比，本发明中使用抗坏血酸、米糠素、芝麻酚、茶多酚等比例混合抗氧化剂抑制附子切片后多酚氧化酶的活性，不同于传统甘草或干姜制附子的暗黄色，最终得到饮片呈现鲜亮黄色，且蒸制后附片表面颜色更加均匀使附片形态大为改观；本发明选择在切片后直接进行晾晒处理，减少了附子采挖后腐烂导致的资源浪费，由于未经胆巴浸泡，不仅提高了生产效率，同时避免了胆巴浸泡附子后由于胆巴残留而引起的肾毒性，提高了用药的安全性，本发明提供的方法方法操作简单，生产周期短，适合大规模工业化生产，利用本发明新型干附片的炮制方法较传统无胆蒸附片，炒附片与新型蒸附片更为新颖。将酶工程技术与传统中医理论相结合，去除附子毒性的前提下，更大程度上保留了其药效成分，并提高具有调节免疫和降血糖等作用的附子多糖的含量，提高了附子的药用价值，具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1是抗氧化剂喷洒结果示意图。

图2是色谱条件检测结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

一种干附片的新型炮制方法，包括以下步骤：(1)将附子切成附片，在附片上均匀喷洒抗氧化剂后晾干；(2)将晾干后的附片均匀喷洒清水使得干附片表面充分湿润；对湿润后的附片均匀喷洒由果胶酶和纤维素酶混合而成的混合酶进行酶解处理，对酶解处理后的附片进行超声恒温恒湿处理；(3)对所述步骤(2)处理后的附片喷撒由甘草粉和干姜粉混合而成的混合粉，搅拌至附片表面挂粉均匀且不出现掉粉现象；(4)将挂粉均匀的附片高压蒸制；(5)蒸制后的附片晾干至恒重后即得附子炮制成品。

步骤(1)中抗氧化剂为1％(w/v)抗坏血酸、米糠素、芝麻酚和茶多酚质量比为1:1:1:1的混合物。

步骤(2)中酶解处理温度为50℃，所述酶解处理的ph值为5.0；所述超声恒温恒湿处理的处理时间为60min。

步骤(2)中酶解反应所用溶解酶的缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，其ph为3.0-.0.5。

果胶酶和纤维素酶的质量比为1:1，所述果胶酶和纤维素酶的总用量为0.6-1.0g/100g。

步骤(3)中甘草粉与干姜粉的质量比为1-2:1。

步骤(4)中高压蒸制处理时间为20-30min，高压蒸制温度为121℃。

实施组例一：抗氧化剂筛选实验

实施例1新型干附片的炮制

将新鲜泥附子洗净，切成附片，均匀喷洒1％(w/v)抗坏血酸后晾干备用。

实施例2新型干附片的炮制

将新鲜泥附子洗净，切成附片，均匀喷洒1％(w/v)米糠素后晾干备用。

实施例3新型干附片的炮制

将新鲜泥附子洗净，切成附片，均匀喷洒1％(w/v)芝麻酚后晾干备用。

实施例4新型干附片的炮制

将新鲜泥附子洗净，切成附片，均匀喷洒1％(w/v)茶多酚后晾干备用。

实施例5新型干附片的炮制

将新鲜泥附子洗净，切成附片，均匀喷洒1％(w/v)抗坏血酸、米糠素、芝麻酚和茶多酚(1:1:1:1)混合抗氧化剂后晾干备用。

实施组例二：酶解条件优化实验

实施例6新型干附片的炮制

一种新型干附片的炮制方法包括以下步骤(1)将新鲜泥附子洗净，切成附片，均匀喷洒抗氧化剂后晾干备用；(2)晾干后的附子置于适宜容器中，均匀喷洒清水使得干附片表明充分湿润；浸润后的附子喷洒果胶酶和纤维素酶(1:1)，酶解条件为(50℃，6g/100g，ph5.0)恒温恒湿处理60min。(3)撒适量甘草粉和干姜粉的混合粉(2：1)，搅拌至附片表面挂粉均匀且不出现掉粉现象；(4)将挂粉均匀的附片放置于高压设备中，高压蒸制处理，工作温度121℃，处理时间为20min。(5)处理后取出炮制好的附子晾干至恒重后即得附子炮制成品。

实施例7

与实施例6相比，除酶解温度改为30℃外，其他与实施例6相同。

实施例8

与实施例6相比，除酶解温度改为40℃外，其他与实施例6相同。

实施例9

与实施例6相比，除酶解温度改为60℃外，其他与实施例6相同。

实施例10

与实施例6相比，除混合酶用量改为2g/100g外，其他与实施例6相同。

实施例11

与实施例6相比，除混合酶用量改为4g/100g外，其他与实施例6相同。

实施例12

与实施例6相比，除混合酶用量改为8g/100g外，其他与实施例6相同。

实施例13

与实施例6相比，除混合酶用量改为10g/100g外，其他与实施例6相同。

实施例14

与实施例6相比，除酶解反应ph值改为3.0外，其他与实施例6相同。

实施例15

与实施例6相比，除酶解反应ph值改为4.0外，其他与实施例6相同。

实施例16

与实施例6相比，除酶解时超声恒温恒湿处理30min外，其他与实施例6相同。

实施例17

与实施例6相比，除酶解时超声恒温恒湿处理90min外，其他与实施例6相同。

实施例18

与实施例6相比，除省略步骤(2)中加入纤维素酶及果胶酶(1:1)的操作外，其他步骤与实施例6相同。

实施组例三：甘草粉与干姜粉使用比例筛选

实施例19

与实施例6相比，除甘草粉与干姜粉的比例改为1:1外，其他与实施例6相同。

实施例20

与实施例6相比，除甘草粉与干姜粉的比例改为1:2外，其他与实施例6相同。

实施例21

与实施例6相比，除加入甘草粉与干姜粉(2:1)改为只加入甘草粉外，其他与实施例6相同。

实施例22

与实施例6相比，除加入甘草粉与干姜粉(2:1)改为只加入干姜粉外，其他与实施例6相同。

实施例23

与实施例6相比，除省略步骤(3)中加入甘草粉与干姜粉的步骤外，其他与实施例6相同。

实施组例四：蒸制时间优化实验

实施例24

与实施例6相比，蒸制时间改为30min外，其他与实施例6相同。

实施例25

与实施例6相比，蒸制时间改为40min外，其他与实施例6相同。

对比组例

对比例1：未炮制干附片

将新鲜泥附子洗净，切成附片，晾干备用。

对比例2：新型无胆蒸附片

生附子清洗后，加0.67倍清水真空(真空度0.0095以上)，闷润1.5h，126℃，0.15mpa。蒸制，70℃低温烘干。

对比例3：传统无胆蒸附片

取生附片投入蒸制容器内，常压蒸制，至出现油面光泽，低温干燥。

对比例4：无胆炒附片

取河砂投入炒锅内，炒至滑利状态，投入净生附片，炒至外表深棕黄色，断面棕黄色，取出迅速筛去砂子，放凉。

实验结果检测

1.实施例1-5喷洒不同抗氧化剂所得干附片形态对比

如图1所示从左至右分别喷洒1％(w/v)坏血酸，1％(w/v)米糠素，1％(w/v)芝麻酚，1％(w/v)茶多酚及1％(w/v)混合抗氧化剂。

由图1可知，与单一抗氧化剂处理后的附片外观相比，混合抗氧化剂处理后的附片外观整洁且颜色均匀。

2.实施例6-22与对比例1-3的生物碱含量变化

运用高效液相色谱法(hplc)检测所得附片中双酯型生物碱(乌头碱，次乌头碱，新乌头碱)与单酯型生物碱(苯甲酰乌头原碱，苯甲酰次乌头原碱，苯甲酰新乌头原碱)的含量。

方法如下：

对照品溶液的制备

取苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品、乌头碱对照品、次乌头碱对照品和新乌头碱对照品各1mg，精密称定，加甲醇1ml至刻度线，摇匀，制成每1mg/ml各含的对照品储备液，存于4℃冰箱中备用。

供试品溶液的制备

分别取各样品粉末2g，平行称3份，置250ml具塞锥形瓶中，加25％氨水3ml，浸润30min。精密加入异丙醇-乙酸乙酯(1:1)混合溶液50ml，密塞，称定质量，超声处理30min(功率300w，频率40khz，水温在25℃以下)，放冷，再称重，用异丙醇-乙酸乙酯(1:1)混合溶液补足失重，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入甲醇溶液2ml，转移至离心管，0.45um微孔滤膜滤过，即得。

色谱条件

应用hplc法，以phenomenexrp-c18(250mm×4.6mm，5um)色谱柱为固定相，梯度洗脱(a泵：0.1％二乙胺；b泵：乙腈)，条件：0-8min，b为28％；8-12min，b为28％-33％；12-45min，b为33％-50％；45-55min，b为50％；柱温25℃，体积流量1.0ml/min，检测波长230nm，进样量均为20ul。

检测结果：如图2所示。

其中从左向右依次为：苯甲酰新乌头碱，苯甲酰乌头碱，新乌头碱，苯甲酰次乌头碱，乌头碱，次乌头碱标品分离图

通过计算得到各类乌头碱标准曲线(峰面积与含量的关系)：

3.实施例6-22与对比例1-3的附子多糖含量

运用苯酚-硫酸法测定附子多糖的含量。

方法如下：

标准曲线：准确称取标准葡聚糖(或葡萄糖)100mg于250ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml，各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6％苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，摇匀冷却，沸水浴显色15min以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖浓度，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

样品含量测定：取样品1克(湿样)加5ml15％三氯乙酸溶液研磨，再加2ml5％三氯乙酸溶液研磨，倒上清液于50ml离心管中，再加1ml5％三氯乙酸溶液研磨，倒上清液；将残渣一起到入离心管；6000r/min离心10分钟，取上清液到25ml锥形比色管中；向比色管中加入2ml6mol/l盐酸，摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时；水浴后，用流水冷却后加入2ml6mol/l氢氧化钠摇匀。定容至50ml的容量瓶中；吸取0.2ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6％苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光吸收值；每次测定取双样对照；以标准曲线计算多糖含量。

实验结果见下表：

在实施组例二中，对纤维素酶与果胶酶(1:1)的酶解反应条件进行了优化；在实施例6-18中，以实施例18为对照组；加入酶后在各种反应条件下所得饮片都达到了减少其毒性成分双酯性生物碱含量的目的；实施例6、12及13中均可达到单酯型生物碱高于0.1％，其中实施例6中方案的饮片多糖含量最高；最终得到酶解反应最优条件为50℃，0.6-1.0g/100g，ph5.0，超声恒温恒湿处理60min。

在实施组例三中，对甘草粉与干姜粉的用法进行了筛选。在实施例19-23中，以实施例23为对照组。甘草粉的加入与干姜粉的单一加入与混合加入均对附子起到了减毒作用，其双酯型生物碱均大量降低，其中甘草粉与干姜粉混合比2:1和1:1时可使单酯型生物碱达到0.1％以上；最终筛选得到的甘草粉与干姜粉的用量为1-2:1。

在实施组例四中，对处理好的附子蒸制时间进行了优化。结合实施例6中方法得到，蒸制20-30min后，经步骤(2)浸出的有效成分单酯型生物碱与毒性成分双酯型生物碱与甘草粉与干姜粉充分结合，使毒性成分可控于含量≤0.002％并保证有效成分含量≥0.100％，而蒸制时间对附子多糖的含量没有明显影响。

在对比组里中选择未经炮制后的干附片、新型无胆蒸附片、传统无胆蒸附片及无胆炒附片与本发明中所得新型无胆干附片进行对比。对比例2-4中所得饮片虽均可达到2015版《中国药典》中附子有效成分限量要求，但其单酯型生物碱含量均低于本发明所得饮片。本发明所得附片在保证有效成功含量提高，毒性成分降低的前提下，其附子多糖的含量较传统炮制方法及其余无胆炮制方法也有所提高。

按照本发明中新型炮制方法所得的干附片，具有毒性成分双酯型生物碱含量低(≤0.002％)，有效成分单酯型生物碱含量高(≥0.100％)，并且附子多糖含量高(＞0.6％)的优点。

综上所述，提供了一种干附片附子炮制的新方法，本发明通过运用抗氧化剂处理附片外观，并运用混合酶处理并酶促反应进行优化，其中创新应用超声恒温恒湿的手段提高酶促反应的效率。在此基础上，加入甘草粉与干姜粉与毒性成分双酯型生物碱紧密结合，并缓解其毒性，提高药效成分的含量。本发明的方法简单，操作性强，具备广阔的应用前景和巨大的市场价值。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。