蛋白质缀合物的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35u.s.c.§119(e)要求于2017年3月29日提交的美国临时申请第62/478,398号的优先权，所述申请通过引用以其全文并入。

关于序列表的声明

与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且在此通过引用并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称为tdwg_007_01wo_st25.txt。所述文本文件为约251kb，于2018年3月28日创建，并通过efs-web以电子方式提交。

本公开部分涉及精氨酸脱亚胺酶(adi)和肿瘤坏死因子(tnf)超家族配体的缀合物，以及相关的组合物和其使用方法。本公开还涉及六聚体多肽和三聚体多肽的缀合物、第一和第二三聚体多肽的缀合物以及相关的组合物和其使用方法。

背景技术：

精氨酸耗竭疗法可以有效治疗某些形式的癌症和其它疾病。例如，精氨酸脱亚胺酶可以用于通过将精氨酸转化为瓜氨酸和氨来耗尽精氨酸的血流供应。adi-peg20是示例性adi-peg，目前临床上正在研究所述adi-peg以用于缺乏在将瓜氨酸转化为精氨酸中所涉及的关键酶精氨基琥珀酸合成酶-1(ass1)的肿瘤。adi-peg20具有良好的耐受性并且在临床研究中显示出前景(参见例如，qiu等人，《癌症快报(cancerlett.)》，2015年8月1日；364(1):1-7；phillips等人，《癌症研究和治疗(cancerrestreat.)》，2013年12月；45(4):251-62；feun等人，《当前药物设计(currpharmdes.)》，2008；14(11):1049-57；feun和savaraj，《调研药物专家评论(expertopininvestigdrugs.)》，2006年7月；15(7):815-22；feun等人，《临床营养和代谢护理的最新观点(curropinclinnutrmetabcare.)》，2015年1月；18(1):78-82)。

通过合适的配体激活肿瘤坏死因子(tnf)受体超家族的细胞表面死亡受体代表一种有吸引力的通过癌细胞中的细胞凋亡诱导细胞死亡的治疗策略(参见例如，palacios等人，《当前药物设计》，2014；20(17):2819-33)。作为一个实例，tnf相关的凋亡诱导配体(trail，也称为apo2l)具有在癌细胞中选择性诱导凋亡的能力，并且已在许多临床前研究中证明了强大的抗癌活性。

然而，仍然需要优化这些药剂和其它药剂的药代动力学和/或生物活性。本公开提供了这些益处和其它益处。

技术实现要素：

本公开的实施例包含缀合物，其包括共价连接到肿瘤坏死因子(tnf)超家族配体的精氨酸脱亚胺酶(adi)。

在一些实施例中，所述adi包括与选自表a1的序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成或基本上由所述氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述adi是六聚体adi多肽，例如，同源六聚体多肽。一些实施例中，所述六聚体或同源六聚体adi包括与seqidno:9、37、38、50或57-68至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成或基本上由所述氨基酸序列组成。

在一些实施例中，所述tnf超家族配体选自表t1。在一些实施例中，所述超家族配体选自tnf相关的凋亡诱导配体(trail)、tnf-α和fasl。在一些实施例中，所述tnf超家族配体包括与选自表t2的序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成或基本上由所述氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述tnf超家族配体是三聚体或同源三聚体多肽。

在一些实施例中，所述adi和所述tnf超家族配体通过连接子，任选地生理稳定的连接子分开。在一些实施例中，所述连接子为肽连接子，任选地为柔性肽连接子或刚性肽连接子。在一些实施例中，所述肽连接子的长度为约1-100个氨基酸、约1-90个氨基酸、约1-80个氨基酸、约1-70个氨基酸、约1-80个氨基酸、约1-50个氨基酸、约1-40个氨基酸、约1-30个氨基酸、约1-20个氨基酸、约1-10个氨基酸或约1-5个氨基酸，或长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100个氨基酸。在一些实施例中，所述肽连接子选自表l1。

在一些实施例中，所述缀合物是融合多肽。在一些实施例中，所述adi融合到tnf超家族配体的n端，任选地通过连接子分开。在一些实施例中，所述adi融合到tnf超家族配体的c端，并任选地通过连接子分开。

在一些实施例中，所述连接子是非肽连接子。

在一些实施例中，所述缀合物相对于单独的所述adi和/或单独的所述tnf超家族配体具有改善的药代动力学、物理和/或生物学性质，任选地选自增加的稳定性、增加的血清半衰期、提高的生物利用度、增加的生物活性、增加的暴露度和降低的清除率中的一种或多种。

在一些实施例中，述缀合物相对于单独的所述adi和/或单独的所述tnf超家族配体具有增加的稳定性和/或血清半衰期，任选地其中与所述缀合物相关的所述稳定性和/或血清半衰期相对于单独的所述adi和/或单独的所述tnf超家族配体增加了约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％或更多。

在一些实施例中，所述缀合物相对于单独的所述adi和/或单独的所述tnf超家族配体具有增加的生物活性，任选地其中所述缀合物的生物活性相对于单独的所述adi和/或单独的所述tnf超家族配体增加了约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％或更多，或任选地其中所述生物活性相对于单独的所述adi和/或单独的所述tnf超家族配体协同增加。在一些实施例中，所述生物活性是在癌细胞中诱导细胞死亡或凋亡，所述诱导相对于单独的adi和/或单独的tnf超家族配体任选地协同增加。

在一些实施例中，所述癌细胞是adi敏感的细胞，其任选地选自乳腺癌细胞、肝细胞癌细胞、伯基特淋巴瘤细胞、结肠癌细胞、胶质母细胞瘤癌细胞、白血病细胞、黑色素瘤癌细胞、非小细胞肺癌(nsclc)细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞和肾癌细胞中的一种或多种。

在一些实施例中，所述癌细胞是adi不敏感的细胞，其任选地选自乳腺癌细胞、结肠癌细胞和nsclc细胞中的一种或多种。

在一些实施例中，相对于单独的所述tnf超家族配体，所述adi任选地使所述tnf超家族配体诱导癌细胞中细胞死亡或凋亡的能力增加约至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％。

在一些实施例中，所述adi上调所述癌细胞上死亡受体5(dr5)的表达。

在一些实施例中，所述adi多肽通过连接基团共价键合到至少一个聚乙二醇(peg)分子，任选地其中所述tnf超家族配体不共价键合到peg分子。

还包含缀合物，其包括(a)共价连接到三聚体多肽的六聚体多肽，或(b)共价连接到第二三聚体多肽的第一三聚体多肽，所述第二三聚体多肽与所述第一三聚体多肽不同。

在一些实施例中，所述六聚体多肽是同源六聚体多肽。在一些实施例中，所述六聚体多肽选自精氨酸脱亚胺酶，任选地如本文所述的以及脂联素或其胶原样结构域。

在一些实施例中，所述三聚体多肽是同源三聚体多肽。

在一些实施例中，(b)的所述第一三聚体多肽选自脂联素或其胶原样结构域、t4次要纤维蛋白或其三聚结构域(折叠)、胶原的c-前肽、表面活性剂蛋白a(sp-a)和甘露糖结合蛋白a(mbp-a)。

在一些实施例中，(a)的所述三聚体多肽或(b)的所述第二三聚体多肽选自肿瘤坏死因子(tnf)超家族配体，任选地如本文所述的。在一些实施例中，对于(a)，六聚体多肽共价连接到三聚体多肽的n端，或者对于(b)，第一三聚体多肽共价连接到第二三聚体多肽的n端。在一些实施例中，对于(a)，六聚体多肽共价连接到三聚体多肽的c端，或者其中对于(b)，第一三聚体多肽共价连接到第二三聚体多肽的c端。在一些实施例中，对于(a)，六聚体多肽和三聚体多肽通过连接子分开，或者对于(b)，第一和第二三聚体多肽通过连接子分开，其中所述连接子任选地为生理稳定的连接子。

在一些实施例中，所述缀合物是融合多肽。

在一些实施例中，所述缀合物相对于单独的所述六聚体和/或三聚体多肽物理具有改善的药代动力学和/或生物学性质。在一些实施例中，对于(a)，与所述六聚体多肽缀合使所述三聚体多肽的稳定性和/或血清半衰期相对于单独的所述三聚体多肽任选地增加约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％或更多，或者对于(b)，与所述第一三聚体多肽缀合使所述第二三聚体多肽的稳定性和/或血清半衰期相对于单独的所述第二三聚体多肽任选地增加约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％或更多。

某些实施例涉及编码本文所述缀合物的分离的多核苷酸，其中所述缀合物是融合蛋白。还包含包括分离的多核苷酸的表达载体和包括分离的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。

还包含治疗组合物，其包括本文所述的缀合物和药学上可接受的载剂或赋形剂。在特定实施例中，缀合物形成六个adi-trail和/或trail-adi缀合物(任选地呈融合蛋白形式)的六聚体复合物(参见例如，图4)。在一些实施例中，缀合物或组合物的纯度为至少约95％且聚集度小于约5％，并且基本上不含内毒素。

还包括在有需要的受试者中治疗癌症、改善癌症症状或减少癌症进展的方法，包括对受试者施用本文所述的缀合物或治疗组合物。

在一些实施例中，癌症选自以下中的一个或多个：肝细胞癌(hcc)、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、间皮瘤、淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、淋巴瘤、肝癌、肉瘤、白血病、急性髓性白血病、复发性急性髓性白血病、b细胞恶性肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、胃癌、胶质瘤(例如，星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤或脉络丛乳头状瘤)、多形性胶质母细胞瘤(例如，巨细胞胶质母细胞瘤或胶质肉瘤)、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原发性cns淋巴瘤、原始神经外胚层肿瘤(成神经管细胞瘤)、非小细胞肺癌(nsclc)、肾癌、膀胱癌、子宫癌、食道癌、脑癌、头颈癌、宫颈癌、睾丸癌和胃癌。

附图说明

图1a-1d示出了与单独的每种药剂相比adi-peg20和rhtrail对各种癌细胞系的相对活力的协同作用。

图2a-2c表明了与rajiburkitt淋巴瘤细胞系中单独的每种药剂相比，adi-peg20和rhtrail对半胱天冬酶3/7活化(图2a)、细胞死亡诱导(图2b)以及未致力于细胞凋亡的活细胞百分比降低(半胱天冬酶3/7未活化的细胞；图2c)的协同作用。

图3a-3d示出了用adi-peg20处理后各种癌细胞系中trail受体dr5的上调表达。

图4表明了adi敏感细胞系用adi-peg20处理后存活蛋白水平降低。存活蛋白已被证明能阻止trail的活性。因此，降低存活蛋白水平(连同dr5上调)可能有助于adi增强和/或增加癌细胞系中trail的凋亡活性的能力。

图5示出了由六个adi-trail和/或trail-adi缀合物，例如融合蛋白构成的六聚体复合物。

图6a-6c示出了相对于单独的rhtrail、单独的m.col.adi和作为单独多肽的rhtrail和m.col.adi的组合，示例性m.col.adi-trail融合多肽与l1连接子(见表e3)对抗adi的colo205癌细胞系中半胱天冬酶3/7诱导(图6a)和相对细胞活力(图6b和6c)的作用。

图7a-7c示出了相对于单独的rhtrail、单独的m.col.adi以及作为单独多肽的rhtrail和m.col.adi的组合，示例性m.col.adi-trail融合多肽与l1连接子(见表e3)对adi敏感的hct116肿瘤细胞系中半胱天冬酶3/7诱导(图7a)和相对细胞活力(图7b和7c)的作用。

图8a-8b示出了相对于单独的rhtrail、单独的m.col.adi和作为单独多肽的rhtrail和m.col.adi的组合，示例性m.col.adi-trail融合多肽与l1连接子(见表e3)对adi敏感的jurkat肿瘤细胞系中半胱天冬酶3/7诱导(图8a)和相对细胞活力(图8b)的作用。

图9a-9d示出了来自表e1的示例性adi-trail融合多肽对抗adi的colo205癌细胞系中半胱天冬酶3/7诱导(图9a和9b)和相对细胞活力(图9c和9d)的作用。

图10a-10c示出了示例性adi-trail融合多肽对adi敏感的hct116细胞系中半胱天冬酶3/7诱导(图10a)和相对细胞活力(图10b-10c)的作用。

图11a-11b示出了示例性adi-trail融合多肽对adi敏感的jurkat细胞系中半胱天冬酶3/7诱导(图11a)和相对细胞活力(图11b)的作用。

图12a-12c示出了在m.col.adi(k192c或k287c)中具有点突变的示例性m.col.adi-trail融合多肽(包含非聚乙二醇化的和用2k或20kpeg聚乙二醇化的m.col.adi-trail融合多肽)对抗adi的colo205细胞系中半胱天冬酶3/7诱导(图12a)和相对细胞活力(图12b-12c)的作用。

图13a-13c示出了在m.col.adi(k192c或k287c)中具有点突变的示例性m.col.adi-trail融合多肽(包含非聚乙二醇化的和用2k或20kpeg聚乙二醇化的m.col.adi-trail融合多肽)对adi敏感的hct116细胞系中半胱天冬酶3/7诱导(图13a)和相对细胞活力(图13b-13c)的作用。

图14a-14c示出了示例性trail-m.col.adi与m.col.adi-trail融合多肽对抗adi的colo205细胞系中半胱天冬酶3/7诱导(图14a)和相对细胞活力(图14b-14c)的作用。

图15a-15c示出了示例性trail-m.col.adi与m.col.adi-trail融合多肽对adi敏感的hct116细胞系中半胱天冬酶3/7诱导(图15a)和相对细胞活力(图15b-15c)的作用。

图16a-16b显示了静脉施用单剂量30mg/kg后，m.col.adi-trail在cd-1小鼠血清中随时间的药代动力学(pk)。在单次注射融合蛋白后，在cd-1小鼠的血清中测量m.col.adi-trail蛋白水平(图16a-16b)、精氨酸和瓜氨酸水平(图16a)以及针对融合蛋白m.col.adi-trail、m.col.adi和rhtrail(通过elisa评估，图16b)的抗体滴度。

图17a-17f表明了m.col.adi-trail在hct116异种移植模型中的功效。融合蛋白未引起任何明显的体重减轻(图17a)和肿瘤生长减少(图17b-17f)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。通过双向anova评估了与媒剂处理对照组相比融合蛋白处理组中肿瘤减少的统计显著性。

图18a-18d示出血清adi-trail与肿瘤体积呈负相关(图18b-18c)。通过elisa(总蛋白)和生物测定(活性蛋白)测量的融合蛋白浓度彼此相似。在肿瘤植入后的第21天和第28天，从荷瘤小鼠中提取血清。图17a-17f中示出了处理计划和肿瘤生长。

图18d中示出了这些血清样品中的精氨酸和瓜氨酸水平。

图19表明了用m.col.adi-trail处理后hct116异种移植模型中的剂量依赖性肿瘤生长减少。

具体实施方式

定义

除非另外定义，否则本文所使用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。尽管与本文所描述的那些类似或等同的任何方法、材料、组合物、试剂、细胞可以用于实践或测试本公开的主题，但描述了优选的方法和材料。本说明书中引用的所有出版物和参考文献，包含但不限于专利和专利申请，均通过引用以其全文并入本文，如同每个单独的出版物或参考文献都具体并单独地表明为如完全阐述地通过引用并入本文。本申请要求优先权的任何专利申请也以上文对于出版物和参考文献描述的方式通过引用以其全文并入本文。

除非特别相反地指出，否则本公开的实践将采用本领域范围内的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组dna技术的常规方法，其中许多方法在下文中出于说明的目的而描述。此类技术在文献中得到充分解释。参见例如，《最新蛋白质科学实验指南、最新分子生物学实验指南或最新免疫学实验指南(currentprotocolsinproteinscience,currentprotocolsinmolecularbiologyorcurrentprotocolsinimmunology)》，johnwiley和sons，纽约(n.y.)，(2009)；ausubel等人，《精编分子生物学实验指南(shortprotocolsinmolecularbiology)》，第3版，wiley和sons，1995；sambrook和russell，《分子克隆：实验手册(molecularcloning:alaboratorymanual)》(第3版，2001)；maniatis等人，《分子克隆：实验手册》(1982)；《dna克隆：一种实用方法(dnacloning:apracticalapproach)》，第i和ii卷(d.glover编辑)；《寡核苷酸合成(oligonucleotidesynthesis)》(n.gait编辑，1984)；《核酸杂交(nucleicacidhybridization)》(b.hames和s.higgins编辑，1985)；《转录和转译(transcriptionandtranslation)》(b.hames和s.higgins编辑，1984)；《动物细胞培养(animalcellculture)》(r.freshney编辑，1986)；perbal，《分子克隆实用指南(apracticalguidetomolecularcloning)》(1984)以及其它相似参考文献。

标准技术可以用于重组dna、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书进行，或者如本领域通常实现的或如本文所述的进行。这些和相关的技术和程序通常可以根据本领域熟知的常规方法进行，并且如在本说明书通篇引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所描述的。除非提供具体的定义，否则与本文所述的分子生物学、分析化学、合成有机化学以及药物和药物化学结合使用的命名和实验室程序和技术是本领域公知和常用的那些。标准技术可以用于重组技术、分子生物学、微生物学、化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。

出于本公开的目的，以下术语定义如下。

本文使用冠词“一个(a)”和“一种(an)”来指一个或多于一个(即，至少一个)所述冠词的语法宾语。通过举例，“元件”意指一个元件或多于一个元件。

“约”是指量、水平、数值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、总量、重量或长度相对于参考量、水平、数值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、总量、重量或长度变化多达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

“拮抗剂”是指干扰或以其它方式降低另一种药剂或分子的生理作用的生物结构或化学药剂。在一些情况下，拮抗剂特异性结合其它药剂或分子。包括全部和部分拮抗剂。

“激动剂”是指增加或增强另一种药剂或分子的生理作用的生物结构或化学药剂。在一些情况下，激动剂特异性结合其它药剂或分子。包括全部和部分激动剂。

如本文所使用的，术语“氨基酸”旨在表示天然存在的和非天然存在的氨基酸以及氨基酸类似物和模拟物。例如，天然存在的氨基酸包含在蛋白质生物合成期间使用的20(l)-氨基酸以及其它如4-羟基脯氨酸、羟赖氨酸、锁链素、异锁链素、同型半胱氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸。非天然存在的氨基酸包含本领域技术人员已知的例如(d)-氨基酸、正亮氨酸、正缬氨酸、对氟苯丙氨酸、乙硫氨酸等。氨基酸类似物包含天然和非天然存在的氨基酸的修饰形式。此类修饰可以包含例如氨基酸上的化学基团和部分的取代或置换，或通过氨基酸的衍生化。氨基酸模拟物包含例如有机结构，其表现出功能相似的性质，如参考氨基酸的电荷和电荷间隔特征。例如，模拟精氨酸(arg或r)的有机结构将具有位于相似分子空间中且具有与天然存在的arg氨基酸的侧链的e-氨基相同的迁移度的正电荷部分。模拟物还包含受约束的结构，以便维持氨基酸或氨基酸官能团的最佳间隔和电荷相互作用。本领域技术人员已知或可以确定哪些结构构成功能等同的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。

“生物相容的”是指通常对生物功能无害并且不会导致包含过敏原和疾病状态在内的任何程度的不可接受毒性的材料或化合物。

“编码序列”是指有助于基因的多肽产物的编码的任何核酸序列。相反，术语“非编码序列”是指不直接有助于基因的多肽产物的编码的任何核酸序列。

贯穿本公开内容，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”、“包括了(comprises)”和“包括着(comprising)”将被理解为暗示包括所陈述的步骤或要素或一组步骤或要素但不排除任何其它步骤或要素或一组步骤或要素。

“由……组成”意味着包含并限于短语“由……组成”之后的任何内容。因此，短语“由……组成”指示所列出的要素是必需的或强制性的并且可以不存在其它要素。“基本上由……组成”意指包含所述短语之后所列出的任何要素，并且限于不干扰或促进本公开中针对所列要素指定的活动或行为的其它要素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列要素是必需的或强制性的，但是其它要素是任选的并且可以存在或不存在，这取决于其是否实质上影响所列要素的活性或作用。

如本文所述，术语“缀合物”是指由至少两种单独的多肽(例如，第一多肽和第二多肽)共价或非共价附接或连接而形成的实体。缀合多肽的一个实例是“融合蛋白”或“融合多肽”，即通过连接两个或更多个编码序列而产生的多肽，所述编码序列最初编码单独的多肽；结合的编码序列的翻译产生单一的融合多肽，其通常具有衍生自每个单独的多肽的功能性质。

术语“不含内毒素”或“基本上不含内毒素”通常涉及至多含有痕量(例如，对受试者没有临床不利生理作用的量)内毒素以及优选地无法检测到的量的内毒素的组合物、溶剂和/或血管。内毒素是与某些微生物，如细菌(典型地革兰氏阴性细菌)相关的毒素，尽管可能在如单核细胞增生李斯特菌等革兰氏阳性细菌中发现内毒素。最普遍的内毒素是在各种革兰氏阴性细菌的外膜中发现的并且表示这些细菌在引起疾病的能力方面的中心致病特征的脂多糖(lps)或脂低聚糖(los)。人体中的少量内毒素可能产生发热、血压降低、炎症和凝血激活以及其它不良生理影响。

因此，在药物生产中，常常期望从药物产品和/或药物容器中除去大部分或全部痕量的内毒素，因为即使少量也可能对人类产生不良影响。除热原烘箱可以用于此目的，因为通常需要超过300℃的温度来分解大多数内毒素。例如，基于如注射器或小瓶等初级包装材料，250℃的玻璃温度和30分钟的保持时间的组合常常足以实现内毒素水平的3log减少。设想了除去内毒素的其它方法，例如如本文所描述的和本领域中已知的色谱法和过滤法。

可以使用本领域已知的常规技术检测内毒素。例如，利用来自马蹄蟹的血液的鲎变形细胞溶解物测定法是用于检测内毒素存在的非常灵敏的测定法。在这个测试中，非常低水平的lps就可以引起鲎裂解物的可检测到的凝血，这是由于强大的酶级联放大了这一反应。内毒素也可以通过酶联免疫吸附测定(elisa)进行定量。为基本上不含内毒素，内毒素水平可以低于活性化合物的约0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.09、0.1、0.5、1.0、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10eu/mg。通常，1ng脂多糖(lps)对应于约1-10eu。

缀合物或多肽的“半衰期”可以指缀合物或多肽相对于在施用于生物体的血清或组织时的此类活性、或相对于任何其它限定的时间点丧失其药理学、生理学或其它活性的一半所花费的时间。“半衰期”也可以指缀合物或多肽的量或浓度相对于施用于生物体血清或组织时的量或浓度，或相对于任何其它限定的时间点，减少施用于生物体血清或组织中的起始量的一半所花费的时间。可以在血清和/或任何一种或多种所选组织中测量半衰期。

术语“调节”和“改变”包含“增加”、“增强”或“刺激”，以及“降低”或“减少”，通常相对于对照具有统计学显著或生理学显著的量或程度。“增加的”、“刺激的”或“增强的”量通常是“统计上显著的”量，并且可以包含1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500、1000倍)(包含所有整数和其间的范围，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)的由非组合物(例如，无药剂)或对照组合物产生的量的增加。“降低”或“减少”量通常是“统计上显著”的量，并且可以包含1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(包含所有整数和其间的范围)的非组合物(例如，无药剂)或对照组合物产生的量的减少。本文描述了比较和“统计学显著”量的实例。

术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”可互换使用，并且意指不限于任何特定长度的氨基酸的聚合物。术语“酶”包含多肽或蛋白质催化剂，并且就adi而言，其可与蛋白质、多肽或肽互换使用。所述术语包含如豆蔻酰化、硫酸化、糖基化、磷酸化和信号序列的添加或缺失等修饰。术语“多肽”或“蛋白质”意指一个或多个氨基酸链，其中每个链包括通过肽键共价连接的氨基酸，并且其中所述多肽或蛋白质可以包括多个通过肽键非共价和/或共价连接且具有天然蛋白质序列的链，即，由天然存在的以及特别是非重组细胞、或基因工程或重组细胞产生的蛋白质，并且包括具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子、或具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。术语“多肽”和“蛋白质”具体地包括本文所述的adi酶/蛋白质，或具有adi蛋白质的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。在某些实施例中，多肽是由重组细胞产生的“重组”多肽，所述重组细胞包括一个或多个重组dna分子，所述重组dna分子通常由在细胞中无法以其它方式找到的异源多核苷酸序列或多核苷酸序列的组合制成。

本文提及的术语“分离的”多肽或蛋白质是指受试蛋白质：(1)不含至少一些其它蛋白质，通常将使用所述至少一些其它蛋白质在自然界中发现所述受试蛋白质；(2)基本上不含来自相同来源，例如，来自相同物种的其它蛋白质；(3)由来自不同物种的细胞表达；(4)已与至少约50％的多核苷酸、脂质、碳水化合物或与其天然缔合的其它物质分离；(5)不和与“分离的蛋白质”天然缔合的蛋白质部分缔合(通过共价或非共价相互作用)；(6)和不与其天然缔合的多肽可操作地缔合(通过共价或非共价相互作用)；或(7)在自然界中不存在。这种分离的蛋白质可以由基因组dna、cdna、mrna或其它rna编码，或者可以具有合成来源，或其任何组合。在某些实施例中，分离的蛋白质基本上不含在其天然环境中会发现的且会干扰其使用(治疗、诊断、预防、研究或其它)的蛋白质或多肽或其它污染物。

在某些实施例中，组合物中任何给定药剂(例如，缀合物)的“纯度”可以被具体定义。例如，某些组合物可以包括纯度至少为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(包含所有小数和其间的范围)的缀合物，例如且绝不限制，通过高效液相色谱法(hplc)测量的，高效液相色谱法是在生物化学和分析化学中常用的用来分离、鉴定和定量化合物的公知形式柱色谱法。在一些情况下，组合物的纯度以聚集度为特征。例如，缀合物(例如，融合蛋白)的聚集度可以通过尺寸排阻色谱(sec)来确定，所述尺寸排阻色谱根据尺寸来分离颗粒。所述sec是用于确定纯化蛋白质的三级结构和四级结构的普遍接受的方法。sec主要用于分析大分子，如蛋白质或聚合物。sec是通过将这些较小的分子捕获在颗粒的孔中来工作的。较大的分子只是通过孔，因为它们太大而不能进入孔。因此，较大分子比较小分子更快地流过柱，即分子越小，保留时间越长。某些组合物也基本上不含聚集物(大于约95％，通过sechplc呈现为单峰)。某些实施例不含具有大于约96％、约97％、约98％或约99％的聚集物，通过sechplc呈现为单峰。

术语“参考序列”通常是指与另一序列正在进行比较的核酸编码序列或氨基酸序列。本文所述的所有多肽和多核苷酸序列都作为参考序列而包含，包含通过名称描述的参考序列和在表和序列表中描述的参考序列。

如本文所使用的术语“序列一致性”或例如，包括“与之50％一致的序列”是指在比较窗口内，在逐核苷酸的基础上或在逐氨基酸的基础上序列一致的程度。因此，“序列一致性百分比”可以通过以下方式计算：在所述比较窗口内比较两个经最佳比对的序列，测定在这两个序列中出现一致的核酸碱基(例如，a、t、c、g、i)或一致的氨基酸残基(例如，ala、pro、ser、thr、gly、val、leu、ile、phe、tyr、trp、lys、arg、his、asp、glu、asn、gln、cys以及met)的位置的数目，从而得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以所述比较窗口中的位置的总数目(即，窗口大小)，并且将所述结果乘以100，得到序列一致性百分比。用于比对比较窗口的序列的最佳比对可以通过算法(美国威斯康星州麦迪逊科学大道575号遗传学电脑集团的威斯康星州遗传学软件包7.0版本中的gap、bestfit、fasta和tfasta)的计算机化实施方式，或者通过检验各种所选方法中的任何方法产生的最佳比对(即，导致比较窗口内的最高百分比同源性)而进行。还可以参考例如由altschul等人，《核酸研究(nuclacidsres.)》25:3389,1997所公开的blast程序家族。

术语“溶解度”是指本文所述药剂(例如，缀合物)溶解在液体溶剂中并形成均匀溶液的性质。溶解度通常表示为浓度，是每单位体积溶剂的溶质质量(每千克溶剂的溶质克数、g/dl(100ml)、mg/ml等)、摩尔浓度、质量摩尔浓度、摩尔分数或其它类似的浓度描述。可溶解每种单位量溶剂的溶质的最大均衡量是所述溶质在包括温度、压力、ph和溶剂的性质的特定条件下在所述溶剂中的溶解度。在某些实施例中，在生理ph或其它ph，例如，ph5.0、ph6.0、ph7.0、ph7.4、ph7.6、ph7.8、或ph8.0(例如，约ph5-8)下测量溶解度。在某些实施例中，在水或如pbs或nacl(有或无nap)的生理缓冲液中测量溶解度。在具体实施例中，在相对较低的ph(例如，ph6.0)和相对较高的盐(例如，500mm的nacl和10mm的nap)下测量溶解度。在某些实施例中，在如血液或血清的生物流体(溶剂)中测量溶解度。在某些实施例中，温度可以约为室温(例如，约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃)或约为体温(37℃)。在某些实施例中，药剂在室温或37℃下具有至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100mg/ml的溶解度。

“受试者”或“有需要的受试者”或“患者”或“有需要的患者”包含哺乳动物受试者如受试的人。

“基本上”或“实质上”意指几乎完全或完全，例如，一些给定量的95％、96％、97％、98％、99％或更高。

“统计上显著”意味着结果不太可能偶然发生。统计显著性可以通过本领域已知的任何方法来确定。常用的显著性度量包含p值，如果零假设为真，则p值是发现事件发生的频率或概率。如果获得的p值小于显著性水平，则零假设被否定。在简单的情况下，显著性水平限定在0.05或更小的p值。

“治疗反应”是指基于一种或多种治疗剂(例如，缀合物)的施用改善症状(无论是否持续)。

如本文所使用的，受试者(例如哺乳动物，如人)或细胞的“治疗”是用于试图改变个体或细胞的自然进程的任何类型的干预。治疗包含但不限于施用药物组合物，并且可以预防性地或在病理事件开始后或与病原体接触后进行。还包含“预防性”治疗，其可以针对于降低所治疗的疾病或病症的进展速率、延迟所述疾病或病症的发作、或降低其发病的严重程度。“治疗”或“预防”不一定表示完全根除、治愈或预防疾病或病症或其相关症状。

术语“野生型”是指在群体中最常观察到的基因或基因产物(例如，多肽)，并且因此被任意地称为基因的“正常”或“野生型”形式。

除非另外明确地说明，否则本说明书中的每个实施例在进行必要的修改后适用于所有其它实施例。

缀合物

本公开的实施例部分涉及以下意外发现：精氨酸脱亚胺酶(adi)与肿瘤坏死因子(tnf)超家族配体(例如，trail)的缀合(例如，融合)相对于单独的一种或两种组分改善了缀合物的药代动力学和/或生物活性，并且在许多情况下协同作用亦如此。还涉及以下发现：六聚体或同源六聚体多肽与三聚体或同源三聚体多肽的缀合相对于单独的一种或两种组分改善了缀合物的药代动力学和/或生物活性。还涉及以下发现：第一三聚体多肽与第二三聚体多肽(与第一三聚体多肽不同)的缀合相对于单独的一种或两种组分改善了缀合物的药代动力学和/或生物活性。在一些情况下，缀合物的每种组分增强(例如，协同增强)其它组分的药代动力学和/或生物活性。

因此，某些实施例涉及缀合物，其包括与tnf超家族配体(例如，trail)共价连接的精氨酸脱亚胺酶adi，其中每一个tnf超家族配体在本文作了更为详细的描述。在一些实施例中，adi缀合到tnf超家族配体的n端。在一些实施例中，adi缀合到tnf超家族配体的c端。

还包含缀合物，其包括(a)共价连接到三聚体多肽的六聚体多肽，或(b)共价连接到第二三聚体多肽的第一三聚体多肽，所述第二三聚体多肽与所述第一三聚体多肽不同。在一些情况下，六聚体多肽是同源六聚体多肽。(a)的六聚体或同源六聚体多肽的实例包含例如某些adi，如来自鸽支原体、惰性支原体、鸡支原体和火鸡支原体的天然adi(例如，分别为seqidno:9、37、38、50)，来自表a1的嵌合adi(例如，seqidno:57-68)，以及脂联素或其胶原样结构域，这些在本文作了更为详细的描述。脂联素是244个氨基酸的蛋白质，其由氨基末端信号肽、n端处胶原样结构域和c端处球状结构域构成。脂联素自缔合成更大的结构，例如，脂联素分子通过胶原样结构域结合在一起形成同源三聚体，并且在一些情况下三聚体继续自缔合并形成六聚体。

在一些情况下，三聚体多肽是同源三聚体多肽。(b)的第一三聚体或同源三聚体多肽的实例包含脂联素或其胶原样结构域、t4次要纤维蛋白或其三聚结构域(折叠)、前胶原的c-前肽、表面活性蛋白a(sp-a)和甘露糖结合蛋白a(mbp-a)。如上所述，在一些情况下，脂联素或其胶原样结构域自缔合成三聚体。噬菌体t4次要纤维蛋白是三链、平行、分段的α螺旋卷曲蛋白。t4次要纤维蛋白的c端球状结构域(折叠)对于正确的三聚化和蛋白质折叠是必不可少的，然而在没有次要纤维蛋白的卷曲螺旋部分的情况下，折叠能够三聚化(参见letarov等人，《生物化学(莫斯科)(biochemistry(mosc)》，64(7):817-23,1999)。纤维状前胶原的c-前肽通过控制前胶原分子的细胞内组装和胶原纤维的细胞外组装，在组织生长和修复中起关键作用，并且负责在各种前胶原之间选择性形成同源三聚体和某些异源三聚体(参见，例如，bourhis等人，《自然结构和分子生物学(natstructmolbiol.)》19(10):1031-1036,2012)。表面活性蛋白a(sp-a)是与肺表面活性剂相关的四种蛋白质之一，其与肺泡磷脂膜以高亲和力结合，将蛋白质定位在抵抗吸入性病原体的第一道防线上。sp-a既表现出钙依赖性碳水化合物结合(胶原凝集素家族的特性)，又表现出与脂膜组分的特异性相互作用。sp-a的碳水化合物识别结构域(crd)与颈部结构域形成三聚体结构(参见例如，《生物化学杂志(j.biol.chem.)》278(44):43254-60,2003)。甘露糖结合蛋白(mbp)是血清中发现的c型(ca(2+)-依赖性)动物凝集素。这些mbp识别病原菌和真菌特有的细胞表面寡糖结构，并触发这些生物体的中和。mbp的碳水化合物识别结构域(crd)和将羧基末端crd与完整分子的胶原样部分连接的颈部结构域形成三聚体结构(参见例如，weis和drickamer，《结构(structure.)》2(12):1227-40,1994)。因此，任何前述三聚体多肽或其三聚体片段/结构域可用作(b)的第一三聚体多肽。

在一些实施例中，(a)的三聚体或同源三聚体多肽，或(b)的第二三聚体或同源三聚体多肽是tnf超家族配体或受体，其在本文作了更为详细的描述。

在一些实施例中，对于(a)，六聚体多肽共价连接到三聚体多肽的n端，或者对于(b)，第一三聚体多肽共价连接到第二三聚体多肽的n端。在一些实施例中，对于(a)，六聚体多肽共价连接到三聚体多肽的c端，或者对于(b)，第一三聚体多肽共价连接到第二三聚体多肽的c端。

在一些情况下，缀合物是融合蛋白，例如，缀合物的两个组分之间的共价键完全由肽键构成。在一些情况下，缀合物是非融合蛋白，例如，其中缀合物组分之间的共价键包括至少一个非肽键，或者其中共价键在缀合物的每个多肽已经单独产生(例如，重组产生)并任选地纯化后发生化学反应。

在一些实施例中，缀合物包括缀合物的每个组分之间的连接子(例如，生理稳定的连接子)。连接子的一般实例包含肽连接子(例如，柔性连接子和刚性连接子)和非肽连接子。本文对示例性连接子作了更为详细地描述。

在一些情况下，如上所述，缀合物的至少一种组分改善了缀合物的另一种组分的一种或多种性质，并且在一些情况下，缀合物协同作用亦如此。在一些情况下，每种组分改善了缀合物的另一种组分的一种或多种性质。在一些情况下，相对于单独的一种或两种组分，缀合物具有一种或多种改进的性质。示例性性质包含物理和/或药代动力学性质，如蛋白质稳定性、溶解度、血清半衰期、生物利用度、暴露度和清除率。还包含生物性质或活性。

在一些情况下，相对于单独的一种或两种组分，缀合物的生物活性增加。在一些情况下，相对于单独的每种组分，缀合物对生物活性具有“加和”效应。“加和性”是指增加的缀合物活性，其约等于单独的每种组分组合的加和活性。在一些情况下，相对于单独的每种组分，缀合物对生物活性具有“协同”作用。“协同作用”或“协合作用”是指增加的缀合物活性，其大于单独的每种组分的组合的加和活性。在一些情况下，缀合物的一种组分“增强”另一种组分的生物活性(例如，在一些情况下，adi增强trail的活性)。“增强”是指在只有一种组分单独是活性的或显著活性的情况下缀合物活性增加。在一些情况下，缀合物的组分之间存在“相互作用(coalism)”，其是指在两种组分本身都不具有活性的情况下的缀合物活性。

在具体实施例中，缀合物包括共价连接到tnf超家族成员配体(例如，trail、tnf-α、fasl)的adi，并且相对于单独的adi和/或单独的tnf超家族配体，缀合物具有改善的药代动力学、物理和/或生物学性质。如上所述，示例性药代动力学和物理性质包含增加的稳定性、增加的血清半衰期、增加的生物利用度、增加的暴露度和降低的清除率。在一些情况下，相对于单独的adi和/或单独的tnf超家族配体，缀合物具有增加的稳定性和/或血清半衰期。在一些情况下，相对于单独的adi和/或单独的tnf超家族配体，缀合物的稳定性和/或血清半衰期增加了约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％或更多。

在一些情况下，相对于单独的adi和/或单独的tnf超家族配体，缀合物具有增加的生物活性。在一些情况下，相对于单独的adi和/或单独的tnf超家族配体，缀合物的生物活性增加了约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％或更多。在一些情况下，相对于单独的adi和/或单独的tnf超家族配体，生物活性的增加是协同增加。在一些情况下，相对于单独的adi和/或单独的tnf超家族配体，生物活性的增加是加和增加。在特定实施例中，生物活性是诱导癌细胞中的细胞死亡或凋亡和/或上调tnf超家族受体表达(例如，死亡受体5(dr5))。在特定情况下，相对于单独的tnf超家族配体，缀合物的adi组分使tnf超家族配体诱导癌细胞中细胞死亡或凋亡的能力增加了约至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％(例如，通过上调癌细胞上dr5的表达)。

在特定情况下，相对于单独的adi和/或单独的tnf超家族配体，缀合物增加了(例如，增加了约至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％或更多)或协同增加了肿瘤细胞杀伤活性和/或凋亡诱导活性。在一些情况下，癌细胞是adi敏感的癌细胞，或表达低水平或检测不到水平的精氨酸琥珀酸合成酶-1(ass1)的癌细胞。在特定情况下，癌细胞(例如，adi敏感癌细胞)选自乳腺癌细胞、肝细胞癌细胞、伯基特淋巴瘤细胞、结肠癌细胞、胶质母细胞瘤癌细胞、白血病细胞、黑色素瘤癌细胞、非小细胞肺癌(nsclc)细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞和肾癌细胞中的一种或多种。在一些情况下，癌细胞是adi不敏感或抗adi癌细胞，或表达相对高水平ass1的癌细胞。在特定情况下，癌细胞(例如，adi不敏感的癌细胞)选自乳腺癌细胞、结肠癌细胞和nsclc细胞中的一种或多种。

在一些实施例中，缀合物包含共价连接到三聚体(例如，同源三聚体)多肽的六聚体(例如，同源六聚体)多肽，并且在一些情况下，相对于单独的三聚体多肽，与六聚体多肽的缀合改善了三聚体多肽的物理、药代动力学和/或生物学性质，和/或反之亦然。在一些实施例中，缀合物包括共价连接到第二三聚体(例如，同源三聚体)多肽的第一三聚体(例如，同源三聚体)多肽，并且在一些情况下，相对于单独的第二三聚体多肽，与第一三聚体多肽的缀合改善了第二三聚体多肽的物理、药代动力学和/或生物学性质，和/或反之亦然。在一些情况下，相对于单独的一种或两种组分，缀合物具有改善的物理、药代动力学和/或生物学性质。在特定情况下，相对于单独的一种或两种组分，缀合物具有增加的稳定性和/或血清半衰期，例如，其中相对于单独的一种或两种组分，缀合物的稳定性和/或血清半衰期增加了约至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％或更多。在一些情况下，相对于单独的一种或两种组分，缀合物具有增加的生物活性，例如，其中相对于单独的一种或两种组分，缀合物的生物活性增加了约至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％或更多。

下文对缀合物的单独组分进行了更详细的描述。

精氨酸脱亚胺酶(adi)某些缀合物包括一种或多种精氨酸脱亚胺酶(adi)，也称为adi多肽或adi酶。在一些实施例中，adi多肽来自人型支原体、精氨酸支原体、关节炎支原体、海豹脑支原体、猫支原体、海豹支原体、鸽支原体、衣阿华支原体、鳄鱼支原体、短吻鳄支原体、奥氏嗜热盐丝菌或牛支原体。在一些实施例中，adi多肽来自唾液支原体、泡沫支原体、加拿大支原体、耳支原体、猪滑液支原体、泄殖腔支原体、鹅支原体、产碱支原体、口腔支原体、惰性支原体、火鸡支原体、蜂房支原体、穿透支原体、鸡支原体、梨支原体、类人猿支原体、发酵支原体、狮咽支原体、气管支原体、模仿支原体、乳白色支原体、毛氏支原体、象支原体、肺炎支原体、龟支原体、支原体属cag:877、或支原体属cag:472。

下表a1中提供了说明性adi多肽的氨基酸序列。

因此，在一些实施例中，缀合物的adi组分包括选自表a1(seqidno:1-68)的氨基酸序列(或其活性变体或片段)，由所述氨基酸序列组成或基本上由所述氨基酸序列组成。活性变体和片段的特定实例包括与选自表a1的序列至少80％、95％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成或基本上由所述氨基酸序列组成。本文其它地方描述了多肽“变体”和“片段”的另外实例。

在某些实施例中，adi具有“adi活性”，或将精氨酸转化或代谢成瓜氨酸和氨的能力。adi活性可以根据本领域的常规技术来测量。例如，l-瓜氨酸的量可以通过比色终点测定法(参见例如，knipp和vasak，《分析生物化学(analyticalbiochem.)》286:257-264,2000)检测，并与已知量的l-瓜氨酸的标准曲线进行比较，以计算adi的比活性，所述比活性可以表示为iu/mg的蛋白。在一些实施例中，adi酶活性的一个iu被定义为在测试的ph和温度下每分钟产生1μmol瓜氨酸的酶的量。

在一些实施例中，adi是六聚体或同源六聚体adi，例如，adi能够在其天然状态下和/或在缀合到缀合物的tnf超家族配体组分时形成六聚体或同源六聚体结构。不受任何一种理论的束缚，假设缀合物的adi组分的六聚体或同源六聚体结构能够稳定缀合物的tnf超家族配体组分，特别是当后者在其天然状态下和/或在缀合到缀合物的adi组分时形成三聚体或同源三聚体结构时。六聚体或同源六聚体adi的特定实例包含衍生自鸽支原体、惰性支原体、鸡支原体和火鸡支原体的天然adi(例如，分别为seqidno:9、37、38、50)，以及来自表a1的嵌合adi(例如，seqidno:57-68)，包含其活性变体和片段。

本文所述的任何一种或多种adi多肽可以与本文所述的任何一种或多种tnf超家族配体或三聚体(例如，同源三聚体)多肽结合，以形成缀合物(例如，融合蛋白)。

tnf超家族配体某些缀合物包括一种或多种肿瘤坏死因子(tnf)超家族配体，也被称为tnf超家族配体多肽。肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)是细胞因子受体的蛋白质超家族，所述蛋白质超家族特征在于通过富含细胞外半胱氨酸的结构域结合肿瘤坏死因子(tnf)的能力。除神经生长因子(ngf)外，所有tnf均与原型tnf-α同源。tnf受体主要涉及细胞凋亡和炎症，但也调节其它信号转导途径，如细胞增殖、存活和分化。术语死亡受体是指含有死亡结构域的tnf受体超家族成员，其实例包含tnfr1、fas受体、死亡受体4(dr4)以及死亡受体5(dr5)。

下表t1中提供了tnf超家族受体和其相应配体的说明性清单。

因此，在某些实施例中，缀合物的tnf超家族配体组分选自表t1中的配体多肽。在某些实施例中，tnf超家族配体是选自表t1的人多肽配体。

在一些实施例中，所述tnf超家族配体是三聚体或同源三聚体多肽。如上所述，根据一个非限制性理论，缀合物的adi组分的六聚体或同源六聚体结构能够稳定缀合物的三聚体或同源三聚体tnf超家族配体组分。在某些实施例中，tnf超家族配体是选自表t1的三聚体或同源三聚体多肽配体。

在一些实施例中，tnf超家族配体诱导癌细胞中的细胞凋亡(例如，通过结合到tnf超家族受体的死亡结构域或死亡受体)。因此，在一些实施例中，tnf超家族配体(例如，三聚体或同源三聚体配体)结合到至少一种tnf死亡受体或含有至少一个死亡结构域的tnf超家族受体。tnf超家族死亡受体的实例包含tnfr1、fas受体、dr4和dr5。死亡受体配体的特定实例包含trail、tnf-α和fasl。因此，在某些实施例中，缀合物的tnf超家族配体组分选自trail、tnf-α和fasl，任选地人trail、人tnf-α或人fasl中的一种或多种。

下表t2中提供了人trail、人tnf-α和人fasl的氨基酸序列。

在一些实施例中，缀合物的tnf超家族配体组分包括选自表t2(seqidno:69-72)的氨基酸序列(或其活性变体或片段)，由所述氨基酸序列组成或基本上由所述氨基酸序列组成。变体和片段的特定实例包括与选自表t2的序列至少80％、95％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成或基本上由所述氨基酸序列组成。本文其它地方描述了活性多肽“变体”和“片段”的其它实例。

在具体实施例中，缀合物的tnf超家族配体组分是人tnf相关的凋亡诱导配体(trail)多肽，或其变体或片段。trail是由大多数正常组织细胞产生和分泌的细胞因子。它在肿瘤细胞中引起细胞凋亡(例如，通过结合到某些死亡受体)。预测的281氨基酸的trail蛋白具有ii型膜蛋白的特征结构，具有单个内部疏水结构域且没有信号序列。trail的细胞外c端结构域与其它tnf家族成员的c端结构域共享22％到28％的同一性。trail与其信号传导受体dr4和dr5之间复合物的形成通过诱导细胞内死亡结构域的寡聚化来触发细胞凋亡。

在某些实施例中，缀合物的trail组分包括来自表t2(seqidno:69和70)的trail序列(或其变体或片段)，由所述氨基酸序列组成或基本上由所述氨基酸序列组成。trail变体的具体实例包含具有以下取代中的任何一个或多个的变体：s96c、s101c、s111c、r170c和k179c。在一些实施例中，trail变体在残基位置具有一组氨基酸取代，其选自y189q、r191k、q193r；h264r、i266l、d267q；y189q、r191k、q193r；以及y189q、r191k、q193r、i266l中的一个或多个(参见美国申请第2013/0165383号；和第2012/0165267号，其通过引用并入)。trail片段的特定实例包含残基114-281(细胞外结构域)、残基95-281、残基92-281、残基91-281、残基41-281、残基39-281、残基15-281、残基119-281以及全长序列(seqidno:69)的残基1-281。本文其它地方描述了多肽“变体”和“片段”的另外实例。

本文所述的任何一种或多种tnf超家族配体可与本文所述的任何一种或多种adi多肽或六聚体(例如，同源六聚体)多肽组合，以形成缀合物(例如，融合蛋白)。

连接子某些缀合物包括一个或多个连接子基团。术语“连接”，“连接子”，“连接子部分”或“l”在本文中用于指可用于将缀合物的一个多肽组分与另一多肽组分分离的连接子，例如，来自tnf超家族配体的adi多肽，或来自三聚体多肽的六聚体多肽。连接子可以是生理稳定的，或者可以包含可释放的连接子，如不稳定的连接子或可酶促降解的连接子(例如，蛋白水解可切割的连接子)。在某些方面，连接子是肽连接子。在一些方面，连接子非肽连接子或非蛋白质连接子。

某些实施例包括一种或多种肽连接子。可以使用本领域的标准技术将此类肽连接子序列掺入缀合物(例如，融合多肽)中。

可以基于以下示例性因素选择某些肽连接子序列：(1)其能够采用灵活的扩展构象；(2)其不能采用可以与第一多肽和第二多肽上的功能性表位相互作用的次级结构；(3)其生理稳定性；和(4)缺乏可能与多肽功能性表位或其它特征反应的疏水残基或带电残基。参见例如，george和heringa,j，《蛋白质工程(proteineng.)》15:871-879,2002。在一些实施例中，肽连接子是刚性连接子。在一些实施例中，肽连接子是柔性连接子。在特定实施例中，可以使用能够对肽本身进行建模的计算机程序(desjarlais和berg，《美国科学院院报(pnas.)》90:2256-2260,1993；以及《美国科学院院报》91:11099-11103,1994)或通过噬菌体展示方法合理地设计柔性连接子。

在一些实施例中，肽连接子序列的长度为1到约200个氨基酸。示例性连接子可具有约1-200个氨基酸、1-150个氨基酸、1-100个氨基酸、1-90个氨基酸、1-80个氨基酸、1-70个氨基酸、1-60个氨基酸、1-50个氨基酸、1-40个氨基酸、1-30个氨基酸、1-20个氨基酸、1-10个氨基酸、1-5个氨基酸、1-4个氨基酸、1-3个氨基酸或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200个或者更多氨基酸的总氨基酸长度。

肽连接子可以使用如本文别处描述的和本领域已知的任何一种或多种天然存在的氨基酸、一种或多种非天然存在的氨基酸、氨基酸类似物和/或氨基酸模拟物。可以有用地用作连接子的某些氨基酸序列包含在maratea等人，《基因(gene)》40:39-46,1985；murphy等人，《美国科学院院报(pnasusa.)》83:8258-8262,1986；美国专利第4,935,233号和美国专利第4,751,180号中公开的氨基酸序列。特定的肽连接子序列含有gly残基、ser残基和/或asn残基。如果需要，还可以在肽连接子序列中采用其它近中性氨基酸，如thr和ala。

下表l1中提供了某些示例性肽连接子。

因此，在某些实施例中，缀合物(例如，融合多肽)包括一种或多种选自表p1的肽连接子。

在一些实施例中，例如，在非融合或化学连接的缀合物中，连接子为非肽连接子。例如，在一些实施例中，连接子是构建成含有烷基或芳基主链、且含有酰胺、醚、酯、腙、二硫键或其任何组合的有机部分。含有氨基酸、醚和酰胺结合组分的键在生理ph条件下(血清中通常为7.4)是稳定的。还包括含有酯或腙并在血清ph下稳定的键。

在一些情况下，连接子包含增加两个连接原子之间距离的间隔子。间隔子可以进一步增加连接子的柔性和/或长度。间隔子可以包含但不限于烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基；其中每一个可以含有一个或多个杂原子、杂环、氨基酸、核苷酸和糖。

在一些实施例中，连接子的长度为约1到约30个原子，或长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个原子，包含这其间所有的范围。在某些实施例中，连接子长度为约1到约30个原子，碳链原子可以被独立地选自由o、n或s组成的基团的杂原子取代。在一些实施例中，1到4或5到15个c原子被独立选自o、n、s的杂原子取代。

在某些实施例中，连接子包括选自以下的结构或由选自以下的结构组成：—o—、—nh—、—s—、—c(o)—、c(o)—nh、nh—c(o)—nh、o—c(o)—nh、—c(s)—、—ch2—、—ch2—ch2—、—ch2—ch2—ch2—、—ch2—ch2—ch2—ch2—、—o—ch2—、—ch2—o—、—o—ch2—ch2—、—ch2—o—ch2—、—ch2—ch2—o—、—o—ch2—ch2—ch2—、—ch2—o—ch2—ch2—、—ch2—ch2—o—ch2—、—ch2—ch2—ch2—o—、—o—ch2—ch2—ch2—ch2—、—ch2—o—ch2—ch2—ch2—、—ch2—ch2—o—ch2—ch2—、—ch2—ch2—ch2—o—ch2—、—ch2—ch2—ch2—ch2—o—、—c(o)—nh—ch2—、—c(o)—nh—ch2—ch2—、—ch2—c(o)—nh—ch2—、—ch2—ch2—c(o)—nh—、—c(o)—nh—ch2—ch2—ch2—、—ch2—c(o)—nh—ch2—ch2—、—ch2—ch2—c(o)—nh—ch2—、—ch2—ch2—ch2—c(o)—nh—、—c(o)—nh—ch2—ch2—ch2—ch2—、—ch2—c(o)—nh—ch2—ch2—ch2—、—ch2—ch2—c(o)—nh—ch2—ch2—、—ch2—ch2—ch2—c(o)—nh—ch2—、—ch2—ch2—ch2—c(o)—nh—ch2—ch2—、—ch2—ch2—ch2—ch2—c(o)—nh—、—nh—c(o)—ch2—、—ch2—nh—c(o)—ch2—、—ch2—ch2—nh—c(o)—ch2—、—nh—c(o)—ch2—ch2—、—ch2—nh—c(o)—ch2—ch2、—ch2—ch2—nh—c(o)—ch2—ch2、—c(o)—nh—ch2—、—c(o)—nh—ch2—ch2—、—o—c(o)—nh—ch2—、—o—c(o)—nh—ch2—ch2—、—nh—ch2—、—nh—ch2—ch2—、—ch2—nh—ch2—、—ch2—ch2—nh—ch2—、—c(o)—ch2—、—c(o)—ch2—ch2—、—ch2—c(o)—ch2—、—ch2—ch2—c(o)—ch2—、—ch2—ch2—c(o)—ch2—ch2—、—ch2—ch2—c(o)—、—ch2—ch2—ch2—c(o)—nh—ch2—ch2—nh—、—ch2—ch2—ch2—c(o)—nh—ch2—ch2—nh—c(o)—、—ch2—ch2—ch2—c(o)—nh—ch2—ch2—nh—c(o)—ch2—、二价环烷基、—n(r⁶)—，r⁶是h或选自由烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基组成的基团的有机基。

在一些实施例中，连接子是稳定连接子。在一些实施例中，稳定连接子选自由以下组成的基团：琥珀酰亚胺、丙酸、羧甲基连接、醚、氨基甲酸酯、酰胺、胺、脲、酰亚胺、脂族c-c键和硫醚。在一些实施例中，连接子基团是亲水性的，例如，以增强缀合物在体液中的溶解度。

在一些实施例中，连接子包括诸如聚乙二醇或聚丙二醇等聚合物，或者由所述聚合物组成。本文所用的术语“peg”、“聚乙二醇”和“聚(乙二醇)”是可互换的，并且意指包括任何水溶性聚(环氧乙烷)衍生物。peg是众所周知的聚合物，在许多水性和有机溶剂中具有良好的溶解性，其表现出低毒性，缺乏免疫原性，并且其透明、无色、无味且稳定。如本文所述，可以用其它水溶性聚合物获得类似产物，包含但不限于：聚乙烯醇、其它聚(烯化氧)(如聚(丙二醇)等)、聚(氧乙基化多元醇)(如聚(氧乙基化甘油)等)、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-l,3,6-三恶烷、乙烯/马来酸酐以及聚氨基酸。本领域技术人员将能够基于所需的剂量、循环时间、抗蛋白水解性和其它考虑因素来选择所需的聚合物。

通常，根据本文所述的缀合物使用的peg包括以下结构：“-(och2ch2)n-”，其中(n)为约1到4000、约20到1400、或约20-800。在特定实施例中，peg还包含“-o-(ch2ch2o)n-ch2ch2-”和“-(och2ch2)n-o-”，这取决于末端氧是否已被置换。术语“peg”包含具有各种末端或“封端”基团的结构。术语“peg”还包括含有大部分(即大于50％)-och2ch2-重复亚单元的聚合物。关于具体形式，peg可以采用任何数量的各种分子量，以及结构或几何形状，例如“分支的”、“线性的”、“分叉的”、“多功能的”peg分子。

在以下文献中描述了代表性的聚合试剂和用于将这种聚合物缀合到活性部分的方法：harris,j.m.和zalipsky,s.编辑，《聚(乙二醇)化学和生物应用(poly(ethyleneglycol),chemistryandbiologicalapplications)》，acs，华盛顿，1997；veronese,f.和j.m.harris编辑，《肽和蛋白质聚乙二醇化(peptideandproteinpegylation)》，《先进药物输送评论(advanceddrugdeliveryreviews)》，54(4)；453-609(2002)；zalipsky,s.等人，《聚乙二醇化学：生物技术和生物医学应用(polyethyleneglycolchemistry:biotechnicalandbiomedicalapplications)》中的“功能化聚(乙二醇)在多肽修饰中的应用”，j.m.harris编辑，plenus出版社，纽约(1992)；zalipsky(1995)，《先进药物评论(advanceddrugreviews)》16:157-182；以及roberts等人，《先进药物输送评论》54,459-476(2002)。

多种peg衍生物都是可商购的并且适用于制备本公开的peg-缀合物。例如，nof公司的系列提供了许多peg衍生物，包含甲氧基聚乙二醇和活化的peg衍生物(如琥珀酰亚胺酯、甲氧基-peg胺、马来酰亚胺和羧酸)，用于通过各种方法偶联到多肽和多核苷酸，并且内克塔治疗(nektartherapeutics)的高级聚乙二醇化还提供多种peg偶联技术，以提高治疗的安全性和疗效。用于形成缀合物的另外的peg包含可从polypure(挪威)、quantabiodesignltd(俄亥俄州)、jenkemtechnology、nanocscorporation和sunbio，inc(南韩)获得的peg。在例如pasut等人，《治疗术专利专家评论(expertopin.ther.patents.)》14(6)859-893,2004中描述了适用于形成缀合物的另外的peg试剂和缀合方法。

在以下专利中描述了线性或分支的peg聚合物和其衍生物或缀合物的制备：例如，美国专利第4,904,584号；第5,428,128号；第5,621,039号；第5,622,986号；第5,643,575号；第5,728,560号；第5,730,990号；第5,738,846号；第5,811,076号；第5,824,701号；第5,840,900号；第5,880,131号；第5,900,402号；第5,902,588号；第5,919,455号；第5,951,974号；第5,965,119号；第5,965,566号；第5,969,040号；第5,981,709号；第6,011,042号；第6,042,822号；第6,113,906号；第6,127,355号；第6,132,713号；第6,177,087号；第6,180,095号；第6,448,369号；第6,495,659号；第6,602,498号；第6,858,736号；第6,828,401号；第7,026,440号；第7,608,678号；第7,655,747号；第7,786,221号；第7,872,072号；以及第7,910,661号，这些专利中的每一个通过引用以其全文并入本文。

在某些实施例中，前述连接子可任选。

多肽变体某些实施例包含本文所述参考序列的“变体”和“片段”，无论是通过名称还是通过参考表或序列标识符描述。实例包含本文所述的任何adi多肽、tnf超家族配体多肽和融合多肽。“变体”序列是指在一个或多个取代、缺失(例如，截短)、添加和/或插入上与参考序列不同的多肽或多核苷酸序列。变体多肽具有生物学活性，即，其继续具有参考多肽的酶促或结合活性。此类变体可以由例如遗传多态性和/或人为操纵产生。

在许多情况下，生物活性变体将含有一个或多个保守取代。“保守取代”是氨基酸取代具有相似性质的另一种氨基酸的取代，使得肽化学领域的技术人员预期多肽的二级结构和亲水性质基本上不变。如上所述，可以对本公开的多核苷酸和多肽的结构进行修饰，并且仍然获得编码具有期望特征的变体或衍生多肽的功能分子。当期望改变多肽的氨基酸序列以产生本文所述的多肽的等同物或甚至改进的变体或部分时，本领域技术人员通常会改变编码dna序列的一个或多个密码子。

例如，某些氨基酸可以取代蛋白质结构中的其它氨基酸，而不会明显丧失相互作用的结合能力。由于蛋白质的相互作用能力和性质决定了蛋白质的生物功能活性，因此可以在蛋白质序列中进行某些氨基酸序列取代，当然，也可以在其基础dna编码序列中进行，但仍然可以获得具有类似性质的蛋白质。因此预期可以对所公开组合物的肽序列或编码所述肽的相应dna序列进行各种改变而不会明显丧失其效用。

在进行这种改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能方面的重要性在本领域中公知(kyte和doolittle，1982，通过引用并入本文)。可以理解的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，这又定义了蛋白质与其它分子，例如，酶、底物、受体、dna、抗体、抗原等的相互作用。根据氨基酸的疏水性和电荷特征，每种氨基酸都被指定了亲水指数(kyte和doolittle，1982)。这些数值是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(–0.4)；苏氨酸(–0.7)；丝氨酸(–0.8)；色氨酸(–0.9)；酪氨酸(–1.3)；脯氨酸(–1.6)；组氨酸(–3.2)；谷氨酸盐(–3.5)；谷氨酰胺(–3.5)；天冬氨酸盐(–3.5)；天冬酰胺(–3.5)；赖氨酸(–3.9)；以及精氨酸(–4.5)。本领域已知某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或分数的其它氨基酸取代，并仍然产生具有相似生物活性的蛋白质，即，仍然获得生物学功能等同的蛋白质。在进行此类改变时，优选亲水指数在±2内的氨基酸取代，特别优选在±1内的氨基酸取代，并且甚至更加特别优选在±0.5内的氨基酸取代。

在本领域还应理解可以基于亲水性来有效地进行相似氨基酸的取代。美国专利4,554,101(特别通过引用以其全文并入本文)指出，由蛋白质相邻氨基酸的亲水性支配的其最大局部平均亲水性与蛋白质的生物学性质相关。如美国专利4,554,101中所详述的，以下亲水性值已指定为氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应当理解的是，氨基酸可以取代具有相似亲水性质的另一种氨基酸，并且仍然获得生物学上等同的，特别是免疫学上等同的蛋白质。在此类改变中，优选亲水性值在±2内的氨基酸取代，特别优选在±1内的氨基酸取代并且甚至更加特别优选在±0.5内的氨基酸取代。

如上所述，氨基酸取代因此通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到各种前述特征的示例性取代是本领域技术人员公知的，并且包含：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸盐和天冬氨酸盐；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进一步进行氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包含天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包含赖氨酸和精氨酸；以及具有相似亲水性数值的不带电极性头部基团的氨基酸包含亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以代表保守变化的其它氨基酸基团包含：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；以及(5)phe、tyr、trp、his。

变体还可以或可替代地含有非保守变化。在优选的实施例中，变体多肽与天然或参考序列的不同之处在于取代、缺失或添加少于约10、9、8、7、6、5、4、3、2个氨基酸，或甚至1个氨基酸。变体也可以(或可替代地)通过例如对多肽的免疫原性、二级结构、酶活性和/或亲水性质影响最小的氨基酸的缺失或添加进行修饰。

在某些实施例中，多肽序列长度为约、至少约、或多至约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或更多个连续氨基酸(包含其间的所有整数)，并且可以包括参考序列的全部或一部分(参见例如表或序列表)。

在一些实施例中，多肽序列由约或不超过约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或更多个连续氨基酸(包含其间的所有整数)组成，并且可以包括参考序列的全部或部分(参见例如表或序列表)。

在某些实施例中，多肽序列约为10-1000、10-900、10-800、10-700、10-600、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100、10-50、10-40、10-30、10-20、20-1000、20-900、20-800、20-700、20-600、20-500、20-400、20-300、20-200、20-100、20-50、20-40、20-30、50-1000、50-900、50-800、50-700、50-600、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、100-1000、100-900、100-800、100-700、100-600、100-500、100-400、100-300、100-200、200-1000、200-900、200-800、200-700、200-600、200-500、200-400或200-300个连续的氨基酸(包含其间的所有范围)，并且可以包含参考序列的全部或部分。在某些实施例中，任何参考多肽的c端或n端区域可被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、或800或更多个氨基酸，或约10-50、20-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800或更多个氨基酸(包含其间的所有整数和范围(例如，101、102、103、104、105))，只要截短的多肽保留参考多肽的结合特性和/或活性。通常，生物活性片段具有不少于其衍生自的生物活性参考多肽的活性的约1％、约5％、约10％、约25％或约50％。

在某些情况下，变体将显示与参考多肽序列至少约30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的相似性或序列同一性或序列同源性。此外，设想序列与天然或亲本序列的差异在于添加(例如，c端添加、n端添加、两者)、缺失、截短、插入或取代了(例如，保守取代)约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100个氨基酸(包含其间的所有整数和范围)，但保留了亲本或参考多肽序列的特性或活性。

在一些实施例中，变体多肽与参考序列的差异在于至少一个但少于50、40、30、20、15、10、8、6、5、4、3或2个氨基酸残基。在某些实施例中，变体多肽与参考序列的差异在于至少1％但小于20％、15％、10％或5％的残基。(如果此比较要求比对，则应比对序列以获得最大相似性。删除或插入或错配的“环”序列被视为差异。)

序列之间的序列相似性或序列同一性的计算(这些术语在本文中可互换使用)如下进行。为了测定两个氨基酸序列、或两个核酸序列的百分比同一性，出于最佳比较的目的将序列比对(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入空位以用于最佳比对，并且出于比较目的，非同源序列可以忽略)。在某些实施例中，出于比较目的比对的参考序列长度是参照序列长度的至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％、以及更甚优选地70％、80％、90％、100％。然后比较对应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与在第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则这些分子在那个位置是一致的。

两个序列之间的百分比同一性是所述序列共享的相同位置的数量的函数，考虑了空位数量以及每个空位的长度，需要引入它们以用于两个序列的最佳比对。

序列比较和两个序列之间百分比同一性的测定可以使用数学算法来完成。在一个优选的实施例中，利用needleman和wunsch(《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》48:444-453,1970)算法使用blossum62矩阵或pam250矩阵，空位权重16、14、12、10、8、6、或4以及长度权重1、2、3、4、5、或6来测定两个氨基酸序列之间的百分比同一性，所述算法已并入gcg软件包中的gap程序中。在又另一优选的实施例中，利用gcg软件包中的gap程序，使用nwsgapdncmp矩阵和空位权重40、50、60、70或80以及长度权重1、2、3、4、5或6来测定两个核苷酸序列之间的百分比同一性。一组特别优选的参数(除非另有说明，否则应使用的参数)是blossum62评分矩阵，空位罚分为12，空位延伸罚分为4，并且移码空位罚分为5。

可以利用已合并在align程序(版本2.0)中的e.meyers和w.miller(《计算机在生物科学中的应用(cabios)》4:11-17,1989)的算法，使用pam120权重残基表、空位长度罚分12以及空位罚分4来测定两个氨基酸或核苷酸序列之间的百分比同一性。

本文描述的核酸和蛋白质序列可以用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索，从而例如，鉴定其它家族成员或相关序列。可以使用altschul等人，(1990，《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》215:403-10)的nblast和xblast程序(版本2.0)来进行这种搜索。可以用nblast程序(得分＝100，字长＝12)进行blast核苷酸搜索，以获得与本文描述的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用xblast程序(得分＝50，字长＝3)进行blast蛋白质搜索，以获得与本文描述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有空位的比对，可以利用如在altschul等人，(《核酸研究(nucleicacidsres)》25:3389-3402，1997)中所描述的空位blast。当利用blast和空位blast程序时，可以使用相应程序(例如，xblast和nblast)的默认参数。

在一些实施例中，如上所述，可以使用blast比对工具评估多核苷酸和/或多肽。局部比对仅由一对序列区段组成，每个序列区段中的一个序列区段被比较。对smith-waterman或sellers算法的修正将找到所有不能通过扩展或修剪来改善分数的称为高分值区段对(hsp)的片段对。blast比对的结果包含统计学测量，以指示仅偶然可以预期blast分数的可能性。

根据与每个比对序列相关的空位和取代的数量计算原始分数s，其中较高的相似性分数表示更显著的比对。取代分数由查询表给出(参见pam，blosum)。

空位分数通常被计算为g(空位开放罚分)和l(空位延伸罚分)之和。对于长度为n的空位，空位成本为g+ln。空位成本g和l的选择是经验性的，但习惯上选择g(10-15)的高值，例如11，以及l(1-2)的低值，例如，1。

比特分数s'衍生自原始比对分数s，其中已经考虑了所使用的评分系统的统计特性。比特分数相对于评分系统被标准化，因此其可以用于比较来自不同搜索的比对分数。术语“比特分数”和“相似性分数”可互换使用。比特分数表示比对好的程度；分数越高，比对越好。

e值或预期值描述了具有相似分数的序列偶然出现在数据库中的可能性。e值或预期值是预测在数据库检索中偶然出现的具有等同于或优于s的分数的不同比对数量的预测。e值越小，比对越显著。例如，e值为e^-117的比对意味着具有相似分数的序列很不可能只是偶然出现。另外，比对随机氨基酸对的预期分数要求是负的，否则长比对将倾向于具有高分数而不管与比对的区段是否相关。另外，blast算法使用适当的取代矩阵、核苷酸或氨基酸，并且对于空位比对，使用空位产生和延伸罚分。例如，blast比对和多肽序列的比较通常使用blosum62矩阵、空位存在罚分11以及空位延伸罚分1进行。

在一些实施例中，从使用blosum62矩阵、空位存在罚分11以及空位延伸罚分1进行的blast分析中报告序列相似性分数。

在一个特定实施例中，本文提供的序列同一性/相似性分数是指利用gap版本10(gcg，accelrys，圣地亚哥，加利福尼亚)使用以下参数获得的值：使用gap权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵的核苷酸序列的百分比同一性和百分比相似性；使用gap权重8和长度权重2以及blosum62评分矩阵(henikoff和henikoff，《美国科学院院报(pnasusa)》89:10915-10919,1992)的氨基酸序列的百分比同一性和百分比相似性。gap利用needleman和wunsch的算法(《分子生物学杂志(jmolbiol.)》48:443-453,1970)来找到两个完整序列的比对，所述比对将匹配数最大化并将空位数最小化。

在特定实施例中，变体多肽包括可以与参考多肽序列最佳比对的氨基酸序列(参见例如，序列表)，以产生至少约50、60、70、80、90、100、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或更多的blast比特分数或序列相似性分数(包含其间的所有整数和范围)，其中blast比对使用blosum62矩阵、空位存在罚分11以及空位延伸罚分1。

如上所述，参考多肽可以以各种方式改变，包含氨基酸取代、缺失、截短、添加和插入。用于这种操作的方法是本技术领域公知的。例如，可以通过dna的突变来制备参考多肽的氨基酸序列变体。用于诱变和核苷酸序列更改的方法是本领域熟知的。参见例如kunkel(《美国科学院院报(pnasusa)》82:488-492,1985)；kunkel等人，(《酶学方法(methodsinenzymol)》154:367-382,1987)，美国专利第4,873,192号，watson,j.d.等人(《基因分子生物学(molecularbiologyofthegene)》第四版，本杰明-卡明斯公司，门洛帕克，加利福尼亚，1987)和本文所引用的参考文献。关于不影响关注蛋白质的生物活性的适当氨基酸取代的指导可以发现于dayhoff等人，(1978)《蛋白质序列和结构(atlasofproteinsequenceandstructure)》(美国国家生物医学研究基金会，华盛顿特区)。

用于筛选通过这种修饰制备的组合文库的基因产物的方法，以及用于筛选具有所选性质的基因产物的cdna文库的方法是本领域已知的。这种方法适用于快速筛选通过参考多肽的组合诱变产生的基因文库。作为一个实例，递归总体诱变(rem)——一种增强文库中功能性突变体频率的技术，可以与筛选试验组合使用以鉴定多肽变体(arkin和yourvan，《美国科学院院报》89:7811-7815，1992；delgrave等人，《蛋白质工程(proteinengineering)》6:327-331,1993)。

多肽修饰某些实施例包含包括至少一种“修饰剂”的缀合物，其实例包含但不限于大分子聚合物、蛋白质、肽、多糖和其它化合物。在一些情况下，修饰剂附着于缀合物的adi组分或缀合物的肿tnf超家族配体组分或两者上。在一些实施例中，修饰剂仅附着于缀合物的adi组分上，即修饰剂不附着于缀合物的tnf超家族配体(例如，trail)组分上。缀合物和修饰剂可以通过共价键或非共价相互作用连接以形成稳定的缀合物或稳定的组合物以实现期望的效果。在某些实施例中，经过修饰的缀合物保留相应未修饰的缀合物(例如，具有相同或相似序列)的生物活性，并且具有比相应未修饰的缀合物更长的体内半衰期和更低的抗原性。在某些实施例中，已过修饰的缀合物保留相应未修饰的缀合物至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的生物活性。通常，经过修饰的缀合物保留足以用于治疗用途的生物活性。

在一些实施例中，修饰剂是生物相容的聚合物或蛋白质或其片段，并且增加血液中缀合物的半衰期。修饰剂可以化学偶联到缀合物或其组分，或者在适用的情况下，通过融合蛋白表达连接到缀合物或其组分。

高分子聚合物可以包含非肽高分子聚合物，其在某些实施例中可以具有其自身的生物活性。合适的聚合物包含但不限于多烯醇化合物、聚醚化合物、聚乙烯吡咯烷酮、多聚氨基酸、二乙烯醚和马来酸酐的共聚物、n-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺、多糖、聚氧乙基多元醇、肝素或其片段、聚烷基乙二醇和其衍生物，聚烷基乙二醇和其衍生物的共聚物、聚(乙烯基乙醚)、a,p-聚[(2-羟乙基)-dl-天冬酰胺]、聚羧酸盐、聚氧乙烯-氧亚甲基、聚丙烯酰吗啉、氨基化合物和氧烯烃的共聚物、聚透明质酸、聚环氧化物、乙二酸和丙二酸的共聚物、聚(1,3-二氧戊环)、乙烯和马来酰肼共聚物、聚唾液酸、环糊精等。在某些实施例中，所述聚合物是聚乙二醇。

如本文所使用的多烯醇化合物包含但不限于聚乙二醇(包含单甲氧基聚乙二醇、单羟基聚乙二醇)、聚乙烯醇、聚丙烯醇、聚丁烯醇等，以及其衍生物，如脂质。

聚醚化合物包含但不限于聚亚烷基二醇(ho((ch2)xo)nh)、聚丙二醇、聚氧化乙烯(ho((ch2)2o)nh)、聚乙烯醇((ch2choh)n)。

多聚氨基酸包含但不限于一种氨基酸的聚合物或两种或更多种氨基酸的共聚物，例如，聚丙氨酸或聚赖氨酸，或其嵌段共聚物。

多糖包含但不限于葡聚糖和其衍生物，例如硫酸葡聚糖、纤维素和其衍生物(包含甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和其衍生物、聚蔗糖等。

在特定实施例中，修饰剂是peg分子。“聚乙二醇”或“peg”是指支链或直链的环氧乙烷和水的缩聚物的混合物，由通式h(och2ch2)noh表示，其中n至少为4。在一些情况下，peg附着于缀合物的adi组分或缀合物的肿tnf超家族配体组分或两者上。在一些实施例中，peg仅附着于缀合物的adi组分上，即peg不附着于缀合物的tnf超家族配体(例如，trail)组分上。

“聚乙二醇”或“peg”与数字后缀组合使用以表示其近似重均分子量。例如，peg5,000是指总重均分子量为约5,000的peg；peg12,000是指总重均分子量为约12,000的peg；以及peg20,000是指总重均分子量为约20,000的peg。

在一些实施例中，peg的总重均分子量为约1,000到约50,000；约3,000到约40,000；约5,000到约30,000；约8,000到约30,000；约11,000到约30,000；约12,000到约28,000；约16,000到约24,000；约18,000到约22,000；或约19,000到约21,000。在一些实施例中，peg的总重均分子量为约1,000到约50,000；约3,000到约30,000；约3,000到约20,000；约4,000到约12,000；约4,000到约10,000；约4,000到约8,000；约4,000到约6,000；或约5,000。在具体实施例中，peg的总重均分子量为约20,000。通常，分子量为30,000或更多的peg难以溶解，并且配制产品的产率可能降低。peg可以是支链或直链。peg可以是支链或直链，并且在某些实施例中是直链。具有本文所述的分子量的peg可以与缀合物或其组分结合使用，并且任选地，与生物相容性连接子结合使用。

某些实施例使用一个或多个硫醇、巯基或半胱氨酸反应性peg。在一些实施例中，一个或多个硫醇、巯基或半胱氨酸反应性peg附着于一个或多个天然存在的半胱氨酸残基、一个或多个引入的半胱氨酸残基(例如，用一个或多个半胱氨酸残基取代一个或多个野生型残基、插入一个或多个半胱氨酸残基)或其任何组合(参见例如，doherty等人，《生物共轭化学(bioconjugchem.)》16:1291-98,2005)。在具体实施例中，缀合物的adi组分具有k192c和/或k287c取代中的一个或两个，用于附着到一个或多个半胱氨酸反应性peg。在某些实施例中，缀合物的一个或多个野生型半胱氨酸残基可以被另一种氨基酸取代，以防止peg聚合物与野生型半胱氨酸的连接，例如，以防止一个或多个peg破坏其它期望的生物活性。一些实施例采用一种或多种非天然半胱氨酸衍生物(例如，高半胱氨酸)，而非半胱氨酸。

硫醇、巯基或半胱氨酸反应性peg的非限制性实例包含甲氧基peg马来酰亚胺(m-peg-mal)(例如，mw2000、mw5000、mw10000、mw20000、mw30000、mw40000)。m-peg-mal与蛋白质和肽中的半胱氨酸侧链上的硫醇基团反应，以产生稳定的3-硫代琥珀酰亚胺基醚键。此反应具有高选择性，可在约ph5.0-6.5的温和条件下，在其它官能团存在下进行。因此，在某些实施例中，缀合物或其组分缀合到本文所述的硫醇、巯基或半胱氨酸反应性peg分子的任何一种或多种。

缀合物或其组分可以在有连接子或没有连接子的情况下共价键合到修饰剂(如peg)。在一些情况下，缀合物或其组分可以直接(即，在没有连接子的情况下)偶联到修饰剂(如peg)，例如，通过氨基、巯基、羟基、羧基或其它基团。

用于将缀合物或其组分共价附着到修饰剂(例如，peg)的连接子可以是任何生物相容性连接子。“生物相容的”表示化合物或基团是无毒的并且可以在体外或体内使用而不会引起损伤、疾病、病症或死亡。修饰剂(如peg)可以例如通过醚键、硫醇键、酰胺键或其它键键合到连接子。

在一些实施例中，合适的连接子可以具有例如约1-100个原子、1-80个原子、1-60个原子、1-40个原子、1-30个原子、1-20个原子，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个原子的总链长，其中链中的原子包括c、s、n、p、和/或o。在一些情况下，连接子基团包含例如琥珀酰基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物、酪氨酸基、半胱氨酸基、组氨酸基、亚甲基、以及其组合。稳定连接子的特定实例包含琥珀酰亚胺基、丙酸、羧甲基连接、醚、氨基甲酸酯、酰胺、胺、脲、酰亚胺、脂族c-c键和硫醚。在某些实施例中，生物相容性连接子是琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(ss)基团。

其它合适的连接子包含氧羰基咪唑基(包含，例如，羰基咪唑(cdi))、硝基苯基(包含，例如，硝基苯基碳酸酯(ncp)或三氯苯基碳酸酯(tcp))、甲苯磺酸酯基、醛基、异氰酸酯基、乙烯基砜基或伯胺。在某些实施例中，连接子衍生自ss、spa、scm或nhs；在某些实施例中，使用ss、spa或nhs，并且在一些实施例中，使用ss或spa。因此，在某些实施例中，潜在的连接子可以由甲氧基-peg琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(ss)、甲氧基-peg琥珀酰亚胺基戊二酸酯(sg)、甲氧基-peg琥珀酰亚胺基碳酸酯(sc)、甲氧基-peg琥珀酰亚胺基羧甲基酯(scm)、甲氧基-peg2n-羟基琥珀酰亚胺基(nhs)、甲氧基-peg琥珀酰亚胺基丁酸酯(sba)、甲氧基-peg琥珀酰亚胺基丙酸酯(spa)、甲氧基-peg琥珀酰亚胺基戊二酰胺和/或甲氧基-peg琥珀酰亚胺基琥珀酰亚胺形成。

连接子的附加实例包含但不限于以下一种或多种：—o—、—nh—、—s—、—c(o)—、c(o)—nh、nh—c(o)—nh、o—c(o)—nh、—c(s)—、—ch2—、—ch2—ch2—、—ch2—ch2—ch2—、—ch2—ch2—ch2—ch2—、—o—ch2—、—ch2—o—、—o—ch2—ch2—、—ch2—o—ch2—、—ch2—ch2—o—、—o—ch2—ch2—ch2—、—ch2—o—ch2—ch2—、—ch2—ch2—o—ch2—、—ch2—ch2—ch2—o—、—o—ch2—ch2—ch2—ch2—、—ch2—o—ch2—ch2—ch2—、—ch2—ch2—o—ch2—ch2—、—ch2—ch2—ch2—o—ch2—、—ch2—ch2—ch2—ch2—o—、—c(o)—nh—ch2—、—c(o)—nh—ch2—ch2—、—ch2—c(o)—nh—ch2—、—ch2—ch2—c(o)—nh—、—c(o)—nh—ch2—ch2—ch2—、—ch2—c(o)—nh—ch2—ch2—、—ch2—ch2—c(o)—nh—ch2—、—ch2—ch2—ch2—c(o)—nh—、—c(o)—nh—ch2—ch2—ch2—ch2—、—ch2—c(o)—nh—ch2—ch2—ch2—、—ch2—ch2—c(o)—nh—ch2—ch2—、—ch2—ch2—ch2—c(o)—nh—ch2—、—ch2—ch2—ch2—c(o)—nh—ch2—ch2—、—ch2—ch2—ch2—ch2—c(o)—nh—、—nh—c(o)—ch2—、—ch2—nh—c(o)—ch2—、—ch2—ch2—nh—c(o)—ch2—、—nh—c(o)—ch2—ch2—、—ch2—nh—c(o)—ch2—ch2、—ch2—ch2—nh—c(o)—ch2—ch2、—c(o)—nh—ch2—、—c(o)—nh—ch2—ch2—、—o—c(o)—nh—ch2—、—o—c(o)—nh—ch2—ch2—、—nh—ch2—、—nh—ch2—ch2—、—ch2—nh—ch2—、—ch2—ch2—nh—ch2—、—c(o)—ch2—、—c(o)—ch2—ch2—、—ch2—c(o)—ch2—、—ch2—ch2—c(o)—ch2—、—ch2—ch2—c(o)—ch2—ch2—、—ch2—ch2—c(o)—、—ch2—ch2—ch2—c(o)—nh—ch2—ch2—nh—、—ch2—ch2—ch2—c(o)—nh—ch2—ch2—nh—c(o)—、—ch2—ch2—ch2—c(o)—nh—ch2—ch2—nh—c(o)—ch2—、二价环烷基、—n(r6)—，r6是h或选自由烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基组成的基团的有机基。另外，本文所述的任何连接子部分可以进一步包含环氧乙烷低聚物链，其包括1到20个环氧乙烷单体单元[即，-(ch2ch2o)1-20-]。也就是说，环氧乙烷低聚物链可以在连接子之前或之后出现，并且任选地出现在包括两个或更多个原子的连接子部分的任何两个原子之间。并且，如果低聚物与聚合物区段相邻并且仅代表聚合物区段的延伸，则低聚物链将不被认为是连接子部分的一部分。

下表p1中描述了具体的示例性peg分子和连接子。

在某些实施例中，缀合物或其组分包括一种或多种如本文(例如，在表p1中)所描述的peg分子和/或连接子。

1到约30个peg分子可以共价键合到缀合物或其组分。在某些实施例中，缀合物或其组分用一个peg分子修饰(即，包括)。在一些实施例中，缀合物或其组分用多于一个peg分子修饰。在特定实施例中，缀合物或其组分用约1到约10、或约7到约15个peg分子，或约2到约8或约9到约12个peg分子修饰。在一些实施例中，缀合物或其组分用约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个peg分子修饰。在具体实施例中，缀合物或其组分用每缀合物4.5-5.5个peg分子修饰。在一些实施例中，缀合物或其组分用5±1.5个peg分子修饰。

在某些实施例中，缀合物或其组分中约15％到约70％的伯氨基用peg修饰，在一些实施例中精氨酸脱亚胺酶中约20％到约65％、约25％到约60％，或在某些实施例中约30％到约55％、或45％到约50％，或在一些实施例中约50％的伯氨基用peg修饰。

附着到缀合物的peg可以与ss-peg、spa-peg和sc-peg一样，是直链，或与peg2-nhs一样，可以使用peg的支链。

在一些实施例中，例如，如上所述，氨基酸取代采用非天然氨基酸缀合到peg或其它修饰剂(参见例如，degraaf等人，《生物缀合化学(bioconjugchem.)》20:1281-95,2009)。因此，某些实施例包含通过一个或多个非天然氨基酸缀合到一个或多个peg的缀合物或其组分。在一些实施例中，非天然氨基酸包括具有官能团的侧链，所述官能团选自以下组成的组：烷基、芳基、芳基卤、乙烯基卤、烷基卤、乙酰基、酮、氮杂环丙烷、腈、硝基、卤化物、酰基、酮基、叠氮基、羟基、肼、氰基、卤素、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醚、环氧化物、砜、硼酸、硼酸酯、硼烷、苯硼酸、硫醇、硒基、磺酰基，硼酸酯、硼酸盐，膦基、膦羧基、磷化氢、杂环基、氮苯基、萘基、苯甲酮、受限环如环辛炔、硫酯、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基、羧酸、α-酮羧酸、α或β不饱和酸和酰胺、乙醛酰胺和有机硅烷基团。在一些实施例中，非天然氨基酸选自以下组成的组：对乙酰基-l-苯丙氨酸、o-甲基-l-酪氨酸、l-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、o-4-烯丙基-l-酪氨酸、高半胱氨酸、4-丙基-l-酪氨酸、三-o-乙酰基-glcnacβ-丝氨酸、β-o-glcnac-l-丝氨酸、三-o-乙酰基-galnac-α-苏氨酸、α-galnac-l-苏氨酸、左旋多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-l-苯丙氨酸、对叠氮-l-苯丙氨酸、对酰基-l-苯丙氨酸，对苯甲酰基-l-苯丙氨酸、l-磷酸丝氨酸、膦丝氨酸、膦酰酪氨酸、对碘苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-l-苯丙氨酸、以及异丙基-l-苯丙氨酸。

多核苷酸、表达载体和宿主细胞某些实施例涉及编码缀合物(例如，如本文所述的融合多肽)的多核苷酸。还包含单独地或与编码本文所述的任何一种或多种单独tnf超家族配体或三聚体多肽的多核苷酸组合地编码本文所述的任何一种或多种单独adi或六聚体多肽的多核苷酸。因此，某些实施例包含编码表a1中的任何一种或多种单独adi多肽、表t1或表t2中的任何一种或多种单独tnf超家族配体或本文所述的融合多肽的多核苷酸，例如，包括表a1中的融合到表t1或表t2中任何一种或多种tnf超家族配体的任何一种或多种adi多肽的融合多肽。

在其它用途中，这些和相关实施例可以用于在宿主细胞中重组产生融合多肽或其单独组分(adi、tnf超家族配体、六聚体多肽、三聚体多肽)。本领域的普通技术人员应理解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码本文所述的多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列可以具有最小的同源性。尽管如此，具体设想了由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸，例如针对人类、酵母或细菌密码子选择而优化的多核苷酸。

如本领域技术人员认识到的，多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链的，并且可以是dna(基因组、cdna或合成的)或rna分子。另外的编码或非编码序列可以但不必存在于本公开的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不必连接到其它分子和/或支持材料。

多核苷酸可以包括天然序列(即，编码融合多肽或其组分的内源序列)或可以包括变体或此类序列的生物功能等同物。多核苷酸变体可以含有一个或多个如本文所述的取代、添加、删除和/或插入，优选地使得变体多肽的活性相对于未修饰的多肽基本上未降低。

另外的编码或非编码序列可以但不必存在于多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不必连接到其它分子和/或支持材料。因此，无论编码序列本身的长度如何，多核苷酸都可以与其它dna或rna序列，如启动子、聚腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多克隆位点、其它编码区段等组合，使得它们的总长度可以改变很大。

多核苷酸序列还可以是混合基因组cdna、rna的序列以及合成来源的序列。例如，编码前导肽的基因组或cdna序列可以加入到编码多肽的基因组或cdna序列，之后可以根据熟知的方法步骤通过插入编码用于同源重组的期望的氨基酸序列的合成寡核苷酸或优选地使用合适的寡核苷酸通过pcr产生期望的序列而在位点处修饰dna或rna序列。在一些实施例中，信号序列可以包含在编码序列之前。这个序列将信号肽n端编码到编码序列，所述编码序列与宿主细胞连通以将多肽导向细胞表面或将多肽分泌到培养基中。通常，在蛋白质离开细胞之前，信号肽被宿主细胞修剪掉(clippedoff)。可以在原核生物和真核生物中的各种蛋白质中发现信号肽。

一种或多种多核苷酸可以编码本文所述的adi、tnf超家族配体、六聚体、三聚体和/或融合多肽。此外，可以出于各种原因操纵多核苷酸序列。实例包含但不限于掺入用于增强各种生物体中多核苷酸的表达的优选密码子(一般参见nakamura等人，《核酸研究(nuclacidsres.)》28:292,2000)。另外，可以掺入沉默突变以引入或消除限制性位点，降低cpg二核苷酸基序的密度(参见，例如，kameda等人，《生物化学生物物理研究通讯(biochem.biophys.res.commun.)》349:1269-1277,2006)，或降低单链序列形成茎环结构的能力：(参见，例如，zukerm.，《核酸研究(nuclacidsres.)》31:3406-3415,2003)。另外，在起始密码子处可以通过包含kozak共有序列(即，(a/g)cc(a/g)ccatgg)(seqidno:95)，进一步优化哺乳动物表达。用于此目的的kozak共有序列是本领域已知的(mantyh等人，《美国国家科学院院刊(pnas)》92:2662-2666,1995；mantyh等人，《蛋白质表达与纯化(prot.exp.&purif.)》6:124,1995)。

还包含包括多核苷酸的表达载体，以及包括多核苷酸和/或表达载体的宿主细胞。多肽和缀合物，例如融合多肽，可以通过众所周知的技术在合适的宿主细胞中通过表达编码多肽的dna或rna序列来产生。术语“宿主细胞”用于指在其中已经引入或能够引入编码一种或多种本文所述多肽的核酸序列的细胞，并且所述细胞进一步表达或能够表达所关注多肽，如编码任何本文所述多肽的多核苷酸。所述术语包含亲本细胞的子代，无论所述子代是否在形态上或遗传构成上与原始亲本相同，只要存在所选基因即可。可以选择宿主细胞用于某些特征，例如，表达甲酰甘氨酸生成酶(fge)以将硫酸酯酶基序内的半胱氨酸或丝氨酸残基转化为甲酰甘氨酸(fgly)残基，或表达可以将非天然氨基酸，包括具有叠氮侧链、炔侧链或其它期望侧链的非天然氨基酸并入多肽的一种或多种氨酰基trna合成酶，以促进化学缀合或修饰。

在一些情况下，多核苷酸或表达载体包括另外的非编码序列。例如，表达载体中存在的“控制元件”或“调节序列”是载体的非翻译区，包含增强子、启动子，5'和3'非翻译区，其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译。这些元件的强度和特异性可能不同。根据所利用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的适合的转录和翻译元件，包含组成型和诱导型启动子。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子，如pbluescript噬菌粒(stratagene，加利福利亚州拉荷亚市)或psport1质粒(gibcobrl，马里兰州盖瑟斯堡市)等的杂合lacz启动子。在哺乳动物细胞系统中，通常优选来自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。如果需要产生含有编码多肽的序列的多个拷贝的细胞系，则基于sv40或ebv的载体可以有利地与适当的可选标记一起使用。

各种表达载体/宿主系统是已知的，并且可以用于含有和表达多核苷酸序列。这些包含但不限于微生物，如用表达载体，例如重组噬菌体、质粒或粘粒dna表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，camv；烟草花叶病毒，tmv)或用细菌表达载体(例如，ti或pbr322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统，包含哺乳动物细胞，以及更具体地用病毒、质粒、附加型、整合或其它表达载体转化的人细胞系统。因此，某些实施例包含包括编码本文所述多肽，例如融合多肽的多核苷酸序列的表达载体。还包含包括多核苷酸和/或表达载体的宿主细胞。

某些实施例可以采用大肠杆菌类表达系统(参见，例如，结构基因组学联盟等，《自然方法(naturemethods)》5:135-146,2008)。这些和相关实施例可以部分或完全依赖独立于连接的克隆(lic)以产生合适的表达载体。在具体实施例中，蛋白质表达可以由t7rna聚合酶(例如，pet载体系列)或具有替代启动子(包含例如tac启动子)的经过修饰的pet载体控制。这些和相关实施例可以利用表达宿主菌株bl21(de3)，一种支持t7介导的表达并且缺乏用于改善靶蛋白稳定性的lon和ompt蛋白酶的bl21的λde3溶原菌。还包含携带大肠杆菌中很少使用的编码trna的质粒的表达宿主菌株，如rosetta^tm(de3)和rosetta2(de3)菌株。在一些实施例中，可以利用其它大肠杆菌菌株，包含其它大肠杆菌k-12菌株，如w3110(f^-λ^-in(rrnd-rrne)1rph-1)和ut5600(f、arac14、leub6(am)、seca206(azir)、lacy1、proc14、tsx67、δ(omptfepc)266、enta403、glnx44(as)、λ^-、trpe38、rfbc1、rpsl109(strr)、xyla5、mtl-1、thie1),这些大肠杆菌菌株可能导致发酵过程中翻译后修饰水平降低。还可以使用以商标核酸酶和蛋白质提取试剂销售的试剂来改善细胞裂解和样品处理。对于细胞培养，自诱导培养基可以提高许多表达系统的效率，包含高通量表达系统。这种类型的培养基(例如，overnightexpress^tm自诱导系统)通过代谢转移逐渐引发蛋白质表达，无需添加如iptg等人工诱导剂。

特定实施例采用六聚组氨酸标签(如以商标融合物销售的标签)，然后进行固定化金属亲和色谱(imac)纯化或相关技术。然而，在某些方面，临床级蛋白质可以从大肠杆菌包涵体中分离，无需或不使用亲和标签(参见，例如，shimp等人，《蛋白质表达与纯化(proteinexprpurif.)》50:58-67,2006)。作为另外一个实例，某些实施例可以采用冷激诱导的大肠杆菌高产量生产系统，因为在低温下大肠杆菌中蛋白质的过表达改善了大肠杆菌的溶解度和稳定性(参见，例如，qing等人，《自然生物技术(naturebiotechnology)》22:877-882,2004)。

还包含高密度细菌发酵系统。例如，真氧产碱杆菌的高细胞密度培养允许在细胞密度超过150g/l时产生蛋白质，以及在滴度超过10g/l时表达重组蛋白。在酵母酿酒酵母中，可以使用许多含有如α因子、醇氧化酶和pgh等组成型或诱导型启动子的载体。对于评论，参见ausubel等人(同上)和grant等人，《酶学方法(methodsenzymol.)》153:516-544,1987。还包含巴斯德毕赤酵母(pichiapandoris)表达系统(参见，例如，li等人，《自然生物技术(naturebiotechnology.)》24,210-215,2006；以及hamilton等人，《科学(science)》，301:1244,2003)。某些实施例包含被工程化以选择性地糖基化蛋白质的酵母系统，包含具有人源化n-糖基化途径的酵母等(参见，例如，hamilton等人，《科学(science.)》313:1441-1443,2006；wildt等人，《微生物自然评论(naturereviewsmicrobiol.)》3:119-28,2005；以及gerngross等人，《自然生物技术(naturebiotechnology.)》22:1409-1414,2004；美国专利第7,629,163号；第7,326,681号；和第7,029,872号)。仅举例来说，重组酵母培养物可以在冯巴赫瓶(fernbachflask)或15l、50l、100l和200l发酵罐等中生长。

在使用植物表达载体的情况下，编码多肽的序列的表达可以由许多启动子中的任何一个驱动。例如，如camv的35s和19s启动子等病毒启动子可以单独使用或与烟草花叶病毒的ω前导序列组合使用(takamatsu，《欧洲分子生物学学会杂志(emboj.)》6:307-311,1987)。替代性地，可以使用如rubisco的小亚基或热休克启动子等的植物启动子(coruzzi等人，《欧洲分子生物学学会杂志(emboj.)》3:1671-1680,1984；broglie等人,《科学(science.)》224:838-843,1984；以及winter等人，《细胞分化的结果与问题(resultsprobl.celldiffer.)》17:85-105,1991)。可以通过直接的dna转化或病原体介导的转染将这些构建体引入植物细胞中。在许多通常可获得的评论(参见，例如，mcgrawhill的hobbs，《科技年鉴(yearbookofscienceandtechnology)》，第191-196页,1992)中描述了此类技术。

昆虫系统还可以用于表达所关注的多肽。例如，在一个此类系统中，使用苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(acnpv)作为载体在草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾细胞中表达外源基因。可以将编码多肽的序列克隆到病毒的非必需区域，如多角体蛋白基因，并置于多角体蛋白启动子的控制下。成功插入多肽编码序列将使多角体蛋白基因失活并产生缺少外壳蛋白的重组病毒。然后可以使用重组病毒来感染例如可以表达所关注的多肽的草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾细胞(engelhard等人，《美国科学院院刊(pnasusa.)》91:3224-3227,1994)。还包含杆状病毒表达系统，包含利用sf9、sf21和t.ni细胞的杆状病毒表达系统(参见，例如，murphy和piwnica-worms，《蛋白质科学现行方案(currprotocproteinsci.)》，第5章:第5.4单元,2001)。昆虫系统可以提供类似于哺乳动物系统的翻译后修饰。

在哺乳动物宿主细胞中，许多表达系统在本领域熟知并且可以商购获得。示例性哺乳动物载体系统包含例如来自英杰公司(invitrogen)的pcep4、prep4和prep7，来自库塞尔公司(crucell)的perc6系统，和如来自英杰公司的plp1等基于慢病毒的系统等。例如，在使用腺病毒作为表达载体的情况下，可以将编码所关注的多肽的序列连接到由晚期启动子和三联前导序列组成的腺病毒转录/翻译复合物中。在病毒基因组的非必需e1或e3区域中的插入可以用于获得能够在感染的宿主细胞中表达多肽的活病毒(logan和shenk，《美国科学院院刊(pnasusa.)》81:3655-3659,1984)。另外，如劳氏肉瘤病毒(rsv)增强子等转录增强子可用于在哺乳动物宿主细胞中增加表达。

有用的哺乳动物宿主细胞系的实例包含由sv40(cos-7，atcccrl1651)转化的猴肾cv1系；人胚胎肾系(被亚克隆以在悬浮培养物中生长的293或293细胞，graham等人，《普通病毒学期刊(j.gen.virol.)》36:59,1977)；幼仓鼠肾细胞(bhk，atccccl10)；小鼠支持细胞(tm4，mather，《生殖生物学(biol.reprod.)》23:243-251,1980)；猴肾细胞(cv1atccccl70)；非洲绿猴肾细胞(vero-76，atcccrl-1587)；人宫颈癌细胞(hela，atccccl2)；犬肾细胞(mdck，atccccl34)；布法罗大鼠肝细胞(brl3a，atcccrl1442)；人肺细胞(w138，atccccl75)；人肝细胞(hepg2，hb8065)；小鼠乳腺肿瘤(mmt060562，atccccl51)；tr1细胞(mather等人，《纽约科学院年鉴(annalsn.y.acad.sci.)》383:44-68,1982)；mrc5细胞；fs4细胞；以及人肝癌细胞系(hepg2)。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包含中国仓鼠卵巢(cho)细胞，其包含dhfr-cho细胞(urlaub等人，《美国科学院院刊(pnasusa.)》77:4216,1980)；和如nso和sp2/0等骨髓瘤细胞系。对于适用于蛋白质生产的某些哺乳动物宿主细胞系的评论，参见，例如，yazaki和wu，《分子生物学方法(methodsinmolecularbiology)》，第248卷(b.k.clo编辑，humana出版社，新泽西州托托瓦市，2003)，第255-268页。某些优选的哺乳动物细胞表达系统包含基于cho和hek293细胞的表达系统。哺乳动物表达系统可以利用附着的细胞系，例如，在t-烧瓶、滚瓶或细胞工厂，或悬浮培养物中，例如，在本领域已知的1l和5l旋转瓶，5l、14l、40l、100l和200l搅拌槽生物反应器中，或20/50l和100/200lwave生物反应器等中。

另外，宿主细胞株可以由于其调节已插入序列的表达或以期望的方式加工所表达的蛋白质而被选择。多肽的这些修饰包含但不限于翻译后修饰，如乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化，或插入非天然存在的氨基酸(一般参见美国专利第7,939,496号；第7,816,320号；第7,947,473号；第7,883,866号；第7,838,265号；第7,829,310号；第7,820,766号；第7,820,766号；第7,7737,226号，第7,736,872号；第7,638,299号；第7,632,924号；和第7,230,068号)。切割蛋白质的“前体原”形式的翻译后加工还可以用于促进正确的插入、折叠和/或功能。除细菌细胞以外，还可以选择如酵母、cho、hela、mdck、hek293和w138等具有或甚至缺乏此类翻译后活性的特定细胞机械和特征机制的不同宿主细胞，以确保正确修饰和加工外来蛋白质。

用于缀合的示例性方法可以使用标准化学、生物化学和/或分子技术进行第一多肽(例如，adi、六聚体多肽)与第二多肽(例如，tnf超家族配体、三聚体多肽)或更多多肽的缀合或偶联。如何使用可获得的本领域公认的方法，并根据本公开内容制备缀合物将是显而易见的。在一些情况下，当偶联缀合物的主要组分时，通常优选的是所采用的技术和所得的连接化学物质基本上不会干扰缀合物的单独组分的期望功能或活性。

在某些实施例中，缀合物是融合多肽或融合蛋白。如本文所述和本领域已知的，在一些情况下，融合多肽在表达系统中表达为重组多肽。融合多肽可以含有多肽序列的一个或多个拷贝，并且可以含有以任何期望的排列存在的基于多肽的所关注试剂的一个或多个拷贝。

对于融合蛋白，编码融合多肽组分和任选的肽连接子组分的dna序列可以单独组装，然后连接到合适的表达载体中。将编码一种多肽组分的dna序列的3'端用或不用肽连接子连接到编码一种或多种其它多肽组分的dna序列的5'端，使得序列的阅读框同相。连接的dna序列可操作地连接到合适的转录或翻译调节元件。负责dna表达的调节元件仅位于编码第一多肽的dna序列的5'端。类似地，结束翻译所需的终止密码子和转录终止信号仅存在于编码最c端多肽的dna序列的3'端。这允许翻译成保留两种组分多肽的生物活性的单一融合多肽。

类似的技术，主要是如启动子、终止密码子和转录终止信号等调节元件的布置可以应用于非融合多肽的重组产生，如用于产生非融合缀合物(例如，化学偶联的缀合物)的多肽。

本公开的多核苷酸和融合多核苷酸可以含有编码多肽序列的核酸的一个或多个拷贝，和/或可以含有编码多肽药剂的核酸的一个或多个拷贝。

在一些实施例中，将编码多肽和/或融合多肽的多核苷酸直接引入宿主细胞中，并在足以诱导一个或多个已编码的多肽的表达的条件下孵育细胞。可以使用本领域技术人员熟知的标准技术并与本文提供的多肽和核酸序列组合来制备本公开的多肽序列。

因此，根据某些实施例，提供了包括编码本文所述的多肽或融合多肽的多核苷酸或融合多核苷酸的重组宿主细胞。多肽或融合多肽在宿主细胞中的表达可以通过在适当条件下培养含有多核苷酸的重组宿主细胞来实现。在通过表达产生一种或多种多肽后，可以使用任何合适的技术分离和/或纯化所述一种或多种多肽，然后根据需要使用。在本文别处描述了示例性多核苷酸、表达载体和宿主细胞。

可以根据本领域已知的多种技术纯化和表征由重组细胞产生的多肽，例如，融合多肽。用于进行蛋白质纯化和分析蛋白质纯度的示例性系统包含快速蛋白质液相色谱(fplc)(例如，akta和bio-radfplc系统)、高效液相色谱(hplc)(例如，beckman和watershplc)。用于纯化的示例性化学反应包含本领域已知的离子交换色谱(例如，q、s)、尺寸排阻色谱、盐梯度、亲和纯化(例如，ni、co、flag、麦芽糖、谷胱甘肽、蛋白质a/g)、凝胶过滤、反相、陶瓷离子交换色谱和疏水相互作用柱(hic)等。

在一些实施例中，缀合物是非融合多肽，例如，通过将第一多肽(例如，adi、六聚体多肽)化学连接或偶联到第二多肽(例如，tnf超家族配体、三聚体多肽)或更多多肽而产生的缀合物。所采用的特定偶联化学将取决于多肽的结构、生物活性剂内多个官能团的潜在存在、保护/去保护步骤的需求、药剂的化学稳定性等，并容易由本领域技术人员确定。用于制备本公开的缀合物的说明性偶联化学可见于例如wong(1991)，“《蛋白质缀合和交联的化学(chemistryofproteinconjugationandcrosslinking)》”，crc出版社，佛罗里达州波卡拉顿市；以及brinkley，“《用染料、半抗原和交联试剂制备蛋白质偶联物的方法的简要概述(abriefsurveyofmethodsforpreparingproteinconjugateswithdyes,haptens,andcrosslinkingreagents)》”，《生物缀合化学(bioconjug.chem.)》，3:2013,1992。优选地，由于采用了缀合技术，例如相对于未缀合多肽，缀合物的结合能力和/或活性基本上未降低。

在某些实施例中，第一多肽(例如，adi、六聚体多肽)直接或间接地偶联到第二多肽(例如，tnf超家族配体、三聚体多肽)。当每个所关注多肽具有能够与另一个多肽反应的取代基时，两个所关注多肽之间可能发生直接反应。例如，一个多肽上的亲核基团，如氨基或巯基可以能够与另一个多肽上的含羰基的基团(如酸酐或酰卤)或含有良好离去基团的烷基(例如，卤化物)反应。

替代性地，如本文所述，可能需要通过如本文所述的连接子基团，包含如本文所述的非肽连接子和肽连接子，间接偶联第一多肽(例如，adi、六聚体多肽)和第二多肽(例如，tnf超家族配体、三聚体多肽)。连接子基团还可以充当间隔子以使第一多肽和第二多肽间隔开，以避免干扰键合能力、靶向能力或其它功能。连接子基团还可以用于提高多肽上取代基的化学反应性，从而提高偶联效率。化学反应性的提高还可以促进药剂或药剂上的官能团的使用，否则这是不可能的。连接基团的实例包含例如二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。在其它说明性实施例中，缀合物包含连接基团，如美国专利第5,208,020号或欧洲专利0425235b1以及chari等人，《癌症研究(cancerresearch.)》52:127-131,1992中公开的连接基团。本文描述了另外的示例性连接子。

在某些示例性实施例中，包括琥珀酰亚胺酯官能团的多肽与包括氨基的多肽之间反应形成酰胺键；包括氧羰基咪唑基官能团的多肽与包括氨基的多肽之间反应形成氨基甲酸酯键；包括对硝基苯基碳酸酯官能团的多肽与包括氨基的多肽之间反应形成氨基甲酸酯键；包括三氯苯基碳酸酯官能团的多肽与包括氨基的多肽之间反应形成氨基甲酸酯键；包括硫代酯官能团的多肽与包括氨基的多肽之间反应形成氨基甲酸酯键；包括丙醛官能团的多肽与包括氨基的多肽之间反应形成仲胺键。

在一些示例性实施例中，包括丁醛官能团的多肽与包括氨基的多肽之间反应形成仲胺键；包括缩醛官能团的多肽与包括氨基的多肽之间反应形成仲胺键；包括哌啶酮官能团的多肽与包括氨基的多肽之间反应形成仲胺键；包括甲基酮官能团的多肽与包括氨基的多肽之间反应形成仲胺键；包括三氟乙基磺酸酯官能团的多肽与包括氨基的多肽之间反应形成仲胺键；包括马来酰亚胺官能团的多肽与包括氨基的多肽之间反应形成仲胺键；包括醛官能团的多肽与包括氨基的多肽之间反应形成仲胺键；并且包括肼官能团的多肽与包括羧酸基的多肽之间反应形成仲胺键。

在特定示例性实施例中，包括马来酰亚胺官能团的多肽与包括硫醇基的多肽之间反应形成硫醚键；包括乙烯基砜官能团的多肽与包括硫醇基的多肽之间反应形成硫醚键；包括硫醇官能团的多肽与包括硫醇基的多肽之间反应形成二硫键；包括正吡啶基二硫化物官能团的多肽与包括硫醇基的多肽之间反应形成二硫键；并且包括碘乙酰胺官能团的多肽与包括硫醇基的多肽之间反应形成硫醚键。

在具体实施例中，胺-巯基交联剂用于制备缀合物。在一个优选实施例中，例如，交联剂是琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(smcc)(赛默科技(thermoscientific))，其是在中等长度的环己烷稳定的间隔臂(8.3埃)的相对端处含有nhs-酯和马来酰亚胺反应性基团的巯基交联剂。smcc是不可裂解且膜可渗透的交联剂，所述交联剂可以用于创造巯基反应性马来酰亚胺活化剂(例如，多肽)，用于随后与缀合物的组分进行反应。nhs酯在ph7-9下与伯胺反应形成稳定的酰胺键。马来酰亚胺与ph6.5-7.5下的巯基反应形成稳定的硫醚键。因此，smcc的胺反应性nhs酯与多肽的伯胺快速交联，然后所得的巯基反应性马来酰亚胺基可与另一个多肽的半胱氨酸残基反应，以产生特定所关注缀合物。

在某些具体实施例中，多肽被修饰以含有暴露的巯基以促进交联，例如以促进与马来酰亚胺活化的多肽的交联。在一些具体实施例中，用修饰伯胺的试剂修饰多肽以添加受保护的硫醇巯基。在一些实施例中，试剂n-琥珀酰亚胺基-s-乙酰基硫代乙酸酯(sata)(赛默科技)用于产生硫醇化多肽。

在某些实施例中，马来酰亚胺活化的多肽在合适的条件下与硫醇化多肽反应以产生缀合物。应当理解，通过在这些反应中操纵smcc、sata、药剂和多肽的比例，可能产生具有不同化学计量、分子量和性质的缀合物。

在一些说明性实施例中，使用如n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)、琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基四氢噻吩(it)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如己二亚氨盐二甲酯hcl)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺)、醛(如戊二醛)、双-叠氮基化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮基衍生物(如双-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)等双功能蛋白偶联剂制备缀合物。特定的偶联剂包含n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)(carlsson等人，《生物化学期刊(biochem.j.)》173:723-737[1978])和n-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶硫基)戊酸酯(spp),以提供二硫键。

本文讨论的具体交联策略仅是可用于产生本文所述的缀合物的合适缀合策略的许多实例中的一些实例。本领域技术人员将显而易见的是，可以采用多种其它双功能或多功能试剂，包括同功能和异功能试剂(如在伊利诺伊州罗克福德市皮尔斯化学公司(piercechemicalco.)的目录中描述的试剂)作为连接子基团。偶联可能例如通过氨基、羧基、巯基或氧化的碳水化合物残基而受到影响。有许多参考文献描述了此类方法，例如，rodwell等人的美国专利第no.4,671,958号。

缀合物还可以通过各种“点击化学”技术制备，包含模块化、范围广、产率非常高的反应，主要产生可以通过非色谱方法除去并且可以是立体特异性的但不一定是对映选择性的无害副产物(参见kolb等人，《德国应用化学会刊(angewchemintedengl.)》40:2004-2021,2001)。特定实例包含采用叠氮化物和炔烃的huisgen1,3-偶极环加成的缀合技术，还称为“叠氮化物-炔烃环加成”反应(参见hein等人，《药物研究(pharmres.)》25:2216-2230,2008)。叠氮化物-炔烃环加成反应的非限制性实例包含铜催化的叠氮化物-炔烃环加成(cuaac)反应和钌催化的叠氮化物-炔烃环加成(ruaac)反应。

cuaac在较广的温度范围内工作，对水性条件不敏感，ph范围为4到12，并且耐受宽范围的官能团(参见himo等人，《美国化学会志(jamchemsoc.)》127:210-216,2005)。活性cu(i)催化剂可以例如使用抗坏血酸钠作为还原剂从cu(i)盐或cu(ii)盐中产生。这种反应形成1,4-取代的产物，使其具有区域特异性(参见hein等人，同上)。

ruaac利用能够催化叠氮化物到末端炔烃的环加成的五甲基环戊二烯基氯化钌[cp*rucl]络合物，区域选择性地产生1,5-二取代的1,2,3-三唑(参见rasmussen等人，《有机化学通讯(org.lett.)》9:5337-5339,2007)。另外，与cuaac相反，ruaac还可以与内部炔烃一起使用以提供完全取代的1,2,3-三唑。

如本文所述，任何一种或多种融合或非融合技术可以用于制备缀合物。

使用方法和组合物

还包含使用本文所述的缀合物治疗有需要的受试者的方法，以及包括缀合物的组合物。例如，某些实施例包含在有需要的受试者中治疗癌症、改善癌症症状或抑制癌症进展的方法，包括向受试者施用本文所述的缀合物或包括所述缀合物的组合物。

本文所述的方法和组合物可以用于治疗任何种类的癌症。在一些实施例中，癌症选自以下中的一个或多个：肝细胞癌(hcc)、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、间皮瘤、淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、淋巴瘤、肝癌、肉瘤、白血病、急性髓性白血病、复发性急性髓性白血病、b细胞恶性肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、胃癌、胶质瘤(例如，星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤或脉络丛乳头状瘤)、多形性胶质母细胞瘤(例如，巨细胞胶质母细胞瘤或胶质肉瘤)、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原发性cns淋巴瘤、原始神经外胚层肿瘤(成神经管细胞瘤)、非小细胞肺癌(nsclc)、肾癌、膀胱癌、子宫癌、食道癌、脑癌、头颈癌、宫颈癌、睾丸癌和胃癌。

在一些实施例中，癌症表现出精氨基琥珀酸合成酶-1(ass-1)的表达和/或活性的降低，或者是精氨基琥珀酸合成酶-1缺陷的表达和/或活性的降低。在这些和相关实施例的一些实施例中，癌症是adi敏感的或基本上是adi敏感的。在一些情况下，ass-1表达或活性的降低是表达和/或活性相对于合适的对照样品(例如，正常细胞或组织)中的表达和/或活性降低约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或更多。在某些实施例中，ass或asl表达或活性相对于对照样品中的表达或活性降低至少两倍。

在一些实施例中，癌症表现出精氨基琥珀酸合成酶-1(ass-1)的正常或提高的表达和/或活性。在这些和相关实施例的某些实施例中，癌症是adi抗性的或基本上adi抗性的，或adi不敏感的。

ass-1表达或活性可以根据本领域的常规技术测量，包含例如，定量pcr、免疫组织化学、蛋白免疫印迹、酶活性测定(例如，用于测量瓜氨酸转化为精氨基琥珀酸盐或精氨基琥珀酸盐转化为精氨酸和富马酸盐的adi活性测定法)等。

在一些实施例中，本文所述的方法或组合物将患者的中位生存期增加4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、15周、20周、25周、30周、40周或更长时间。在某些实施例中，本文所述的方法或组合物将患者的中位生存期增加1年、2年、3年或更长时间。在一些实施例中，本文所述的方法或组合物将无进展生存期增加2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间。在某些实施例中，本文所述的方法或组合物将无进展生存期增加1年、2年、3年或更长时间。

在某些实施例中，施用的组合物足以使肿瘤消退，如肿瘤存活量的统计学显著降低所示，例如，肿瘤质量降低至少10％、20％、30％、40％、50％或更多，或如改变的(例如，具有统计显著性的降低)扫描尺寸所示。在某些实施例中，施用的组合物足以导致稳定的疾病。在某些实施例中，施用的组合物足以导致熟练的临床医生已知的特定疾病适应症的症状的稳定或临床相关性的减轻。

用于治疗癌症的方法或组合物可以与其它治疗方式结合。例如，本文所述的组合物可以在其它治疗性干预之前、期间或之后施用于受试者，包含对症护理、化学疗法、放射疗法、手术、移植、激素疗法、光动力疗法、抗生素疗法或其任何组合。对症护理包含施用皮质类固醇，以减轻脑水肿、头痛、认知功能障碍和呕吐，以及施用抗惊厥药，以减少癫痫发作。放射治疗包含全脑照射、分次放射治疗和如立体定向放射外科治疗等放射外科治疗，其可以进一步与传统手术相结合。

用于鉴定患有本文所述的一种或多种疾病或病症的受试者的方法是本领域已知的。

对于体内用途，例如，对于治疗人类疾病或测试，本文所述的缀合物通常在施用前掺入到一种或多种药物或治疗组合物中。在一些实例中，药物或治疗组合物包括与生理学上可接受的载剂或赋形剂组合的一种或多种本文所述的缀合物。

为了制备药物或治疗组合物，将有效或期望量的一种或多种缀合物与本领域技术人员已知的任何一种或多种药物载剂或赋形剂混合，以适合于特定缀合物和/或施用方式。药物载剂可以是液体、半液体或固体。用于肠胃外、皮内、皮下或局部施用的溶液或悬浮液可以包含，例如，无菌稀释剂(如水)、盐水溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水；pbs)、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂(如苯甲醇和对羟基苯甲酸甲酯)；抗氧化剂(如抗坏血酸和亚硫酸氢钠)和螯合剂(如乙二胺四乙酸(edta))；缓冲剂(如乙酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐)。如果静脉内施用(例如，通过iv输注)，则合适的载剂包含生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(pbs)，以及含有如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇和其混合物的增稠剂和增溶剂的溶液。

在某些方面，组合物的ph接近生理ph或约ph7.4，包含约ph6.5、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.5或其任何范围。在具体实施例中，组合物具有一种或多种以下纯度测定：通过sechplc测定，小于约1eu内毒素/mg蛋白、小于约100ng宿主细胞蛋白/mg蛋白、小于约10pg宿主细胞dna/mg蛋白和/或大于约95％单峰纯度。

可通过各种不同途径实现施用，包含口服、肠胃外、鼻内、静脉内、皮内、肌肉内、鞘内、皮下、舌下、口腔、直肠、阴道和局部。优选的施用方式取决于待治疗或预防的病症的性质。特定实施例包含通过iv输注施用。

载剂可以包含，例如，在所采用的剂量和浓度下，对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒的药物上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。生理学上可接受的载剂通常是含水ph缓冲溶液。生理学上可接受的载剂的实例包含如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸等缓冲液；包含抗坏血酸的抗氧化剂；低分子量(少于约10个残基)的多肽；如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质；如聚乙烯吡咯烷酮等亲水聚合物；如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸等氨基酸；包含葡萄糖、甘露糖、或糊精的单糖、二糖和其它碳水化合物；如edta等螯合剂；如甘露醇或山梨醇等糖醇；如钠等成盐抗衡离子；和/或如聚山梨醇酯20(tween^tm)聚乙二醇(peg)和泊咯沙姆(pluronics^tm)等非离子表面活性剂。

在一些实施例中，在胶体药物递送系统中(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中，可以例如通过凝聚技术或通过界面聚合(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基-甲基丙烯酸酯)微胶囊)将一种或多种缀合物包埋在制备的微胶囊中。此类技术在《雷明顿药物科学(remington'spharmaceuticalsciences)》，第16版，osloa.编辑，(1980)中公开。一种或多种颗粒或脂质体可以进一步包括其它治疗剂或诊断剂。

因此，施用这些和相关药物组合物的典型途径包含但不限于口服、局部、透皮、吸入、肠胃外、舌下、口腔、直肠、阴道和鼻内。本文所使用的术语肠胃外包含皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内注射或输注技术。某些药物或治疗组合物被配制成允许在将组合物施用给患者时其中含有的有效成分是生物可利用的。将施用于受试者或患者的组合物可以采取一个或多个剂量单位的形式，其中例如，片剂可以是单剂量单位，并且本文所述的气雾剂形式的缀合物的容器可以容纳多个剂量单位。制备这种剂型的实际方法对于本领域技术人员来说是已知的、或者是显而易见的；例如，参见《雷明顿：药学技术与实践(thescienceandpracticeofpharmacy》，第20版(费城医药科学学院，2000)。待施用的组合物通常含有治疗有效量的本文所述的缀合物，用于治疗所关注疾病或病症。

药物或治疗组合物可以是固体或液体形式。在一个实施例中，一种或多种载剂是颗粒状的，使得组合物是例如片剂或粉末形式。一种或多种载剂可以是液体，而组合物是例如，口服油、可注射液体或气雾剂，其可用于例如，吸入施用。当用于口服施用时，药物组合物优选为固体或液体形式，其中半-固体、半-液体、悬浮液和凝胶形式包含在本文所述的为固体或液体的形式中。

作为用于口服施用的固体组合物，可以将药物组合物配制成粉末、颗粒、压缩片剂、丸剂、胶囊、口香糖、薄片等。这种固体组合物通常含有一种或多种惰性稀释剂或可食用载剂。此外，可能存在以下一种或多种：如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶等粘合剂；如淀粉、乳糖或糊精等赋形剂，如海藻酸、海藻酸钠、羧甲基淀粉钠、玉米淀粉等崩解剂；如硬脂酸镁或氢化蓖麻油等润滑剂；如胶体二氧化硅等助流剂；如蔗糖或糖精等甜味剂；如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味品等调味剂；以及着色剂。当药物组合物为胶囊形式时，例如，明胶胶囊，除了上述类型的物质外，所述药物还可以含有如聚乙二醇或油等液体载剂。

药物或治疗组合物可以是液体形式，例如，酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。作为两个实例，液体可以用于口服施用或通过注射递送。当用于口服施用时，除本发明化合物外，优选的组合物还含有一种或多种甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和增味剂。在旨在通过注射施用的组合物中，可以包含表面活性剂、防腐剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。

液体药物或治疗组合物，无论其是溶液、悬浮液或其它类似形式，可以包含一种或多种以下佐剂：如注射用水、盐水溶液、优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠等无菌稀释剂，如可用作溶剂或悬浮培养基的合成甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂等固定油；如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯等抗菌剂；如抗坏血酸或亚硫酸氢钠等抗氧化剂；如乙二胺四乙酸等螯合剂；如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐等缓冲剂，以及如氯化钠或葡萄糖等用于调节张力的药剂。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。生理盐水是优选佐剂。可注射药物组合物优选地是无菌的。

用于肠胃外或口服施用的液体药物或治疗组合物应含有一定量的缀合物，以便获得合适的剂量。通常，这个量为组合物中所关注缀合物的至少0.01％。当用于口服施用时，这个量可以在0.1％到约70％的组合物重量之间变化。某些口服药物组合物含有约4％到约75％的所关注缀合物。在某些实施例中，制备药物组合物和制剂，使得肠胃外剂量单位在稀释前含有0.01％到10％的所关注缀合物重量。

药物组合物可以旨在用于局部施用，在这种情况下，载剂可以适当地包括溶液、乳剂、乳膏或凝胶基质。例如，基质可以包括以下一种或多种：矿脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、如水和醇等稀释剂、以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可以存在于用于局部施用的药物组合物中。如果用于透皮施用，则所述组合物可以包含透皮贴剂或离子电渗疗法装置。

药物组合物可以用于例如栓剂形式的直肠施用，其将在直肠中融化并释放药物。用于直肠施用的组合物可以含有作为合适的无刺激性赋形剂的油性基质。此类基质包含但不限于羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。

药物组合物可以包含各种材料，这些材料改变固体或液体剂量单位的物理形式。例如，组合物可以包含在活性成分周围形成包衣壳的材料。形成包衣壳的材料通常是惰性的，并且可以选自例如，糖、虫胶和其它肠溶包衣剂。替代性地，可以将活性成分包裹在明胶胶囊中。固体或液体形式的药物组合物可以包含结合到缀合物的组分，从而有助于缀合物的递送。可以以这种能力起作用的合适组分包含单克隆或多克隆抗体、一种或多种蛋白质或脂质体。

药物组合物可以基本上由剂量单位组成，其可以作为气雾剂施用。术语气雾剂用于表示从胶体性质的系统到由加压包装组成的系统的各种系统。可以通过液化或压缩气体或通过分配活性成分的合适泵系统进行递送。气雾剂可以以单相、双-相或三-相系统递送，以递送一种或多种活性成分。气雾剂的递送包含必要的容器、活化剂、阀门、子容器等，这些可以一起形成试剂盒。本领域普通技术人员无需过多实验即可确定优选的气雾剂。

本文所述的组合物可以用保护缀合物不会从身体中快速消除(如定时释放调配物或包衣)的载剂制备。此类载剂包含控释调配物，如但不限于植入物和微囊化递送系统，和可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚乳酸以及本领域普通技术人员已知的其它物质。

药物组合物可以通过制药领域熟知的方法制备。例如，用于通过注射施用的药物组合物可以包括一种或多种盐、缓冲剂和/或稳定剂，并与无菌蒸馏水一起形成溶液。可以加入表面活性剂以促进均相溶液或悬浮液的形成。表面活性剂是与缀合物非共价相互作用的化合物，以促进缀合物在含水递送系统中的溶解或均匀悬浮。

组合物可以以治疗有效量施用，其将根据多种因素而变化，包含所用的特定化合物的活性；化合物的代谢稳定性和作用时间；患者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；施用方式和时间；排泄率；药物组合；特定障碍或病症的严重程度；以及受试者正在接受的治疗。

精确的剂量和治疗持续时间是所治疗疾病的函数，并且可以使用已知的测试方案凭经验确定，或者通过在本领域已知的模型系统中测试组合物并从中推断。也可以进行受控的临床试验。剂量也可以随着要缓解的病症的严重程度而变化。通常配制和施用药物组合物以发挥治疗上有用的效果，同时最小化不希望的副作用。所述组合物可以一次施用，或者可以分成许多较小的剂量而每隔一段时间施用。对于任何特定受试者，可根据个体需要随时间调整特定剂量方案。

在一些实施例中，本文所述的组合物的治疗有效量或治疗剂量是有效降低或稳定肿瘤生长的量。在某些情况下，用小剂量开始治疗，然后可以小幅增加所述小剂量，直到达到这种情况下的最佳效果。在一些情况下，治疗有效日剂量(对于70kg哺乳动物)为约0.001mg/kg(即，约0.07mg)到约100mg/kg(即，约7.0g)；优选地，治疗有效剂量(对于70kg哺乳动物)为约0.01mg/kg(即，约0.7mg)到约50mg/kg(即，约3.5g)；更优选地，治疗有效剂量(对于70kg哺乳动物)为约1mg/kg(即，约70mg)到约25mg/kg(即，约1.75g)。

在一些实施例中，剂量从约每天施用一次到约每两周或三周施用一次。例如，在某些实施例中，剂量为约每1、2、3、4、5、6或7天施用一次，或约每周施用一次，或约每周两次，或约每周三次，或约每两周或三周一次。

在一些实施例中，剂量为约0.1mg/kg到约20mg/kg，或到约10mg/kg，或到约5mg/kg，或到约3mg/kg。在一些实施例中，剂量为约0.10mg/kg、0.15mg/kg、0.20mg/kg、0.25mg/kg、0.30mg/kg、0.35mg/kg、0.40mg/kg、0.45mg/kg、0.50mg/kg、0.55mg/kg、0.60mg/kg、0.65mg/kg、0.70mg/kg、0.75mg/kg、0.80mg/kg、0.85mg/kg、0.90mg/kg、0.95mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、3.0mg/kg、3.5mg/kg、4.0mg/kg、4.5mg/kg、5.0mg/kg、5.5mg/kg、6.0mg/kg、6.5mg/kg、7.0mg/kg、7.5mg/kg、8.0mg/kg、8.5mg/kg、9.0mg/kg、9.5mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg或20mg/kg，包括其间的所有整数和范围。在具体实施例中，剂量为每周一次静脉注射2ml约1mg/kg到每3天一次约20mg/kg。

还包含包括一种或多种本文所述的缀合物或组合物的患者护理试剂盒。某些试剂盒还包括一种或多种药学上可接受的稀释剂或溶剂，如水(例如无菌水)。在一些实施例中，缀合物储存在小瓶、盒、双室注射器和/或预填充混合系统中。

本文的试剂盒还可以包含一种或多种附加的治疗剂(例如，缀合物)或其它适合于或期望用于正在治疗的适应症或用于期望的诊断应用的组分。本文的试剂盒还可以包含一个或多个注射器或其它促进预期递送模式所需或期望的组分(例如，支架、可植入的贮库等)。

本说明书中引用的所有出版物、专利申请和发布的专利均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利申请或发布的专利被明确且单独地指明通过引用并入一样。

尽管上述发明已经出于清楚理解的目的通过说明和举例的方式进行了一些详细描述，但是根据本公开的教导，对于本领域普通技术人员而言应当容易了解到，可以在不偏离随附权利要求书的精神或范围的情况下对本发明进行某些改变和修改。以下实例仅通过说明的方式而非限制的方式提供。本领域的技术人员应当容易识别可以被改变或修改以产生基本上类似的结果的各种非关键参数。

实例

实例1

adi-peg20和trail的组合

通过用adi-peg20(用k112e和p210s取代修饰的、来自人型支原体的聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶)、人rhtrail或其组合处理各种癌细胞系来测试adi增加trail抗癌活性的能力，并且在一些情况下反之亦然。所述细胞测定如实例1中所描述的进行。

adi敏感(大多数ass1表达低或检测不到)癌细胞系的结果如下表e1所示。

这些结果说明在多种癌细胞系的细胞杀伤中，相对于单独的adi-peg20和/或rhtrail，adi-peg20与rhtrail组合之间的协同或加和作用。这些结果还说明adi-peg20增强了rhtrail在以其它方式对rhtrail具有抗性的癌细胞系中的活性。在多种癌细胞系中观察到显著或协同增加的细胞杀伤活性，包含乳腺癌细胞、伯基特淋巴瘤细胞、结肠癌细胞、胶质母细胞瘤癌细胞、白血病细胞、黑色素瘤癌细胞、非小细胞肺癌(nsclc)细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞和肾癌细胞。

图1a-1d进一步说明了相对于单独的adi-peg20和/或rhtrail，adi-peg20和rhtrail组合对各种癌细胞系的相对活力的协同作用。图1a示出了hct116结肠癌细胞系的协同作用，图1b示出了caki-1肾癌细胞系的协同作用，图1c示出了achn肾癌细胞系的协同作用，并且图1d示出了a375黑色素瘤细胞系的协同作用。

图2a-2c表明了与rajiburkitt淋巴瘤细胞系中单独的每种药剂相比，adi-peg20和rhtrail对半胱天冬酶3/7活化(图2a)、细胞死亡诱导(图2b)以及未致力于细胞凋亡的活细胞百分比降低(半胱天冬酶3/7未活化的细胞；图2c)的协同作用。在用检测活化的半胱天冬酶3/7和死亡细胞的荧光试剂(来自赛默飞世尔科技(thermofisherscientific)的cellevent半胱天冬酶3/7试剂盒)染色后，通过流式细胞术分析测定死亡细胞或具有和不具有活化的半胱天冬酶3/7的细胞的百分比。

下表e2中示出了抗adi的(ass1的相对高表达)癌细胞系的结果。

表e2中的结果示出在某些抗adi细胞系中，adi-peg20不一定增强rhtrail的癌细胞杀伤活性(由于高ass1)(反之亦然)。然而，在一些抗adi癌细胞系中(例如，mda-mb-453和h1975，其中adi具有至少某种最小活性)，adi-peg20和rhtrail的组合相对于单独的adi-peg20和/或trail在癌细胞杀伤活性方面表现出协合作用、增强作用和/或相互作用。实例2和3示出了adi的一些生物活性，这些生物活性可能有助于adi增强或协同trail的能力。

实例2

adi-peg20上调dr5受体

为了探索adi增加或增强rhtrail活性的潜在机制，在用adi-peg20处理癌细胞系后，通过流式细胞术测量dr4和dr5受体的表达。

实验工作流程由细胞处理、收集和用可固定的存活/死亡染色剂(赛默飞世尔)染色，以及抗体在冰上识别trail受体30分钟组成。然后用多色流式细胞仪洗去未掺入的存活/死亡染料和未结合的抗体并进行分析。存活/死亡染色剂和抗体用在流式细胞仪的不同通道中检测到的不同荧光团标记。同型对照抗体用于评估和控制非特异性结合。受体表达在单线态和活细胞门控的细胞群中进行分析。

图3a-3d示出在panc-1、jurkat、raji、k562、o-786、achn、caki-1、caki-2、wm-115和hct116细胞系中dr5受体的表达通过adi-peg20上调。在这些细胞系中dr4受体的表达较低或检测不到，并且没有明显受到adi-peg20处理的影响。

实例3

adi-peg20下调存活蛋白

图4表明了adi敏感细胞系用adi-peg20处理后存活蛋白水平降低。存活蛋白已被证明能阻止trail的活性。因此，降低存活蛋白水平(连同dr5上调)可能有助于adi增强和/或增加癌细胞系中trail的凋亡活性的能力。

实例4

adi和trail的缀合物

来自鸽支原体的精氨酸脱亚胺酶(adi)与人tnf相关凋亡诱导配体(trail)的胞外结构域(残基114-281)之间的融合蛋白根据常规技术克隆、表达和纯化，然后针对抗癌活性对其进行测试。下表e3提供了测试的adi-trail融合蛋白的总结。

另外，来自其它六聚体物种和其交换结构域的adi用于利用ggggs连接子(seqidno:76)制备含有人trail(aa114-281)的融合蛋白。下表e4提供了所产生的六聚体adi-trail融合蛋白以及作为adi-trail融合蛋白的一部分的adi六聚体的活性的总结。

为了评估融合蛋白对癌细胞生长、活力和凋亡诱导的作用，将各种癌细胞系接种在96孔板中并暴露于融合蛋白。在接种后立即处理悬浮细胞系，同时使贴壁细胞附着过夜，然后向培养物中加入研究性蛋白质处理剂。

通过将来自测试样品的细胞活力信号除以未处理对照的细胞活力信号来计算相对细胞活力。用检测活细胞的试剂(如刃天青或celltiter-glo(普洛麦格(promega)))测定、并用酶标仪(比色、荧光或发光信号)测量细胞活力。对于细胞凋亡，使用普洛麦格的半胱天冬酶3/7glo试剂和酶标仪的发光读数来评估半胱天冬酶3/7活化。半胱天冬酶3/7活化和细胞活力还通过用检测活化的半胱天冬酶3/7和死亡细胞的荧光试剂(来自赛默飞世尔科技的cellevent半胱天冬酶3/7试剂盒)染色的细胞的流式细胞术分析来评估。

图5描绘了示例性adi-trail或trail-adi融合蛋白示意图。

图6a-6c示出了相对于单独的rhtrail、单独的m.col.adi和作为单独多肽的rhtrail和m.col.adi的组合，示例性m.col.adi-trail融合多肽与l1连接子(见表e3)对抗adi的colo205癌细胞系中半胱天冬酶3/7诱导(图6a)和相对细胞活力(图6b和6c)的作用。在该细胞系(高ass1表达)中，adi不具有显着活性，并且癌细胞杀伤活性归因于adi-trail融合多肽的trail组分。

图7a-7c示出了相对于单独的rhtrail、单独的m.col.adi以及作为单独多肽的rhtrail和m.col.adi的组合，示例性m.col.adi-trail融合多肽与l1连接子(见表e3)对adi敏感的hct116肿瘤细胞系中半胱天冬酶3/7诱导(图7a)和相对细胞活力(图7b和7c)的作用。

图8a-8b示出了相对于单独的rhtrail、单独的m.col.adi和作为单独多肽的rhtrail和m.col.adi的组合，示例性m.col.adi-trail融合多肽与l1连接子(见表e3)对adi敏感的jurkat肿瘤细胞系中半胱天冬酶3/7诱导(图8a)和相对细胞活力(图8b)的作用。图9a-9d示出了来自表e3的示例性m.col.adi-trail融合多肽对抗adi的colo205癌细胞系中半胱天冬酶3/7诱导(图9a和9b)和相对细胞活力(图9c和9d)的作用。图10a-10c示出了来自表e3的示例性m.col.adi-trail融合多肽对adi敏感的hct116细胞系中半胱天冬酶3/7诱导(图10a)和相对细胞活力(图10b-10c)的作用。图11a-11b示出了来自表e3的示例性m.col.adi-trail融合多肽对adi敏感的jurkat细胞系中半胱天冬酶3/7诱导(图11a)和相对细胞活力(图11b)的作用。

图9-11示出了来自表e1的示例性m.col.adi-trail融合多肽在adi敏感和抗adi的三种不同细胞系中具有相似的活性。

下表e5总结了在抗adi的colo205细胞系和adi敏感的hct116细胞系中半胱天冬酶3/7诱导和相对细胞活力降低的情况下来自表e4的示例性adi-trail融合多肽的ic50值。这些数据表明示例性adi-trail融合多肽具有相似的活性。

图12a-12c示出了在m.col.adi(k192c或k287c)中具有一个或多个点突变的示例性m.col.adi-trail融合多肽(包含非聚乙二醇化的和用2k或20kpeg聚乙二醇化的m.col.adi-trail融合多肽)对抗adi的colo205细胞系中半胱天冬酶3/7诱导(图12a)和相对细胞活力(图12b-12c)的作用。图13a-13c示出了在m.col.adi(k192c或k287c)中具有点突变的示例性m.col.adi-trail融合多肽(包含非聚乙二醇化的和用2k或20kpeg聚乙二醇化的m.col.adi-trail融合多肽)对adi敏感的hct116细胞系中半胱天冬酶3/7诱导(图13a)和相对细胞活力(图13b-13c)的作用。上述聚乙二醇化构建体与非聚乙二醇化构建体中adi酶活性相似。

图14a-14c示出了示例性trail-m.col.adi与m.col.adi-trail融合多肽对抗adi的colo205细胞系中半胱天冬酶3/7诱导(图14a)和相对细胞活力(图14b-14c)的作用。因为这种colo205细胞系对adi活性具有抗性，所以观察到的半胱天冬酶3/7活化和随后的活力降低是由于trail部分的促细胞凋亡活性。如图14a-14c所示，trail-m.col.adi融合蛋白与m.col.adi-trail融合蛋白相比，trail活性有所提高(约2倍)。

图15a-15c示出了示例性trail-m.col.adi与m.col.adi-trail融合多肽对adi敏感的hct116细胞系中半胱天冬酶3/7诱导(图15a)和相对细胞活力(图15b-15c)的作用。在这种细胞系中，这两种融合蛋白在诱导半胱天冬酶介导的细胞凋亡方面具有相同的效力。adi和trail在hct116细胞系中是协同的。从该实验和其它实验(数据未显示)来看，adi可以将trail效用增强到一定水平，并且adi和trail的组合效用不会受到trail部分的效力微小变化的显著影响。换句话说，已经观察到adi与较低效trail制剂的更强协同作用，并且所述组合效用具有一定的阈值，即使在trail的最优或次优制剂的情况下所述组合效用也会达到所述阈值。

图16a-16b示出了静脉施用单剂量30mg/kg后，m.col.adi-trail在cd-1小鼠血清中随时间的pk曲线。在单次注射融合蛋白后，在cd-1小鼠的血清中测量m.col.adi-trail蛋白水平(图16a-16b)、精氨酸水平和瓜氨酸水平(图16a)以及针对融合蛋白m.col.adi-trail以及其组分m.col.adi和rhtrail(图16b)的抗体滴度。

血清中融合蛋白的浓度通过elisa(图16a-16b)进行评估。还评估了血清样品中adi和trail部分的生物活性，并根据掺入幼稚血清的标准测定了生物活性蛋白的浓度。生物活性蛋白(基于adi和trail活性)的浓度与通过elisa法测定的总adi-trail蛋白非常相似。

图17a-17f表明了m.col.adi-trail在hct116异种移植模型中的功效。为雌性无胸腺裸小鼠皮下接种hct116细胞。接种后第7天，将小鼠随机分入处理组(各组之间具有相似的起始肿瘤体积)，并通过静脉注射施用rhtrail、m.col.adi、m.col.adi-trail融合蛋白或媒剂对照(pbs缓冲液)。每天使用rhtrail进行处理，连续5天(肿瘤植入后第7-11天)。在肿瘤植入后第7天和第15天注射m.col.adi和m.col.adi-trail融合蛋白。融合蛋白未引起任何明显的体重减轻(图17a)，并且能够减少肿瘤生长(图17b-17f)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。通过双向anova评估了与媒剂处理对照组相比融合蛋白处理组中肿瘤减少的统计显著性。

如图18a-18b所示，血清m.col.adi-trail与肿瘤体积呈负相关。通过elisa(总蛋白)和生物测定(活性蛋白)测量的融合蛋白浓度彼此相似。肿瘤植入后第21天和第28天提取血清。检测到的血清总融合蛋白在两个时间点之间相关。图18d中示出了这些血清样品中的精氨酸和瓜氨酸水平。与m.col.adi-trail组相比，m.col.adi组血清中瓜氨酸水平更高，精氨酸水平更低。这可能是因为融合蛋白由于其trail部分而定位于肿瘤部位，从而降低了其血清水平。肿瘤体积与血清m.col.adi-trail之间的反向相关性支持该假设。

图19表明了用m.col.adi-trail处理后hct116异种移植模型中的剂量依赖性肿瘤生长减少。为雌性无胸腺裸小鼠皮下接种hct116细胞。接种后第9天，将小鼠随机分入处理组(各组之间具有相似的起始肿瘤体积)，并通过静脉注射施用m.col.adi-trail融合蛋白或媒剂对照(pbs缓冲液)。m.col.adi-trail剂量组如下：90mg/kg、30mg/kg、10mg/kg和5mg/kg。前三组仅在肿瘤植入后第9天给药，5mg/kg组在肿瘤植入后第9天和第12天给药。

双向anova分析揭示了m.col.adi-trail处理后肿瘤体积减少的统计显著性。处理组与媒剂对照相比p值如下：

第12天：10mg/kg组、30mg/kg组和90mg/kg组，p<0.0001；5mg/kg组，p＝0.0001。

第14天：所有组，p<0.0001

第16天：所有组，p<0.0001

在第16天(处理开始后第7天)，高剂量组与低剂量组之间也存在统计学上显著的差异：

·90mg/kg组与10mg/kg组比较：p＝0.0477

·90mg/kg组与5mg/kg组比较：p＝0.0014

·30mg/kg组与5mg/kg组比较：p＝0.0247。

序列表

<110>tdw集团（tdwgroup）

almassy,robertj.

brin,elena

showalter,richarde.

thomson,jamesa.

<120>蛋白质缀合物

<130>tdwg-007/01wo319744-2053

<150>us62/478,398

<151>2017-03-29

<160>97

<170>patentin版本3.5

<210>1

<211>409

<212>prt

<213>人型支原体（mycoplasmahominis）

<400>1

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151015

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202530

asptyrilethrproalaargleuaspgluleuleupheseralaile

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65707580

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100105110

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115120125

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130135140

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145150155160

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165170175

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210215220

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proleuserarglysaspvallystrp

405

<210>2

<211>409

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>突变精氨酸脱氨酶

<400>2

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151015

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202530

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354045

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145150155160

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165170175

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<210>3

<211>392

<212>prt

<213>海豹脑支原体（mycoplasmaphocicerebrale）

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355360365

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370375380

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<210>4

<211>410

<212>prt

<213>精氨酸支原体（mycoplasmaarginini）

<400>4

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151015

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202530

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<210>5

<211>409

<212>prt

<213>关节炎支原体（mycoplasmaarthritidis）

<400>5

metservalpheaspserlysphelysglyilehisvaltyrserglu

151015

ileglygluleugluthrvalleuvalhisgluproglylysgluile

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metproleuserarglysaspvallys

405

<210>6

<211>408

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<213>口腔支原体（mycoplasmaorale）

<220>

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<222>(201)..(201)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(263)..(263)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(272)..(272)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(294)..(294)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>6

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leuserilegluglyglyaspvalpheiletyrasnasnaspthrleu

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valvalglyvalsergluargthraspleugluthrilethrleuleu

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alalysasnilelysalaasnlysglucysgluphelysargileval

245250255

alaileasnvalprolysxaathrasnleumethisleuaspthrxaa

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glyasnglnleuserleuglymetglyasnalaargcysmetsermet

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proleuserarglysaspvallys

405

<210>7

<211>391

<212>prt

<213>猫支原体（mycoplasmagateae）

<400>7

ilehisvaltyrsergluileglygluleugluservalleuvalhis

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tyrtyraspproserleulysleuserilegluglyglyaspvalphe

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cysgluphelysargilevalalaileasnvalprolystrpthrasn

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leumethisleuaspthrtrpleuthrmetleuasplysasplysphe

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leutyrserproilealaasnaspvalphelysphetrpasptyrasp

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leugluglyleuleugluserileileasnlyslysproileleuile

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proilealaglygluglyalaserglnileaspilegluarggluthr

325330335

hispheaspglythrasntyrleualaileargproglyvalvalile

340345350

glytyrserargasnglulysthrasnalaalaleuglualaalagly

355360365

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370375380

asnalaargcysmetsermet

385390

<210>8

<211>392

<212>prt

<213>海豹支原体（mycoplasmaphocidae）

<400>8

ilehisvaltyrsergluileglygluleuglnthrvalleuvalhis

151015

gluproglyarggluileglutyrilethrproalaargleuaspglu

202530

leuleupheseralaileleugluserhisaspalaarglysgluhis

354045

glngluphevalalagluleulyslysasnasnileasnvalvalglu

505560

leuthraspleuvalsergluthrtyraspmetvalserlysglulys

65707580

glnglulysleuilegluglupheleugluaspsergluprovalleu

859095

serglugluhislysglyleuvalarglyspheleulysserleulys

100105110

serserlysgluleuileglntyrmetmetalaglyilethrlyshis

115120125

aspleuasnileglualaasphisgluleuilevalaspprometpro

130135140

asnleutyrphethrargaspprophealaservalglyasnglyval

145150155160

thrilehistyrmetargtyrlysvalargglnarggluthrleuphe

165170175

serargpheilephealaasnhisprolysleumetasnthrproleu

180185190

tyrtyrasnproaspmetlysleuserilegluglyglyaspvalphe

195200205

valtyrasnasngluthrleuvalvalglyvalsergluargthrasp

210215220

leuaspthrilethrleuleualalysasnilelysalaasnlysglu

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arggluphelysargilevalalaileasnvalprolystrpthrasn

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260265270

leutyrserproilealaasnaspvalphelysphetrpasptyrasp

275280285

leuvalasnglyglyaspgluproglnprolysvalasnglyleupro

290295300

leuglulysleuleugluserileileasnlyslysproileleuile

305310315320

proilealaglythrseralaserasnileaspvalgluarggluthr

325330335

hispheaspglythrasntyrleualailealaproglyvalvalile

340345350

glytyrserargasnvallysthrasnglualaleuglualaalagly

355360365

ilelysvalleuprophelysglyasnglnleuserleuglymetgly

370375380

asnalaargcysmetsermetpro

385390

<210>9

<211>401

<212>prt

<213>鸽支原体（mycoplasmacolumbinum）

<400>9

metserlysileasnvaltyrsergluileglygluleulysgluval

151015

leuvalhisthrproglyaspgluileargargileserproserarg

202530

leuaspgluleuleupheseralaileleugluproasnglualaile

354045

lysgluhislysglypheleulysileleuglnasplysglyilelys

505560

valileglnleuseraspleuvalalagluthrtyrthrtyrhisala

65707580

thrglnlysgluargglualapheileglulystrpleuaspgluala

859095

gluproalaleuthrlysaspleuargalalysvallyssertyrval

100105110

leuserlysgluglythrprovalalametvalargthrmetmetala

115120125

glyvalserlysglngluleuasnvalglusergluthrgluleuval

130135140

valaspprometproasnleutyrphethrargaspprophealaser

145150155160

alaglyasnglyileserleuasnasnmetlystyrvalthrarglys

165170175

arggluthrilephealaglupheilephealathrhisproasptyr

180185190

lysthrthrprohistrppheaspargleuaspgluglyasnileglu

195200205

glyglyaspvalpheiletyrasnlysaspthrleuvalileglyval

210215220

sergluargthrasnlysglualaileleuthrilealalyslysile

225230235240

lysasnasnlysglualalysphelyslysilevalalaileasnval

245250255

proprometproasnleumethisleuaspthrtrpleuthrmetval

260265270

asplysasplyspheleutyrserproasnmetleuservalleulys

275280285

valtrpgluileaspleuserlysgluileglumetvalgluthrasn

290295300

lysproleualaaspvalleugluserileileglyvallysproval

305310315320

leuileproilealaglylysglyalathrglnleuaspileaspile

325330335

gluthrhispheaspglythrasntyrleuthrilealaproglyval

340345350

valvalglytyrserargasnilelysthrglualaalaleuargala

355360365

alaglyvalthrvalleuserphegluglyasnglnleuserleugly

370375380

metglyseralaargcysmetsermetproleuvalarggluaspval

385390395400

lys

<210>10

<211>407

<212>prt

<213>衣阿华支原体（mycoplasmaiowae）

<400>10

metglyasnasnileprolyslysileasnvalphesergluilegly

151015

asnleulysargvalleuvalhisthrproglylysgluileglutyr

202530

valthrproglnargleuaspgluleuleupheseralaileleuasp

354045

provalargalaargglugluhislysglupheilelysileleuglu

505560

serglnglyvalgluvalvalglnleuvalaspleuthralagluthr

65707580

tyraspvalalagluserglnalalysgluasnpheileglnlystrp

859095

leuaspgluserleuprolysleuthraspgluasnargasnlysval

100105110

tyrserleuleulysserleuglulysaspprolysglumetilearg

115120125

lysmetmetserglyvalleualasergluileglyvallysserasp

130135140

valgluleuilevalaspprometproasnleutyrphethrargasp

145150155160

prophealaservalglyasnglyilethrleuhisargmetphearg

165170175

prothrargargarggluthrilephealaasppheilepheserasn

180185190

hisproglutyrlysserthrglnlystyrtyrgluarggluasplys

195200205

pheserleugluglyglyaspvalpheiletyrasnasnlysthrleu

210215220

valvalglyvalsergluargthrglulysglyalailelysalaleu

225230235240

alalysalavalglnasnasnserasnmetserpheglulysiletyr

245250255

alaileasnvalprolysmetserasnleumethisleuaspthrtrp

260265270

leuthrmetleuaspthrasplyspheleutyrserproasnmetmet

275280285

glyvalleulysiletrpgluileaspleuserasplysserleulys

290295300

trplysgluileargaspserleuasphispheleuserthrileile

305310315320

glylyslysalailethrvalprovalalaglylysaspalametgln

325330335

phegluileaspilegluthrhispheaspalathrasnpheileala

340345350

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355360365

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glnleuserleuglymetglyseralaargcysmetthrmetproleu

385390395400

tyrargglugluleulyslys

405

<210>11

<211>402

<212>prt

<213>鳄鱼支原体（mycoplasmacrocodyli）

<400>11

metasnlysileasnvaltyrsergluvalglylysleulysgluval

151015

leuvalhisthrproglyaspgluileargargileserproserarg

202530

leuglugluleuleupheseralaileleugluproaspseralaile

354045

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505560

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65707580

proservalargaspalapheileglulystrpleuasngluserglu

859095

prolysleuasplyslysleuargglulysvallysglutyrleuleu

100105110

histhrglnlysthrvalglythrlysargmetvalargilemetmet

115120125

alaglyvalaspargvalgluleuglyvalgluleuaspargglnleu

130135140

valvalaspprometproasnleutyrphethrargasppropheala

145150155160

seralaglyasnglyileserleuasnasnmetlystyrvalthrarg

165170175

lysarggluthrilepheserglupheilephegluasnhisproasp

180185190

tyrlysthrthrprohistrppheaspargleuasplysglyasnile

195200205

gluglyglyaspvalpheiletyrasnargthrthrleuvalilegly

210215220

ilesergluargthrasnlysaspalaleuleuthrilealaasnasn

225230235240

ilelysserasnlysgluserlysphegluargilevalalavalasn

245250255

valproprometproasnleumethisleuaspthrtrpleuthrmet

260265270

valasphisasplyspheleutyrserproasnmetmetlysthrleu

275280285

lysphetrpthrileaspleuthrlysproilelysmetvalgluleu

290295300

glugluserleuseraspmetilegluthrileileglylyslyspro

305310315320

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325330335

ilegluthrhispheaspglythrasntyrleuthrilealaprogly

340345350

valvalvalglytyrserargasnlysleuthrglulysalaleuthr

355360365

lysalaglyvallysvalleuserphegluglyasnglnleuserleu

370375380

glymetglyseralaargcysmetsermetproleuvalarggluasp

385390395400

ilelys

<210>12

<211>430

<212>prt

<213>发酵支原体（mycoplasmafermentans）

<400>12

metglnileilealalysileaspleuleuthrasnmetleuilephe

151015

metlysiletyrpheileglyargleuilemetlyslysileasnval

202530

tyrserglutyrglylysleulysgluvalleuvalhisthrprogly

354045

aspgluileargargilealaproserargleuaspgluleuleuphe

505560

seralaileleugluproaspseralailealagluhislysargphe

65707580

valglnleuleulysaspasnglyilelysvalileglnleuaspglu

859095

leuphealalysthrpheaspleuvalsergluservallysglnser

100105110

leuilegluargtrpleuaspglucysgluprolysleuaspalathr

115120125

leuargalalysvallysglutyrileleugluleulysalalysser

130135140

serlyslysmetvalargvalmetmetalaglyileasplyslysglu

145150155160

leuglyilegluleuaspargaspleuvalvalaspprometproasn

165170175

leutyrphethrargaspprophealaservalglyasnglyileser

180185190

leuhishismetlystyrvalthrargglnarggluthrilepheser

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glupheilepheaspasnasnleuasptyrasnthrvalproargtrp

210215220

pheasparglysaspgluglyargilegluglyglyaspvalpheile

225230235240

tyrseralaaspthrleuvalvalglyvalsergluargthrasnlys

245250255

glualaileasnvalmetalaarglysilealaalaasplysgluval

260265270

lysphelysargiletyralaileasnvalproprometproasnleu

275280285

methisleuaspthrtrpleuthrmetleuasplysasnlyspheleu

290295300

tyrserproasnmetleuservalleulysvaltrpargileaspleu

305310315320

asnaspproaspphevaltrphisgluilegluglyserleugluglu

325330335

ileleugluglnileileglymetlysproileleuileproileala

340345350

glylysglyalaserglnleuaspileaspilegluthrhispheasp

355360365

glythrasntyrleuthrilealaproservalvalvalglytyrser

370375380

argasnglulysthrglulysalaleulysalaalalysvallysval

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leuserphegluglyasnglnleuserleuglymetglyseralaarg

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cysmetsermetproleuilearggluaspilelyslyslys

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<210>13

<211>452

<212>prt

<213>穿透支原体（mycoplasmapenetrans）

<400>13

metvalilethrilealaleuasnileleuasnlysiletyrphelys

151015

proglnasnargserileleulysleutyrargleuproserleucys

202530

thrglnileserilepheileglyglylysmetserserileasplys

354045

asnserleuglyasnglyileasnvaltyrsergluileglygluleu

505560

lysgluvalleuvalhisthrproglyaspgluileargtyrthrala

65707580

proserargleuglugluleuleupheseralavalleulysalaasp

859095

thralaileglugluhislysglyphevallysileleuglnasnasn

100105110

glyilelysvalileglnleucysaspleuvalalagluthrtyrglu

115120125

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tyrleuleuserpheprothrvalglnmetvalarglysmetmetser

165170175

glyileleualaasngluleuasnilelysglnaspasnproleuile

180185190

ileaspglymetproasnleutyrphethrargaspprophealaser

195200205

metglyasnglyvalserileasncysmetlystyrprothrarglys

210215220

arggluvalilepheserargphevalphethrasnasnprolystyr

225230235240

lysasnthrproargtyrpheaspilevalglyasnasnglythrile

245250255

gluglyglyaspilepheiletyrasnserlysthrleuvalilegly

260265270

asnsergluargthrasnphealaalailegluservalalalysasn

275280285

ileglnalaasnlysaspcysthrphegluargilevalvalileasn

290295300

valproprometproasnleumethisleuaspthrtrpleuthrmet

305310315320

leuasptyrasplyspheleutyrserproasnmetmetasnvalleu

325330335

lysiletrpgluileaspleuasnvallysprovallysphevalglu

340345350

lyslysglythrleuglugluvalleutyrserileileasplyslys

355360365

proileleuileproilealaglylysglyalaasnglnleuaspile

370375380

aspilegluthrhispheaspglythrasntyrleuthrilealapro

385390395400

glyvalvalvalglytyrgluargasnglulysthrglnlysalaleu

405410415

valglualaglyilelysvalleuserpheasnglyserglnleuser

420425430

leuglymetglyseralaargcysmetsermetproleuileargglu

435440445

asnleulyslys

450

<210>14

<211>403

<212>prt

<213>鸡毒支原体（mycoplasmagallisepticum）

<400>14

metpheasnlysileargvaltyrsergluileglylysleuarglys

151015

valleuvalhisthrproglylysgluleuasptyrvalthrprogln

202530

argleuaspgluleuleupheserserleuleuasnproilelysala

354045

argglngluhisgluthrpheilelysleuleugluasphisaspval

505560

glucysvalglnleuserthrleuthralaglnthrpheglnalaval

65707580

asnserlysileglngluglupheileasnargtrpleuaspglucys

859095

leuprovalleusergluileasnargleulysvaltyrasptyrleu

100105110

lysserleualathrasnproglnvalmetilearglysmetmetser

115120125

glyileleualalysgluvalglyileglnsergluvalgluleuval

130135140

alaaspprometproasnleutyrphethrargaspprophealaser

145150155160

ileglylysglyilethrleuhissermetphehisprothrarglys

165170175

arggluthrilephealaasppheilepheserhishisproglutyr

180185190

lysasnalaprolystyrtyrserarggluasplystyrserileglu

195200205

glyglyaspleuphevaltyraspasplysthrleuvalileglyval

210215220

sergluargthrglulyslysalaileglnserleualaglulysleu

225230235240

argglnasnaspgluthrserpheglulysiletyralaileasnval

245250255

prolysmetserasnleumethisleuaspthrtrpleuthrmetleu

260265270

asptyrasplyspheleutyrserproasnmetmetglyvalleulys

275280285

iletrpgluileaspleuilehisprothrleuiletrparggluleu

290295300

asngluserleugluglypheleusermetvalileglylyslysala

305310315320

thrleuileprovalalaglygluaspserthrglnilegluileasp

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valgluthrasnpheaspalathrasnpheleuvalileglnprogly

340345350

valvalvalglytyraspargasntyrlysthrasnglnalaleuarg

355360365

aspalaglyvallysvalilesertrpasnglyaspglnleuserleu

370375380

glymetglyseralaargcysmetsermetproleutyrargasppro

385390395400

ilelyslys

<210>15

<211>402

<212>prt

<213>短吻鳄支原体（mycoplasmaalligatoris）

<400>15

metserlysileasnvaltyrsergluvalglyargleulysgluval

151015

leuvalhisthrproglyaspgluileargargileserprothrarg

202530

leuglugluleuleupheseralaileleugluproaspthralaile

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glugluhislysargpheleuasnvalleuglulysasnglyilelys

505560

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glnlysilelysaspglupheileaspglntrpleuglnglualalys

859095

provalleuasnaspglnleulyslysleuvallysasntyrleuleu

100105110

lysserglnlysglupheserthrlyslysmetvalargilemetmet

115120125

alaglyileasplyslysgluileasnileaspleuaspargaspleu

130135140

valvalaspprometproasnleutyrphethrargasppropheala

145150155160

servalglyasnglyileserleuhisasnmetlystyrglnthrarg

165170175

lysarggluthrilephealaglnpheilephelystyrasnlysasp

180185190

tyrlysthrthrprohistrppheaspargpheasphisglyserile

195200205

gluglyglyaspvalphevaltyrthrlysaspthrleuvalilegly

210215220

ilesergluargthrthrlysglualavalleuasnilealalyslys

225230235240

ilelysalaasnthraspserlysphelyslysilevalalaileasn

245250255

valproprometproasnleumethisleuaspthrtrpilethrmet

260265270

valasphisasplyspheleutyrserproasnmetmetlysserleu

275280285

lysphetrpleuileaspleuserlysgluilelysmetvalgluleu

290295300

glugluserleuserasnmetleuglualaileileglylyslyspro

305310315320

ileleuileproilealaglylysasnalaserglnleuaspileasp

325330335

ilegluthrhispheaspglythrasntyrleuthrilealaprogly

340345350

valvalvalglytyrserargasnlysleuthrglnlysalaleuglu

355360365

aspalaglyvallysvalleuserpheaspglyasnglnleuserleu

370375380

glymetglyseralaargcysmetsermetproleuvalarggluasp

385390395400

ilelys

<210>16

<211>438

<212>prt

<213>肺炎支原体（mycoplasmapneumoniae）

<400>16

metserlyslysglnleuvallysthraspglyhisasnglnleuasp

151015

glnproasnthrlysalaleuglnleulyslyslysglnpheasnser

202530

glyvalargvalthrsergluileserpheleuarggluvalileala

354045

hishisproglyilegluthrgluargvalileaspasnglnthrphe

505560

glyseralamettyrleugluargalaglnlysgluhisglnleuphe

65707580

ilelysileleuargglnhisglythrlysvalhistyrleuglnasp

859095

leuleuleuglualaleuseralaalaaspproasnvalargglnasp

100105110

pheilelysasnpheleuleugluserglyilelysservalserthr

115120125

pheglualacysleuasnphepheargserleuaspserleuvalasp

130135140

valilelysvalmetpheglyglyilelysvalseraspvalpropro

145150155160

ilethrproglnargphealaaspilehisvalserasnserprophe

165170175

leuilelysproleuserpheserleutyrprohislysphepheasn

180185190

thrleuglythrglyvalalaleuphevalthrasnaspsergluleu

195200205

lysarghisserleuvaltyrglutyrilemetargphehisproarg

210215220

pheaspglyvallysleutyrthrasnargaspphelysasncysleu

225230235240

ileasnserseraspileileglnileserasngluileleuleuile

245250255

glyileserhisaspthraspvalleuglyilegluserleualaarg

260265270

asnleuleuserasphisthrasnproilelysglnileilealaile

275280285

asnilehislyspheglyalalysthrasnleuasnlysleuileala

290295300

metvalaspvalasplyspheileilealaarglysvalleuglnala

305310315320

thrgluilephegluleuthralathralaglnargaspvalaspgly

325330335

leualaglnilelysphelysproleulyspheasnpheglygluile

340345350

ileglualaileileasplysglnproargphevalileileglygly

355360365

glyaspgluvalalagluarglysgluleuleuaspcysglymetgly

370375380

valleuasnleuserproglygluilevalvalpheaspargasnhis

385390395400

tyrthrasnasnleuleuasngluleuglyleuileilehislysile

405410415

proalasergluleuserargglyproserglyproleuglumetval

420425430

cysserleutrpargglu

435

<210>17

<211>409

<212>prt

<213>运动支原体（mycoplasmamobile）

<400>17

metlysaspthrlysaspileileasnvalphesergluileglyglu

151015

leulyslysvalleuilehisthrproglyasngluleulystyrval

202530

serprotyrargleuaspgluleuleupheserasnvalleuglutrp

354045

argglualalyslysgluhisasnglupheileglnlysleulysser

505560

gluglyvalgluprovalgluleuthraspleuvalalagluserphe

65707580

glugluserserilelysvallysasnasppheileargglntyrleu

859095

aspglualathrproileleuaspglyleuthrlysglnlysleuleu

100105110

prophepheleuaspilelyshisserthrarglysthrilegluleu

115120125

metmetserglyilethrglnlysaspileserileserhisileglu

130135140

arggluleuileileaspprometproasnleutyrpheserargasp

145150155160

asnpheileserileglyasnservalileileserasnmetlystyr

165170175

lysthrarglysarggluthrilephethrasppheilephelysasn

180185190

hisproleutyrlyslysvalasnmetalaphegluarglysaspleu

195200205

asnasnglnileserileilegluglyglyaspvalleuvaltyrser

210215220

lysgluileleuileileglyilesergluargthrthrmetserala

225230235240

ileleugluleualagluasnphelyslysthrlysargserphelys

245250255

lysiletyrglyvalgluvalprolysmetlysasnleumethisleu

260265270

aspthrtrpleuthrmetileasptyrasplyspheiletyrserpro

275280285

asnvalleuthraspleulysphetrpgluileasnleuasptyrglu

290295300

lysileserserlysgluleuhisalaserleuserglupheleulys

305310315320

leuileileglylysaspproileleuileproileglyglylysgly

325330335

alaserglnilethrileaspilegluthrasnphevalalaalaasn

340345350

tyrleuvalileargproglyvalvalileglytyrserargasntyr

355360365

gluthrglnlysalaleugluglyhisglyvallysvalilealaphe

370375380

gluglyasnglnleuserleuglymetglyserserargcysmetser

385390395400

metproleuileargserasnleulys

405

<210>18

<211>411

<212>prt

<213>化脓性链球菌（streptococcuspyogenes）

<400>18

metthralaglnthrproilehisvaltyrsergluileglylysleu

151015

lyslysvalleuleuhisargproglylysgluilegluasnleumet

202530

proasptyrleugluargleuleupheaspaspilepropheleuglu

354045

aspalaglnlysgluhisaspalaphealaglnalaleuargaspglu

505560

glyilegluvalleutyrleugluthrleualaalagluserleuval

65707580

thrprogluileargglualapheileaspglutyrleusergluala

859095

asnileargglyargalathrlyslysalailearggluleuleumet

100105110

alailegluaspasnglngluleuileglulysthrmetalaglyval

115120125

glnlyssergluleuprogluileproalaserglulysglyleuthr

130135140

aspleuvalgluserasntyrprophealaileaspprometproasn

145150155160

leutyrphethrargaspprophealathrileglythrglyvalser

165170175

leuasnhismetphesergluthrargasnarggluthrleutyrgly

180185190

lystyrilephethrhishisproiletyrglyglyglylysvalpro

195200205

metvaltyraspargasngluthrthrargilegluglyglyaspglu

210215220

leuvalleuserlysaspvalleualavalglyileserglnargthr

225230235240

aspalaalaserileglulysleuleuvalasnilephelysglnasn

245250255

leuglyphelyslysvalleualaphegluphealaasnasnarglys

260265270

phemethisleuaspthrvalphethrmetvalasptyrasplysphe

275280285

thrilehisprogluilegluglyaspleuargvaltyrservalthr

290295300

tyraspasnglugluleuhisilevalgluglulysglyaspleuala

305310315320

gluleuleualaalaasnleuglyvalglulysvalaspleuilearg

325330335

cysglyglyaspasnleuvalalaalaglyarggluglntrpasnasp

340345350

glyserasnthrleuthrilealaproglyvalvalvalvaltyrasn

355360365

argasnthrilethrasnalaileleugluserlysglyleulysleu

370375380

ilelysilehisglysergluleuvalargglyargglyglyproarg

385390395400

cysmetsermetprophegluarggluaspile

405410

<210>19

<211>408

<212>prt

<213>粪肠球菌（enterococcusfaecalis）

<400>19

metserhisproileasnvalphesergluileglylysleulysthr

151015

valmetleuhisargproglylysgluleugluasnleumetproasp

202530

tyrleugluargleuleupheaspaspilepropheleuglulysala

354045

glnalagluhisaspalaphealagluleuleuargserlysaspile

505560

gluvalvaltyrleugluaspleualaalaglualaleuileasnglu

65707580

gluvalargargglnpheileaspglnpheleugluglualaasnile

859095

argsergluseralalysglulysvalarggluleumetleugluile

100105110

aspaspasnglugluleuileglnlysalailealaglyileglnlys

115120125

glngluleuprolystyrgluglnglupheleuthraspmetvalglu

130135140

alaasptyrpropheileileaspprometproasnleutyrphethr

145150155160

argaspasnphealathrmetglyhisglyileserleuasnhismet

165170175

tyrservalthrargglnarggluthrilepheglyglntyrilephe

180185190

asptyrhisproargphealaglylysgluvalproargvaltyrasp

195200205

argsergluserthrargilegluglyglyaspgluleuileleuser

210215220

lysgluvalvalalaileglyileserglnargthraspalaalaser

225230235240

ileglulysilealaargasnilephegluglnlysleuglyphelys

245250255

asnileleualapheaspileglygluhisarglysphemethisleu

260265270

aspthrvalphethrmetileasptyrasplysphethrilehispro

275280285

gluilegluglyglyleuvalvaltyrserilethrglulysalaasp

290295300

glyaspileglnilethrlysglulysaspthrleuaspasnileleu

305310315320

cyslystyrleuhisleuaspasnvalglnleuileargcysglyala

325330335

glyasnleuthralaalaalaarggluglntrpasnaspglyserasn

340345350

thrleualailealaproglygluvalvalvaltyraspargasnthr

355360365

ilethrasnlysalaleugluglualaglyvallysleuasntyrile

370375380

proglysergluleuvalargglyargglyglyproargcysmetser

385390395400

metproleutyrarggluaspleu

405

<210>20

<211>403

<212>prt

<213>公山羊支原体（mycoplasmacapricolum）

<400>20

metglulyslysileasnvalphesergluileglythrleulysthr

151015

valleuvalhisargproglyaspgluilegluasnleuthrproglu

202530

leuleugluargleuleupheaspaspvalprophelysaspvalala

354045

vallysgluhisaspalaphethrlysilemetargaspasnglyval

505560

gluvalleutyrileglulysleualaalagluthrleuaspglnhis

65707580

proaspleuargglulyspheileaspglnpheileserglualaasn

859095

ilegluasplystyrlysglulystyrargasppheileserserleu

100105110

aspasntyrargmetilelyslysmetilealaglythrlyslysleu

115120125

gluleuglyileaspgluglytyrlysalatyrpropheilealaasp

130135140

proleuproasnvalleupheglnargasppropheserservalgly

145150155160

pheglyilethrmetasnargmettrpservalthrargasnargglu

165170175

thrilepheproaspleuvalphelyshishisasnargphealaasn

180185190

glnvalprotyrtyrtyrgluargasptrplysglugluthrileglu

195200205

glyglyaspileleuvalleuasnlysgluthrleuileileglyval

210215220

thrglnargthrthrleulysalaileglulysphesergluargleu

225230235240

pheasnaspproglusersertyrserlysvalilealaleuaspleu

245250255

prolysserargalaphemethisleuaspthrvalphethrasnile

260265270

asptyrasplyspheilealahisproleuilepheaspcysileasp

275280285

gluphelysiletyrgluvalserlysglnglythrlysgluvallys

290295300

lysthrleuilegluleuleuseraspalaalaglyarggluvalgln

305310315320

ileileargcysglyglyasnaspvalvalglyalaserargglugln

325330335

trpasnaspglythrasnvalvalalaleuargproglylysvalile

340345350

alatyrgluargasntrpilethrileaspleuleuarglysalagly

355360365

valgluvalleuthrilealasersergluleuserargglyarggly

370375380

glyproargcysmetthrmetproleutrparggluaspleuglnglu

385390395400

ilelysarg

<210>21

<211>410

<212>prt

<213>奥氏嗜热盐丝菌（halothermothrixorenii）

<400>21

metphelyslysserproleuasnvalthrsergluileglylysleu

151015

lyslysvalleuleuhisargproglyhisgluilegluasnleuthr

202530

proaspleuleugluargleuleupheaspaspileprotyrleulys

354045

valalaglnglugluhisaspalaphealaglnthrleuargaspasn

505560

glyvalgluvalleutyrleuhisgluleualaalaglualailegln

65707580

gluaspgluilearglyslyspheilegluglnpheleuaspgluala

859095

glyvalileglylysglyalaargglnvalleulysglutyrpheala

100105110

aspmetaspasngluthrleuilearglysmetmetalaglyvalarg

115120125

lyslysgluileproalaileglulysvalalaserleuasnaspmet

130135140

valglugluasptyrprophevalleuaspprometproasnleutyr

145150155160

phethrargaspprophealathrileglythrglyilethrleuasn

165170175

hismetargthrgluthrargasnarggluvalilephealaglutyr

180185190

ilephesertyrhisproaspphelysaspthrgluileprophetrp

195200205

pheaspargasngluthrthrserilegluglyglyaspgluleuile

210215220

leuserasplysvalleualametglyilesergluargthraspala

225230235240

alaserileglulysvalalaargasnilephethraspglyglnpro

245250255

phegluthrileleualaphelysileproglulysargalaphemet

260265270

hisleuaspthrvalphethrmetvalasptyrasplysphethrile

275280285

hisalagluilegluglyproleulysvaltyrserilethrlysgly

290295300

aspasnaspgluleulysileaspgluglulysalathrleugluasp

305310315320

thrleulyslystyrleuglyleuaspgluvalthrleuileargcys

325330335

alaglyglyasptyrileaspalaglyarggluglntrpasnaspgly

340345350

serasnthrleualailealaproglygluvalvalvaltyrasnarg

355360365

asnhisthrthrasnargleuleuglugluhisglyilelysleuhis

370375380

valileprosersergluleuserargglyargglyglyproargcys

385390395400

metsermetproleuvalarggluaspile

405410

<210>22

<211>411

<212>prt

<213>金黄色葡萄球菌（staphylococcusaureus）

<400>22

metthraspglyproilelysvalasnsergluileglyalaleulys

151015

thrvalleuleulysargproglylysgluleugluasnleuvalpro

202530

asptyrleuaspglyleuleupheaspaspileprotyrleugluval

354045

alaglnlysgluhisasphisphealaglnvalleuarggluglugly

505560

valgluvalleutyrleuglulysleualaalagluserilegluasn

65707580

proglnvalargserglupheileaspaspvalleualagluserlys

859095

lysthrileleuglyhisgluglugluilelysalaleuphealathr

100105110

leuserasnglngluleuvalasplysilemetserglyvalarglys

115120125

glugluileasnprolyscysthrhisleuvalglutyrmetaspasp

130135140

lystyrprophetyrleuaspprometproasnleutyrphethrarg

145150155160

aspproglnalaserileglyhisglyilethrileasnargmetphe

165170175

trpargalaargargarggluserilepheileglntyrilevallys

180185190

hishisproargphelysaspalaasnileproiletrpleuasparg

195200205

aspcyspropheasnilegluglyglyaspgluleuvalleuserlys

210215220

aspvalleualaileglyvalsergluargthrseralaglnalaile

225230235240

glulysleualaargargilephegluasnproglnalathrphelys

245250255

lysvalvalalailegluileprothrserargthrphemethisleu

260265270

aspthrvalphethrmetileasptyrasplysphethrmethisser

275280285

alaileleulysalagluglyasnmetasnilepheileileglutyr

290295300

aspaspvalasnlysaspilealailelysglnserserhisleulys

305310315320

aspthrleugluaspvalleuglyileaspaspileglnpheilepro

325330335

thrglyasnglyaspvalileaspglyalaarggluglntrpasnasp

340345350

glyserasnthrleucysileargproglyvalvalvalthrtyrasp

355360365

argasntyrvalserasnaspleuleuargglnlysglyilelysval

370375380

ilegluileserglysergluleuvalargglyargglyglyproarg

385390395400

cysmetserglnproleuphearggluaspile

405410

<210>23

<211>417

<212>prt

<213>杀香鱼假单胞菌（pseudomonasplecoglossicida）

<400>23

metseralaglulysglnlystyrglyvalhisserglualaglylys

151015

leuarglysvalmetvalcysalaproglyleualahislysargleu

202530

thrproserasncysaspgluleuleupheaspaspvaliletrpval

354045

aspglnalalysargasphispheaspphevalthrlysmetargglu

505560

argglyvalaspvalleuglumethisasnleuleuthraspileval

65707580

glnasnproglualaleulystrpileleuasparglysilethrpro

859095

aspthrvalglyvalglyleuthrasngluvalargsertrpleuglu

100105110

glyglngluproarghisleualaglupheleuileglyglyvalala

115120125

glyglnaspleuproglusergluglyalaservalvallysmettyr

130135140

asnasptyrleuglyhisserserpheileleuproproleuproasn

145150155160

thrglnphethrargaspthrthrcystrpiletyrglyglyvalthr

165170175

leuasnpromettyrtrpproalaargargglngluthrleuleuthr

180185190

thralailetyrlysphehisprogluphethrlysalaaspphegln

195200205

valtrptyrglyaspproaspglngluhisglyglnalathrleuglu

210215220

glyglyaspvalmetproileglylysglyilevalleuileglymet

225230235240

glygluargthrserargglnalaileglyglnleualaglnasnleu

245250255

phealalysglyalavalgluglnvalilevalalaglyleuprolys

260265270

serargalaalamethisleuaspthrvalpheserphecysasparg

275280285

aspleuvalthrvalpheprogluvalvalarggluilevalprophe

290295300

ileileargproaspgluserlysprotyrglymetaspvalargarg

305310315320

gluasnlysserpheilegluvalvalglygluglnleuglyvallys

325330335

leuargvalvalgluthrglyglyasnserphealaalagluargglu

340345350

glntrpaspaspglyasnasnvalvalalaleugluproglyvalval

355360365

ileglytyraspargasnthrtyrthrasnthrleuleuarglysala

370375380

glyilegluvalilethrileseralaglygluleuglyargglyarg

385390395400

glyglyglyhiscysmetthrcysproilevalargaspproileasn

405410415

tyr

<210>24

<211>417

<212>prt

<213>恶臭假单胞菌（pseudomonasputida）

<400>24

metseralaglulysglnlystyrglyvalhisserglualaglylys

151015

leuarglysvalmetvalcysalaproglyleualahislysargleu

202530

thrproserasncysaspgluleuleupheaspaspvaliletrpval

354045

aspglnalalysargasphispheaspphevalthrlysmetargglu

505560

argglyvalaspvalleuglumethisasnleuleuthraspileval

65707580

glnasnlysaspalaleulystrpileleuasparglysilethrpro

859095

aspthrvalglyvalglyleuthrasngluvalargsertrpleuglu

100105110

glyleugluproarghisleualaglupheleuileglyglyvalala

115120125

glyglnaspleuproglnsergluglyalaaspvalvallysmettyr

130135140

asnasptyrleuglyhisserserpheileleuproproleuproasn

145150155160

thrglnphethrargaspthrthrcystrpiletyrglyglyvalthr

165170175

leuasnpromettyrtrpproalaargargglngluthrleuleuthr

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thralailetyrlysphehisproglnphethrglyalaaspphegln

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valtrptyrglyaspproasplysasphisglyasnalathrleuglu

210215220

glyglyaspvalmetproileglylysglyilevalleuileglymet

225230235240

glygluargthrserargglnalaileglyglnleualaglnasnleu

245250255

phealalysglyalavalglulysvalilevalalaglyleuprolys

260265270

serargalaalamethisleuaspthrvalpheserphecysasparg

275280285

aspleuvalthrilepheprogluvalvallysgluilevalprophe

290295300

ileileargproaspgluserlysprotyrglymetaspvalargarg

305310315320

gluasnlysserpheilegluvalvalglygluglnleuglyvallys

325330335

leuargvalvalgluthrglyglyasnserphealaalagluargglu

340345350

glntrpaspaspglyasnasnvalvalalavalgluproglyvalval

355360365

ileglytyraspargasnthrtyrthrasnthrleuleuarglysala

370375380

glyilegluvalilethrileseralaglygluleuglyargglyarg

385390395400

glyglyglyhiscysmetthrcysproilevalargaspproileasp

405410415

tyr

<210>25

<211>418

<212>prt

<213>铜绿假单孢菌（pseudomonasaeruginosa）

<400>25

metserthrglulysthrlysleuglyvalhisserglualaglylys

151015

leuarglysvalmetvalcysserproglyleualahisglnargleu

202530

thrproserasncysaspgluleuleupheaspaspvaliletrpval

354045

asnglnalalysargasphispheaspphevalthrlysmetargglu

505560

argglyileaspvalleuglumethisasnleuleuthrgluthrile

65707580

glnasnproglualaleulystrpileleuasparglysilethrala

859095

aspservalglyleuglyleuthrsergluleuargsertrpleuglu

100105110

serleugluproarglysleualaglutyrleuileglyglyvalala

115120125

alaaspaspleuproalasergluglyalaasnileleulysmettyr

130135140

argglutyrleuglyhisserserpheleuleuproproleuproasn

145150155160

thrglnphethrargaspthrthrcystrpiletyrglyglyvalthr

165170175

leuasnpromettyrtrpproalaargargglngluthrleuleuthr

180185190

thralailetyrlysphehisprogluphealaasnalaglupheglu

195200205

iletrptyrglyaspproasplysasphisglyserserthrleuglu

210215220

glyglyaspvalmetproileglyasnglyvalvalleuileglymet

225230235240

glygluargserserargglnalaileglyglnvalalaglnserleu

245250255

phealalysglyalaalagluargvalilevalalaglyleuprolys

260265270

serargalaalamethisleuaspthrvalpheserphecysasparg

275280285

aspleuvalthrvalpheprogluvalvallysgluilevalprophe

290295300

serleuargproaspalaserserprotyrglymetserileargarg

305310315320

gluglulysthrpheleugluvalvalalagluserleuglyleulys

325330335

lysleuargvalvalgluthrglyglyasnserphealaalagluarg

340345350

gluglntrpaspaspglyasnasnvalvalcysleugluproglyval

355360365

valvalglytyraspargasnthrtyrthrasnthrleuleuarglys

370375380

alaglyvalgluvalilethrileseralasergluleuglyarggly

385390395400

argglyglyglyhiscysmetthrcysproileileargaspproile

405410415

asptyr

<210>26

<211>402

<212>prt

<213>结核分枝杆菌群（mycobacteriumtuberculosiscomplex）

<400>26

metglyvalgluleuglyserasnsergluvalglyalaleuargval

151015

valileleuhisargproglyalagluleuargargleuthrproarg

202530

asnthraspglnleuleupheaspglyleuprotrpvalserargala

354045

glnaspgluhisaspgluphealagluleuleualaserargglyala

505560

gluvalleuleuleuseraspleuleuthrglualaleuhishisser

65707580

glyalaalaargmetglnglyilealaalaalavalaspalaproarg

859095

leuglyleuproleualaglngluleuseralatyrleuargserleu

100105110

aspproglyargleualahisvalleuthralaglymetthrpheasn

115120125

gluleuproseraspthrargthraspvalserleuvalleuargmet

130135140

hishisglyglyaspphevalilegluproleuproasnleuvalphe

145150155160

thrargaspserseriletrpileglyproargvalvalileproser

165170175

leualaleuargalaargvalargglualaserleuthraspleuile

180185190

tyralahishisproargphethrglyvalargargalatyrgluser

195200205

argthralaprovalgluglyglyaspvalleuleuleualaprogly

210215220

valvalalavalglyvalglygluargthrthrproalaglyalaglu

225230235240

alaleualaargserleupheaspaspaspleualahisthrvalleu

245250255

alavalproilealaglnglnargalaglnmethisleuaspthrval

260265270

cysthrmetvalaspthraspthrmetvalmettyralaasnvalval

275280285

aspthrleuglualaphethrileglnargthrproaspglyvalthr

290295300

ileglyaspalaalaprophealaglualaalaalalysalametgly

305310315320

ileasplysleuargvalilehisthrglymetaspprovalvalala

325330335

gluarggluglntrpaspaspglyasnasnthrleualaleualapro

340345350

glyvalvalvalalatyrgluargasnvalglnthrasnalaargleu

355360365

glnaspalaglyilegluvalleuthrilealaglysergluleugly

370375380

thrglyargglyglyproargcysmetsercysproalaalaargasp

385390395400

proleu

<210>27

<211>409

<212>prt

<213>关节炎支原体（mycoplasmaarthritidis）

<400>27

metservalpheaspserlysphelysglyilehisvaltyrserglu

151015

ileglygluleugluthrvalleuvalhisgluproglylysgluile

202530

asptyrilethrproalaargleuaspgluleuleupheseralaile

354045

leugluserhisaspalaarglysgluhislysgluphevalalaglu

505560

leulyslysargglyileasnvalvalgluleuvalaspleuileval

65707580

gluthrtyraspleualaserlysglualalysglulysleuleuglu

859095

glupheleuaspaspservalprovalleuseraspgluhisargala

100105110

alavallyslyspheleuglnserglnlysserthrargserleuval

115120125

glutyrmetilealaglyilethrlyshisaspleulysilegluser

130135140

aspleugluleuilevalaspprometproasnleutyrphethrarg

145150155160

aspprophealaservalglyasnglyvalthrilehistyrmetarg

165170175

tyrlysvalargglnarggluthrleupheserargphevalpheser

180185190

asnhisprolysleuvalasnthrprotrptyrtyraspproalaglu

195200205

glyleuserilegluglyglyaspvalpheiletyrasnasnaspthr

210215220

leuvalvalglyvalsergluargthraspleuglnthrilethrleu

225230235240

leualalysasnilelysalaasnlysglucysgluphelysargile

245250255

valalaileasnvalprolystrpthrasnleumethisleuaspthr

260265270

trpleuthrmetleuasplysasplyspheleutyrserproileala

275280285

asnaspvalphelysphetrpasptyraspleuvalasnglyglyasp

290295300

alaproglnprovalaspasnglyleuproleugluaspleuleulys

305310315320

serileileglylyslysprothrleuileproilealaglyalagly

325330335

alaserglnileaspilegluarggluthrhispheaspglythrasn

340345350

tyrleualavalalaproglyilevalileglytyralaargasnglu

355360365

lysthrasnalaalaleuglualaalaglyilethrvalleuprophe

370375380

argglyasnglnleuserleuglymetglyasnalaargcysmetser

385390395400

metproleuserarglysaspvallys

405

<210>28

<211>410

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>海豹脑支原体人工全长

<400>28

metservalpheaspserlyspheasnglyilehisvaltyrserglu

151015

ileglygluleugluthrvalleuvalhisgluproglyarggluile

202530

asptyrilethrproalaargleuaspgluleuleupheseralaile

354045

leugluserhisaspalaarglysgluhisglnserphevallysgln

505560

leulysaspasnglyileasnvalvalgluleuthraspleuvalala

65707580

gluthrpheaspleualaserlysglugluglnglulysleuileglu

859095

glupheleugluaspsergluprovalleuserglualahislysthr

100105110

alavalarglyspheleuthrserarglysserthrargglumetval

115120125

gluphemetmetalaglyilethrlystyraspleuglyilegluala

130135140

asphisgluleuilevalaspprometproasnleutyrphethrarg

145150155160

aspprophealaservalglyasnglyvalthrilehistyrmetarg

165170175

tyrlysvalargglnarggluthrleupheserargphevalpheser

180185190

asnhisprolysleuvallysthrprotrptyrtyraspproalamet

195200205

lysmetserilegluglyglyaspvalpheiletyrasnasnaspthr

210215220

leuvalvalglyvalsergluargthraspleugluthrilethrleu

225230235240

leualalysasnilelysalaasnlysgluvalgluphelysargile

245250255

valalaileasnvalprolystrpthrasnleumethisleuaspthr

260265270

trpleuthrmetleuasplysasplyspheleutyrserproileala

275280285

asnaspvalphelysphetrpasptyraspleuvalasnglyglyala

290295300

gluproglnprolysgluasnglyleuproleugluglyleuleugln

305310315320

serileileasnlyslysprovalleuileproilealaglyasnasn

325330335

alaserhisileaspilegluarggluthrhispheaspglythrasn

340345350

tyrleualailelysproglyvalvalileglytyralaargasnglu

355360365

lysthrasnalaalaleualaalaalaglyilelysvalleuprophe

370375380

hisglyasnglnleuserleuglymetglyasnalaargcysmetser

385390395400

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405410

<210>29

<211>410

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>猫支原体人工全长

<400>29

metservalpheaspserlyspheasnglyilehisvaltyrserglu

151015

ileglygluleugluservalleuvalhisgluproglyarggluile

202530

asptyrilethrproalaargleuaspgluleuleupheseralaile

354045

leugluserhisaspalaarglysgluhislysleuphevalserglu

505560

leulysalaasnaspileasnvalvalgluleuthraspleuvalthr

65707580

gluthrtyraspleualaserglnglualalysaspasnleuileglu

859095

glupheleugluaspsergluprovalleuthrglugluleulysser

100105110

valvalargthrtyrleulysserilelysserthrarggluleuile

115120125

glnmetmetmetalaglyilethrlystyraspleuglyilegluala

130135140

asphisgluleuilevalaspprometproasnleutyrphethrarg

145150155160

aspprophealaservalglyasnglyvalthrilehistyrmetarg

165170175

tyrlysvalargglnarggluthrleupheserargphevalpheser

180185190

asnhisprolysleuvalasnthrprotrptyrtyraspproserleu

195200205

lysleuserilegluglyglyaspvalpheiletyrasnasnasnthr

210215220

leuvalvalglyvalsergluargthraspleugluthrvalthrleu

225230235240

leualalysasnilevalalaasnlysglucysgluphelysargile

245250255

valalaileasnvalprolystrpthrasnleumethisleuaspthr

260265270

trpleuthrmetleuasplysasplyspheleutyrserproileala

275280285

asnaspvalphelysphetrpasptyraspleuvalasnglyglyglu

290295300

gluproglnprovalgluasnglyleuproleugluglyleuleuglu

305310315320

serileileasnlyslysproileleuileproilealaglyglugly

325330335

alaserglnileaspilegluarggluthrhispheaspglythrasn

340345350

tyrleualaileargproglyvalvalileglytyrserargasnglu

355360365

lysthrasnalaalaleuglualaalaglyilelysvalleuprophe

370375380

hisglyasnglnleuserleuglymetglyasnalaargcysmetser

385390395400

metproleuserarglysaspvallystrp

405410

<210>30

<211>410

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>海豹支原体人工全长

<400>30

metservalpheaspserlyspheasnglyilehisvaltyrserglu

151015

ileglygluleuglnthrvalleuvalhisgluproglyarggluile

202530

glutyrilethrproalaargleuaspgluleuleupheseralaile

354045

leugluserhisaspalaarglysgluhisglngluphevalalaglu

505560

leulyslysasnasnileasnvalvalgluleuthraspleuvalser

65707580

gluthrtyraspmetvalserlysglulysglnglulysleuileglu

859095

glupheleugluaspsergluprovalleuserglugluhislysgly

100105110

leuvalarglyspheleulysserleulysserserlysgluleuile

115120125

glntyrmetmetalaglyilethrlyshisaspleuasnilegluala

130135140

asphisgluleuilevalaspprometproasnleutyrphethrarg

145150155160

aspprophealaservalglyasnglyvalthrilehistyrmetarg

165170175

tyrlysvalargglnarggluthrleupheserargpheilepheala

180185190

asnhisprolysleumetasnthrproleutyrtyrasnproaspmet

195200205

lysleuserilegluglyglyaspvalphevaltyrasnasngluthr

210215220

leuvalvalglyvalsergluargthraspleuaspthrilethrleu

225230235240

leualalysasnilelysalaasnlysgluarggluphelysargile

245250255

valalaileasnvalprolystrpthrasnleumethisleuaspthr

260265270

trpleuthrmetleuasplysasplyspheleutyrserproileala

275280285

asnaspvalphelysphetrpasptyraspleuvalasnglyglyasp

290295300

gluproglnprolysvalasnglyleuproleuglulysleuleuglu

305310315320

serileileasnlyslysproileleuileproilealaglythrser

325330335

alaserasnileaspvalgluarggluthrhispheaspglythrasn

340345350

tyrleualailealaproglyvalvalileglytyrserargasnval

355360365

lysthrasnglualaleuglualaalaglyilelysvalleuprophe

370375380

lysglyasnglnleuserleuglymetglyasnalaargcysmetser

385390395400

metproleuserarglysaspvallystrp

405410

<210>31

<211>410

<212>prt

<213>唾液支原体（mycoplasmasalivarium）

<400>31

metservalpheserserlyspheasnglyilehisvaltyrserglu

151015

ileglygluleugluthrvalleuvalhisgluproglylysgluile

202530

asptyrilethrproserargleuaspgluleuleupheseralaile

354045

leugluserhisaspalaarglysgluhisglngluphevalalathr

505560

leulyslysglulysileasnvalvalgluleuthraspleuvalthr

65707580

gluthrtyraspleuvalaspglnlysthrlysasplysleuileasp

859095

glupheleugluaspsergluprovalleuthralagluleulysala

100105110

thrvallyslyspheleulysserphelysgluthrarglysleuile

115120125

gluvalmetmetalaglyilethrlystyraspleuglyilelysala

130135140

asparggluleuilevalaspprometproasnleutyrphethrarg

145150155160

aspprophealaservalglyasnglyvalthrilehistyrmetarg

165170175

tyrlysvalargglnarggluthrleupheserargpheilepheasn

180185190

asnhisprolysleuvallysthrprotrptyrtyraspproalamet

195200205

lysmetserilegluglyglyaspvalpheiletyrasnasnaspthr

210215220

leuvalvalglyvalsergluargthraspleuaspthrilethrleu

225230235240

leualalysasnilelysalaasnlysglucysgluphelysargile

245250255

valalaileasnvalprolystrpthrasnleumethisleuaspthr

260265270

trpleuthrmetleuasplysasplyspheleutyrserproileala

275280285

asnaspilephelysphetrpasptyraspleuvalasnglyglyala

290295300

asnproglnprolysaspasnglyleuproleuasplysleuleulys

305310315320

serileileglylysgluprovalleuileproilealaglyhishis

325330335

alathrgluilegluvalalaarggluthrhispheaspglythrasn

340345350

tyrleualaileargproglyvalvalileglytyralaargasnglu

355360365

lysthrasnglualaleulysaspalaglyilethrvalleuprophe

370375380

lysglyasnglnleuserleuglymetglyasnalaargcysmetser

385390395400

metproleuserarglysaspvallystrp

405410

<210>32

<211>411

<212>prt

<213>泡沫支原体（mycoplasmaspumans）

<400>32

metservalpheaspserlysphelysglyilehisvaltyrserglu

151015

ileglygluleugluservalleuvalhisgluproglyarggluile

202530

asptyrilethrproalaargleuaspgluleuleupheseralaile

354045

leugluserhisaspalaarglysgluhislysglyphevalalaglu

505560

leulyslysglnasnvalasnvalilegluleuthraspleuvalala

65707580

gluthrtyrgluleualaserlysglualaglnalalysleuileglu

859095

asppheilegluaspsergluprovalleuasnalagluglualagln

100105110

alavalarglyspheleusergluarglysserthrargglumetval

115120125

glutyrmetmetserglyleuthrlystyrgluleuglyleugluser

130135140

alaasparggluleuilevalaspprometproasnleutyrphethr

145150155160

argaspprophealaservalglyasnglyvalthrilehistyrmet

165170175

lystyrlysvalargglnarggluthrleuphealalysphevalphe

180185190

serasnhisprolysleuvalasnthrproargtyrtyraspproser

195200205

metlysleuproilegluglyglyaspvalpheiletyrasnasnglu

210215220

thrleuvalvalglycyssergluargthrgluleugluthrilethr

225230235240

leuleualalysasnilelysalaasnlysgluvalgluphelysarg

245250255

ilevalalaileasnvalprolystrpthrasnleumethisleuasp

260265270

thrtrpleuthrmetleuasplysasplyspheleutyrserproile

275280285

alaasnaspvalphelysphetrpasptyraspleuvalasnglygly

290295300

glugluproglnprovalgluasnglyleuproleuglugluleuleu

305310315320

alaserileileasnlyslysprothrleuileproilealaglyglu

325330335

glyalathrhisileaspvalgluarggluthrhispheaspglythr

340345350

asntyrleualailealaproalaleuileileglytyrserargasn

355360365

glulysthrasnalaalaleuglulysalaglyilethrvalleupro

370375380

phehisglyasnglnleuserleuglymetglyasnalaargcysmet

385390395400

sermetproleuserarglysaspvallystrp

405410

<210>33

<211>410

<212>prt

<213>耳支原体（mycoplasmaauris）

<400>33

metservalpheaspserlysphelysglyilehisvaltyrserglu

151015

ileglygluleugluthrvalleuvalhisgluproglyarggluile

202530

asptyrilethrprolysargleuaspgluleuleupheseralaile

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leugluserhisglualaarglysgluhislysglnphevalalaglu

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leulysalaasnaspileasnvalvalgluleuthraspleuvalala

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glupheleuaspaspsertyrprovalleuthrglugluhislyslys

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leualalysasnilevalalaasnlysglucysgluphelysargile

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lysthrasnalaalaleuglualavalglyilelysvalleuprophe

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<213>猪滑液支原体（mycoplasmahyosynoviae）

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leulyslysgluglyvalasnvalvalgluleuvalaspleuileala

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glulysgluleuileileaspprometproasnleutyrphethrarg

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aspprophealaservalglyasnglyvalthrilehistyrmetarg

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195200205

lysleuserilegluglyglyaspvalpheiletyrasnasnaspthr

210215220

leuvalvalglyvalsergluargthraspleuaspthrilethrleu

225230235240

leualalysasnilelysalaasnlysglucysgluphelysargile

245250255

valalaileasnvalprolystrpthrasnleumethisleuaspthr

260265270

trpleuthrmetleuasplysasplyspheleutyrserproileala

275280285

asnaspilephelysphetrpasptyraspleuvalasnglyglyser

290295300

gluproglnprolysaspasnglyleuproleuglulysleuleuglu

305310315320

serileileglylyslysprovalleuileproilealaglycyscys

325330335

alaseraspilegluilealaarggluthrhispheaspglythrasn

340345350

tyrleualailelysproglyvalvalileglytyralaargasnglu

355360365

lysthrasnlysalaleuglulysalaglyilelysvalleuprophe

370375380

lysglyasnglnleuserleuglymetglyasnalaargcysmetser

385390395400

metproleuserarglysaspvallystrp

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<212>prt

<213>泄殖腔支原体（mycoplasmacloacale）

<400>35

metservalpheasplysargphelysglyilehisvaltyrserglu

151015

ileglygluleuglnthrvalleuvalhisgluproglyarggluile

202530

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354045

leugluserhisaspalaarglysgluhislysgluphevallysile

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leugluserglnglyileasnvalvalgluleuthraspleuileala

65707580

gluthrtyrgluleualasergluglualalysaspasnleuileglu

859095

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100105110

leuvalargasnpheleulysglyilethrlysthrlysgluleuval

115120125

lysmetmetmetalaglyilethrlystyraspleuglyilegluala

130135140

asparggluleuilevalaspprometproasnleutyrphethrarg

145150155160

aspprophealaservalglyasnglyvalthrilehistyrmetarg

165170175

tyrlysvalargglnarggluthrleupheserargpheilepheglu

180185190

asnhisprolysleuvalserthrproiletyrtyrhisprosergln

195200205

glyleuserilegluglyglyaspvalpheiletyrasnasnaspthr

210215220

leuvalvalglyvalsergluargthraspleuglnthrilethrleu

225230235240

leualalysasnilelysalaasngluglucysgluphelysargile

245250255

valalaileasnvalprolystrpthrasnleumethisleuaspthr

260265270

trpleuthrmetleuasplysasnlyspheleutyrserproileala

275280285

asnaspvalphelysphetrpasptyraspleuvalasnglyglyasp

290295300

gluproglnprovalaspasnglyleuproleuasngluleuleuala

305310315320

serileileglyglugluprovalleuvalproilealaglyglugly

325330335

alaserlysmetaspilegluarggluthrhispheaspglythrasn

340345350

tyrleualailealaproglyvalvalvalglytyrserargasnglu

355360365

lysthrasnalaalaleuglulysalaglyilelysvalleuprophe

370375380

lysglyhisglnleuserleuglymetglyasnalaargcysmetser

385390395400

metproleutyrarglysaspvallys

405

<210>36

<211>412

<212>prt

<213>产碱支原体（mycoplasmaalkalescens）

<400>36

metservalpheaspserlysphelysglyilehisvaltyrserglu

151015

ileglygluleugluservalleuvalhisgluproglyhisgluile

202530

asptyrilethrproserargleuaspgluleuleupheseralamet

354045

leugluserhisaspalaarglysgluhislysglnphevalalaglu

505560

leulysalaasnasnvalasnvalilegluleuthraspleuvalala

65707580

gluthrtyraspleualaserglnglualalysasplysleuileglu

859095

glupheleugluaspsergluprovalleuserglugluasnlysile

100105110

alavalargasppheleulysserarglysthrthrarggluleuile

115120125

gluvalmetmetalaglyilethrlystyraspleuglyilelysasn

130135140

cyslyscysglnaspleuvalvalaspprometproasnleutyrphe

145150155160

thrargaspprophealaservalglyasnglyilethrilehistyr

165170175

metargtyrlysvalargglnarggluthrleupheserargpheile

180185190

phealaasnhisprolysleuvalasnthrproiletyrtyrhispro

195200205

serleulysleuserilegluglyglyaspvalpheiletyrasnasn

210215220

aspthrleuvalvalglyvalsergluargthraspleugluthrile

225230235240

thrleuleualalysasnilevalalaasnlysglucysgluphelys

245250255

argilevalalaileasnvalprolystrpthrasnleumethisleu

260265270

aspthrtrpleuthrmetleuasplysasplyspheleutyrserpro

275280285

ilealaasnaspvalphelysphetrpasptyraspleuvalasngly

290295300

glyalagluprolysprovalgluasnglyserserleuglualaile

305310315320

leugluserileilehislyslysproileleuileproileglygly

325330335

aspseralaserglnilegluvalgluarggluthrhispheaspgly

340345350

thrasntyrleualaileargproglyvalvalileglytyrserarg

355360365

asnvallysthrasnalaalaleuglualaalaglyilelysvalile

370375380

prophehisglyasnglnleuserleuglymetglyasnalaargcys

385390395400

metsermetproleuserarglysaspvallystrp

405410

<210>37

<211>401

<212>prt

<213>惰性支原体（mycoplasmainers）

<400>37

metserlysileasnvaltyrsergluileglyvalleulysgluval

151015

leuvalhisthrproglyaspgluileargargilealaproserarg

202530

leuaspgluleuleupheseralaileleugluproseralaalaile

354045

glngluhislysserpheleulysileleuglnaspargglyilelys

505560

thrileglnleuseraspleuvalalagluthrtyrlyshistyrala

65707580

serglualaglulysglualapheileglulystyrleuaspgluala

859095

thrprovalleuserlysaspmetargalalysvallysasntyrile

100105110

leusermetglnglygluprovallysmetvalargthrmetmetala

115120125

glyvalserlysglngluleuasnvalglusergluvalgluleuile

130135140

valaspprometproasnleutyrphethrargaspprophealaser

145150155160

alaglyasnglyileserleuasnasnmetlystyrvalvalarglys

165170175

arggluthrilephealaglupheilepheserilehisproglutyr

180185190

lyslysthrprohistrppheaspargleuaspasnglyserileglu

195200205

glyglyaspvalpheiletyrasnlysaspthrleuvalileglyval

210215220

sergluargthrasnlysglualaileilethrilealalyshisile

225230235240

glnaspasnlysglualaglnphelyslysilevalalaileasnval

245250255

proprometproasnleumethisleuaspthrtrpleuthrmetval

260265270

asplysasnlyspheleutyrserproasnmetleuservalleulys

275280285

valtrpgluileaspleuserlysproileglumetvalgluthrasn

290295300

lysproleualagluvalleugluserileileglyglulysproile

305310315320

leuileproilealaglylysaspalathrglnleuaspileaspile

325330335

gluthrhispheaspglythrasntyrleuthrilealaproglyval

340345350

valvalglytyrserargasnvallysthrglualaalaleuargala

355360365

alaglyvalthrvalleuserphegluglyasnglnleuserleugly

370375380

metglyseralaargcysmetsermetproleuvalarggluaspval

385390395400

lys

<210>38

<211>401

<212>prt

<213>鸡支原体（mycoplasmagallinarum）

<400>38

metserlysileargvaltyrsergluileglyasnleulyslysval

151015

leuvalhisthrproglyaspgluileargargileserproserarg

202530

leuglugluleuleupheseralavalleugluproasnalaalaile

354045

glugluhislysargphevallysleuleugluaspargglyilegln

505560

alaileglnleuseraspleuvalalagluthrtyrvallystyrala

65707580

thralagluglnlysalaalapheileglulystyrleuaspgluala

859095

thrproalaleuseralagluasnarggluargalalyslystyrile

100105110

leuserleuglumetglnprovallysmetileargthrmetmetala

115120125

glyleuserlystyrgluleuasnvalgluserasnilegluleuile

130135140

ileaspprometproasnleutyrphethrargaspprophealaser

145150155160

alaglyasnglyileserleuasnasnmetlystyrvalvalarglys

165170175

arggluthrilephealaglupheilephealailehisproglutyr

180185190

lysgluthrprohistrppheaspargleuasphisglyserileglu

195200205

glyglyaspvalphevaltyrasnlysaspthrleuvalileglyval

210215220

sergluargthrasnlysglualaileilethrilealalyshisile

225230235240

glnaspasnlysglualagluphelyslysilevalalaileasnval

245250255

proprometproasnleumethisleuaspthrtrpleuthrmetval

260265270

asplysasnlyspheiletyrserproasnmetleuservalleulys

275280285

iletrpgluileaspleualalysproileglumetvalgluserasn

290295300

lysserleuthrgluvalleugluserileileglyglulysproile

305310315320

leuileproilealaglygluglyalaserglnleuaspileaspile

325330335

gluthrhispheaspglythrasntyrleuthrilealaproglyval

340345350

valvalglytyrserargasnglulysthrglulysalaleulysala

355360365

alaglyilethrvalleuserphegluglyasnglnleuserleugly

370375380

metglyseralaargcysmetsermetproleuvalarggluaspval

385390395400

lys

<210>39

<211>405

<212>prt

<213>梨支原体（mycoplasmapirum）

<400>39

metasnserasnglnlysglyilehisvaltyrsergluileglylys

151015

leulysgluvalleuvalhisargproglyarggluleuasppheleu

202530

aspprothrargleuaspgluleuleuphealaalathrleugluala

354045

gluthralaargleugluhisaspasnphethrasnalaleulysasn

505560

glnglyvalthrvalilegluleualaaspleuvalalaglnthrtyr

65707580

serserserthrprothrilelysalaalapheileasnlystyrleu

859095

aspglualathrproalaleuthrthrlysleuargthrleuvallys

100105110

asppheleuthrlysglnlysservalarglysmetvalasptyrmet

115120125

ileglyglyileleuserthraspleuasnilelysglylysproglu

130135140

leuilevalgluprometproasnalatyrphethrhisaspprophe

145150155160

alaservalglyasnglyvalthrleuhistyrmetlyshisasnval

165170175

argargarggluvalleupheserglupheilepheasnasnasnglu

180185190

argpheglnasnthrproargtyrilevalprothrlysglyleuasp

195200205

ilegluglyglyaspvalphevaltyrasnlysasnthrleuvalval

210215220

glyvalsergluargthrlysmetvalthrilelysgluleualalys

225230235240

asnileleulysasnlysglucysleuphelyslysiletyralaile

245250255

asnvalprolysmetproasnleumethisleuaspthrtrpleuthr

260265270

metleuasphisasnlyspheleutyrserproasnmetleuserval

275280285

leulysiletrpgluileaspileserserglylysserileserser

290295300

prolysgluleuasnmetaspleuserlysalaleuserileileile

305310315320

glylyslysproileleuileprovalalaglygluasnalasergln

325330335

ileaspileasnilegluthrasnpheaspalathrasntyrleuval

340345350

thrglnproglyvalvalvalglytyrserargasnlyslysthrglu

355360365

alaalaleuilelysalaglyilegluvalilepropheglnglyasn

370375380

glnleuserleuglymetglyseralaargcysmetsermetproleu

385390395400

ilearggluaspval

405

<210>40

<211>404

<212>prt

<213>灵长类支原体（mycoplasmaprimatum）

<400>40

metserlysserlysileasnvaltyrserglutyrglyasnleulys

151015

gluvalleuvalhisthrproglyaspgluileargargilethrpro

202530

serargleuaspgluleuleupheseralaileleugluprolysser

354045

alailealagluhislysserphecysglnileleulysaspasnlys

505560

vallysalaileglnleuaspgluleuvalalaalathrtyrlysgly

65707580

valsergluservalglnasnserphevalgluargtrpleuaspglu

859095

cysgluprolysleugluasnasnvalargproilevallysglutyr

100105110

leuleulysalaalagluglnservallyslysmetileargilemet

115120125

metalaglyileasplysarggluileglyvalglusergluvalasp

130135140

pheilevalaspprometproasnleutyrphethrargaspprophe

145150155160

alaservalglyasnglyilethrleuhishismetlystyrvalval

165170175

argglnarggluthrleupheserglupheilepheaspasnhispro

180185190

asptyrlysphevalproargtyrpheaspargaspaspgluglylys

195200205

ilegluglyglyaspvalpheiletyrasnserlysthrleuvalval

210215220

glyilesergluargthrasnlysaspalaileargilevalalalys

225230235240

lysileglnalaasnalaaspalalyspheglulysilephealaile

245250255

asnvalproprometproasnleumethisleuaspthrtrpleuthr

260265270

metleuaspserasnlyspheleutyrserproasnmetleuserval

275280285

leulysvaltrpgluileasnleuaspaspproalaleuglutrplys

290295300

gluileserglyserleuglugluileleuthrtyrileileglylys

305310315320

lysproileleuileproilealaglylysglyalaserglnpheglu

325330335

ileaspilegluthrhispheaspglythrasntyrleualaileala

340345350

proservalvalileglytyrserargasngluleuthrglulysala

355360365

leulyslysalaglyvallysvalleuserleuaspglyasnglnleu

370375380

serleuglymetglyseralaargcysmetsermetproleuilearg

385390395400

gluaspvallys

<210>41

<211>401

<212>prt

<213>产脂支原体（mycoplasmalipofaciens）

<400>41

metserlysileasnvaltyrsergluvalglyvalleulysgluval

151015

leuvalhisthrproglyaspgluileargargvalalaproserarg

202530

leuaspgluleuleupheseralaileleugluproglnaspalaile

354045

alagluhislysargpheilelysileleugluaspasnasnilelys

505560

valileglnleuaspgluleuvalsergluthrtrpglulysalathr

65707580

alagluglnargaspalapheileglulystrpleuaspglualaglu

859095

provalleuaspalalysleuarggluthrvallyslystyrleuleu

100105110

serleuasnprovallyslysmetvalargthrmetmetalaglyile

115120125

asplyslysgluleulysilegluleuaspargaspleuvalvalasp

130135140

prometproasnleutyrphethrargaspprophealaseralagly

145150155160

asnglyileserleuasnasnmetlystyrvalthrarglysargglu

165170175

thrilephealaglupheilepheasnilehisproasptyrlysthr

180185190

thrprohistrppheaspargleuasplysglyasnilegluglygly

195200205

aspvalpheiletyrasnlysaspthrleuvalleuglyvalserglu

210215220

argthrasnlysaspalavalmetthrilealalyshisileglnser

225230235240

asngluglnalalysphelyslysleuvalalaileasnvalpropro

245250255

metproasnleumethisleuaspthrtrpleuthrmetvalasphis

260265270

asplyspheleutyrserproasnmetleuservalleulysiletrp

275280285

gluileaspleuthrproglylysgluileglumetvalgluserthr

290295300

lysserleuseraspmetleugluserileileglylyslysproval

305310315320

leuileproilealaglylysaspalaserglnleuaspileaspile

325330335

gluthrhispheaspglythrasntyrleuthrileargproglyval

340345350

valvalglytyrserargasncysleuthrgluglnalaleulysasp

355360365

alaglyvalthrvalleuserpheaspglyasnglnleuserleugly

370375380

metglyseralaargcysmetsermetproleuvalarggluaspile

385390395400

lys

<210>42

<211>405

<212>prt

<213>猫咽支原体（mycoplasmafelifaucium）

<400>42

metasnlysileasnvaltyrsergluileglylysleulysgluval

151015

leuvalhisthrproglyasngluileargargileserproserarg

202530

leuaspgluleuleupheseralaleuleugluproasnphealaala

354045

lysgluhisthralaphecysgluileleulysgluasnglyilelys

505560

alaileglnleuvalaspleuvalseraspthrtrpargilealaser

65707580

glulysalalysthrglupheilegluargtrpleuaspglucysglu

859095

prolysleuaspserasnleuarggluilevalarglyshisiletyr

100105110

alaileglulysargservallysargmetvallysthrmetmetala

115120125

glyilegluargarggluleuprovalthrserlysgluvalalaarg

130135140

gluleuvalvalaspprometproasnleutyrphethrargasppro

145150155160

phealaservalglyasnglyileserleuhishismetlystyrval

165170175

thrargglnarggluthrilephealagluphevalpheglyasnhis

180185190

proasptyrileaspthrproargtrppheaspargseraspaspgly

195200205

argilegluglyglyaspvalpheiletyrglyserlysthrleuval

210215220

ileglyvalsergluargthrasnlysglualailelysvalmetala

225230235240

lyslysileglnalaasnlysglualathrpheglulysiletyrala

245250255

ileasnvalproprometproasnleumethisleuaspthrtrpleu

260265270

thrmetleuasplysasnlyspheleutyrserproasnmetleuala

275280285

valleuglnvaltrpgluileaspleulysaspprogluleuthrtrp

290295300

hisgluleuserglyserleuglugluileleuhislysileilegly

305310315320

arglysproileleuileproilealaglyhisglyalaglnglnile

325330335

aspileaspilegluthrhispheaspglythrasntyrleualaile

340345350

alaproglyvalvalvalglytyrasnargasnvalleuthrgluarg

355360365

alaleulyslysalaglyilelysvalleuserphegluglyasngln

370375380

leuserleuglymetglyseralaargcysmetsermetproleuile

385390395400

arggluasnleulys

405

<210>43

<211>404

<212>prt

<213>模仿支原体（mycoplasmaimitans）

<400>43

metpheasnlysilelysvaltyrsergluileglyargleuarglys

151015

valleuvalhisthrproglylysgluleuglutyrvalthrprogln

202530

argleuaspgluleuleupheserserleuleuasnprovallysala

354045

argglngluhisglualapheilelysileleuglnaspglnglyval

505560

glucysvalglnleuthrthrleuthralaglnthrpheglnserala

65707580

thrsergluvallysglulyspheileasnargtrpleuaspglucys

859095

leuprolysleuseraspaspasnargilelysvaltyralatyrleu

100105110

lysaspleuserseraspprogluvalmetilearglysmetmetser

115120125

glyileleualalysgluvalasnvalglnseraspvalgluleuile

130135140

alaaspprometproasnleutyrphethrargaspprophealaser

145150155160

ileglylysglyvalthrleuhissermetphehisprothrarglys

165170175

arggluthrilephealaaspphevalpheserhishisproglutyr

180185190

lysglnthrprolystyrtyrserargleuasnglutyrserileglu

195200205

glyglyaspleuphevaltyraspasplysthrleuvalileglyval

210215220

sergluargthrglulyslysalaileglnpheleualaglulysleu

225230235240

arggluasntyrgluthrthrpheglulysiletyralaileasnval

245250255

prolysmetserasnleumethisleuaspthrtrpleuthrmetleu

260265270

asptyrasplyspheleutyrserproasnmetmetglyvalleulys

275280285

iletrpgluileaspleuthrhisgluglnleusertrparggluleu

290295300

asngluserleugluglupheleusermetvalileglylyslysala

305310315320

thrthrileprovalalaglygluaspserthrglnilegluileasp

325330335

valgluthrasnpheaspalathrasnpheleuvalileglnprogly

340345350

valvalvalglytyraspargasntyrlysthrasnglnalaleuval

355360365

asnalaglyilelysvalleusertrpasnglyaspglnleuserleu

370375380

glymetglyseralaargcysmetsermetproleutyrargasppro

385390395400

ilelyslysgly

<210>44

<211>401

<212>prt

<213>乳白色支原体（mycoplasmaopalescens）

<400>44

metserlysileasnvaltyrsergluileglythrleulysgluval

151015

leuvalhisthrproglyaspgluileargargvalalaproalaarg

202530

leuaspgluleuleupheseralaileleugluproasnhisalaile

354045

alagluhislysalapheilelysileleugluaspasnglyilelys

505560

valileglnleuaspgluleuvalvalglnthrtrpasnglnvalasp

65707580

glualathrarglysalaphevalthrlystrpleuaspglucysglu

859095

prolysleugluserasnvalargvalgluvalglulystyriletyr

100105110

serleualalysgluprolyslysmetvalargthrmetmetalagly

115120125

ileserlysglugluleuproleuasnvalasnargproleuvalval

130135140

aspprometproasnleutyrphethrargaspprophealaserval

145150155160

glythrglyileserleuhishismetlystyrvalthrargglnarg

165170175

gluthrilephealaglnphevalpheaspasnhislysasptyrasn

180185190

thrvalproargtrppheaspasnlysaspglnglyargileglugly

195200205

glyaspvalpheiletyrasnthrlysthrleuvalileglyvalser

210215220

gluargthrasplysaspalailelysilemetalalyslysilegln

225230235240

alaasplysasncyslyspheglulysilephealaileasnvalpro

245250255

prometproasnleumethisleuaspthrtrpleuthrmetvalasp

260265270

argasnlyspheleutyrserproasnmetleuservalleulysval

275280285

trpgluileaspleulysaspalaserleualatrplysgluileglu

290295300

glyserleuserglnileleuglulysileileglyglulysproile

305310315320

leuileproilealaglygluasnalaserglnleuaspileaspile

325330335

gluthrhispheaspglythrasntyrleuthrilealaproglyval

340345350

valvalglytyrserargasnvallysthrgluglnalaleulysala

355360365

alaglyvallysvalleuserphegluglyasnglnleuserleugly

370375380

metglyseralaargcysmetsermetproleuilearggluaspleu

385390395400

lys

<210>45

<211>425

<212>prt

<213>毛氏支原体（mycoplasmamoatsii）

<400>45

metlyslysasnalaileasnvaltyrsergluileglylysleulys

151015

lysvalleuvalhisargproglyaspgluleulystyrvalthrpro

202530

glnargmetaspgluleuleumetseralaileilegluleuglugln

354045

alalysglugluhisaspalaphethrlysileleuargaspasngly

505560

valgluvalilegluleualaaspleuthralaglumettyraspser

65707580

leuthrproserglulysaspalapheleuasnglntrpvallysglu

859095

alasertrpglylyslysserserileaspalaleulysilelyslys

100105110

asnleuserlyslysvalpheasptyrvallysserilelysprothr

115120125

arglysmetileasplysleumetalaglyvalleuleusergluile

130135140

glyglulysserileileleuasnlysasplyslysasnglumetval

145150155160

ileaspleuvalvalaspprometproasnleutyrphethrargasp

165170175

prophealaservalglyasnglyilethrleuhisasnmetlystyr

180185190

prothrarglysarggluthrilephealaglntrpilepheasnlys

195200205

hisproglutyrlysaspvalproglnpheileserlysargaspgly

210215220

lysgluthrilegluglyglyaspvalpheiletyrthrlysaspval

225230235240

leualaileglyvalsergluargthrasnmetglualaileleuarg

245250255

ilealathrasnilelyslysasplysasncysgluphelyslysile

260265270

valalaileasnvalproprometglyasnleumethisleuaspthr

275280285

trpleuthrmetleuasplysaspleupheleutyrserglyasnile

290295300

lysseralaleulysvaltrpgluileaspleuthrlysproilethr

305310315320

prolysserprolysleuserthralalysleualaaspileleuala

325330335

lysilevalglylyslysvalargmetileproileglyglylysasp

340345350

glyasnglnmetaspileaspilegluthrhispheaspglythrasn

355360365

tyrleualailealaproglyvalvalvalglytyrhisargasnarg

370375380

lysthrglnlysalaleugluglualaglyvallysvalleualaphe

385390395400

glnglyasnglnleuserleuglymetglyseralaargcysmetser

405410415

metproleuvalargglugluvallys

420425

<210>46

<211>399

<212>prt

<213>象支原体（mycoplasmaelephantis）

<400>46

metserglnileasnvalphesergluileglyglnleulysgluval

151015

leuvalhisthrproglyaspgluileargargileserprolysarg

202530

tyrasngluleuleupheseralaileleuglualaaspvalalaile

354045

lysgluhislysserphevallysileleuglugluasnasnvallys

505560

valileglnleulysaspileleuleugluthrtrpasnilecysser

65707580

lysglualalysasnilepheileasnlystrpilegluglualagln

859095

provalilehisserserserleulysglulysilelysleupheleu

100105110

lysserlysthrproleugluileileaspilemetmetlysglyile

115120125

leulysglngluleuglyileglutyrlyshisgluleuileileasp

130135140

prometproasnleutyrphethrargaspprophethrsermetgly

145150155160

serglyilethrileasnasnmetlystyrglnthrarglysargglu

165170175

thrilepheserglupheilepheasnasnhisprolystyrlysasn

180185190

thrproargtrppheaspargpheaspserglyasnilegluglygly

195200205

aspleuphevaltyrthrlysgluthrilevalvalglyvalserglu

210215220

argthrlyslyslysalaileleulysilealalysasnileglnglu

225230235240

asnasnasnserphelyslysilevalvalilelysvalproilemet

245250255

glnasnleumethisleuaspthrtrpilevalmetvalasppheasp

260265270

lyspheiletyrserproasnvalthrlysserleulysphetrpglu

275280285

ileaspleuthrlyslysprolyspheileglnleulysasngluthr

290295300

leugluaspvalleutyrargvalileglylyslysproileleuile

305310315320

provalalaglygluasnalaasnglnileaspileaspvalgluthr

325330335

hispheaspalathrasntyrleuthrileargproglyvalvalval

340345350

glytyrserargasnlyslysthrgluglualaleuileasnalagly

355360365

vallysvaltyralaphegluglyasnglnleuserleuglymetgly

370375380

seralaargcysmetsermetproleuilearggluaspileile

385390395

<210>47

<211>399

<212>prt

<213>龟支原体（mycoplasmatestudinis）

<400>47

metlysasnileasnvaltyrsergluvalglylysleulysgluval

151015

valvalhisthrproglyglugluleuhisasnvalalaproserarg

202530

leuglngluleuleuthrseralavalleugluprogluvalalaarg

354045

lysgluhisleulyspheilelysileleuasnasptyrglyvallys

505560

valileglnilevalaspleuilethrgluthrtyrglualavalasp

65707580

serasnlyslysglualapheileasnasntrpleuaspasnserval

859095

prolysleuthrasplysasnargmetileleuargasntyrleuthr

100105110

glnpheserthrlysalametilearglysmetileserglyilearg

115120125

alalysgluleuasnleulysthrproseralaleuleuvalasppro

130135140

metproasnleucysphealaargaspthrphealacysvalglyser

145150155160

alaileserleuserthrmetlyshisprothrargargarggluala

165170175

leuleuthrglupheilepheglnasnhisprolystyrlysaspval

180185190

ilelystyrpheaspserlysasnserlysalathrilegluglygly

195200205

aspilephevaltyrasnprolysthrleuvalvalglyasnserglu

210215220

argthrasnmetglnalacysleuleuleualalyslysileglnser

225230235240

asnproasnasnlyspheglulysilevalilevalasnvalpropro

245250255

leuprohisleumethisleuaspthrtrpleuthrmetvalasptyr

260265270

asplyspheiletyrserproasnileleuhisthrleulysphetrp

275280285

valileaspleulyslysarglysleuglualavalglulyshisasn

290295300

thrleulysalametleuargmetileilelyslysgluproileleu

305310315320

ileprovalglyaspvalglyalaaspglnleuaspileaspleuglu

325330335

thrhispheaspalathrasntyrleualaleualaproglyvalval

340345350

valglytyraspargasnilelysthrglnargalaleuglulysala

355360365

glyvallysvalleuserpheserglyasnglnleuserleualamet

370375380

glyseralaargcysleusermetproleuileargglugluasn

385390395

<210>48

<211>410

<212>prt

<213>加拿大支原体（mycoplasmacanadense）

<400>48

metservalpheaspserlysphelysglyilehisvaltyrserglu

151015

ileglygluleugluservalleuvalhisgluproglyarggluile

202530

asptyrilethrproalaargleuaspgluleuleupheseralaile

354045

leugluserhisaspalaarglysgluhislysglnphevalserglu

505560

leulysalaasnaspileasnvalvalgluleuthraspleuvalala

65707580

gluthrtyraspleualaserglnglualalysasplysleuileglu

859095

glupheleugluaspsergluprovalleuserglugluhislysala

100105110

ilevalarglystyrleulysglyileglnprothrarglysleuile

115120125

glumetmetmetalaglyilethrlystyraspleuglyilegluala

130135140

asphisgluleuilevalaspprometproasnleutyrphethrarg

145150155160

aspprophealaservalglyasnglyvalthrilehistyrmetarg

165170175

tyrlysvalargglnarggluthrleupheserargphevalpheser

180185190

asnhisprolysleuvalasnthrprotrptyrtyraspproserleu

195200205

lysleuserilegluglyglyaspvalphevaltyrasnasnaspthr

210215220

leuvalvalglyvalsergluargthraspleuglnthrvalthrleu

225230235240

leualalysasnilevalalaasnlysglucysgluphelysargile

245250255

valalaileasnvalprolystrpthrasnleumethisleuaspthr

260265270

trpleuthrmetleuasplysasplyspheleutyrserproileala

275280285

asnaspvalphelysphetrpasptyraspleuvalasnglyglyser

290295300

gluproglnprovalgluasnglyleuproleugluglyleuleuglu

305310315320

serileileasnlyslysproileleuileproilealaglyglugly

325330335

alaserglnmetgluilegluarggluthrhispheaspglythrasn

340345350

tyrleualaileargproglyvalvalileglytyrserargasnglu

355360365

lysthrasnalaalaleuglualaalaglyilelysvalleuprophe

370375380

hisglyasnglnleuserleuglymetglyasnalaargcysmetser

385390395400

metproleuserarglysaspvallystrp

405410

<210>49

<211>409

<212>prt

<213>鹅支原体（mycoplasmaanseris）

<400>49

metservalpheasplysargphelysglyilehisvaltyrserglu

151015

ileglygluleuglnthrvalleuvalhisgluproglyarggluile

202530

asptyrilethrproalaargleuaspgluleuleupheseralaile

354045

leugluserhisaspalaargalagluhislyslysphevalalathr

505560

leulysgluglnglyileasnthrvalgluleuthraspleuvalala

65707580

gluthrtyraspleualaserglnglualaargaspasnleuleuglu

859095

glupheleuaspaspseralaprovalleuserglugluhislysglu

100105110

ilevalargthrtyrleulysglyilelysglythrarglysleuile

115120125

gluthrmetmetalaglyilethrlystyraspleuglyilegluala

130135140

gluglngluleuilevalaspprometproasnleutyrphethrarg

145150155160

aspprophealaservalglyasnglyvalthrilehistyrmetarg

165170175

tyrlysvalargglnarggluthrleupheserargpheilepheser

180185190

asnhisproglnleuvalasnthrprotrptyrtyrasnproalaglu

195200205

glyleuserilegluglyglyaspvalpheiletyrasnasnaspthr

210215220

leuvalvalglyvalsergluargthraspleuglnthrilethrleu

225230235240

leualalysasnilelysalaasngluglucysgluphelysargile

245250255

valalaileasnvalprolystrpthrasnleumethisleuaspthr

260265270

trpleuthrmetleuaspthrasnlyspheleutyrserproileala

275280285

asnaspvalphelysphetrpasptyraspleuvalasnglyglyasp

290295300

gluproglnprovalaspasnglyleuproleuasngluleuleulys

305310315320

serileileglyglugluproileleuileproilealaglyaspgly

325330335

alathrglnilegluilegluarggluthrhispheaspglythrasn

340345350

tyrleualailealaproglyvalvalileglytyrserargasnglu

355360365

lysthrasnalaalaleuglualaalaglyilelysvalleuprophe

370375380

lysglyhisglnleuserleuglymetglyasnalaargcysmetser

385390395400

metproleutyrarglysaspvallys

405

<210>50

<211>401

<212>prt

<213>火鸡支原体（mycoplasmameleagridis）

<400>50

metserlysileasnvaltyrsergluileglyvalleulysgluval

151015

leuvalhisthrproglyaspgluileargargileserproserarg

202530

leuaspgluleuleupheseralaileleuglnprogluglnalaile

354045

lysgluhisglnserphevallysileleuglnaspargglyilelys

505560

valileglnleuseraspleuvalalagluthrtyrvallystyrala

65707580

thrserlysglulysgluserpheileglulystrpleuaspgluala

859095

thrproalaleuasnsergluasnargalaargvallysasntyrile

100105110

thralametglnglyglnprovallysmetvalargalametmetala

115120125

glyvalserlysglngluleuasnilegluseraspvalgluleuile

130135140

valaspprometproasnleutyrphethrargaspprophealaser

145150155160

alaglyasnglyileserleuasnasnmetlystyrvalvalarglys

165170175

arggluthrilephealaglupheilepheserilehisproglutyr

180185190

lysglnthrprohistrppheaspargleuasplysglyasnileglu

195200205

glyglyaspvalpheiletyrasnlysaspthrleuvalileglyval

210215220

sergluargthrasnlysglualaileleuthrilealagluhisile

225230235240

lysasnasnlysglualalysphelyslysilevalalaileasnval

245250255

proprometproasnleumethisleuaspthrtrpleuthrmetval

260265270

asplysasnlyspheleutyrserproasnmetleuservalleulys

275280285

iletrpgluileaspleuserlysgluilelysmetvalgluthrser

290295300

lysproleualaaspvalleugluserileileglyglulysproile

305310315320

leuileproilealaglygluasnalaserglnleuaspileaspile

325330335

gluthrhispheaspglythrasntyrleuthrilealaproglyval

340345350

valvalglytyrserargasnvallysthrglualaalaleulysala

355360365

alaglyvalthrvaltyrserpheaspglyasnglnleuserleugly

370375380

metglyserglyargcysmetsermetproleuvalarggluaspval

385390395400

lys

<210>51

<211>404

<212>prt

<213>肠支原体（mycoplasmaalvi）

<400>51

metserilelysgluasnglyilehisvaltyrsergluileglylys

151015

leuargaspvalleuvalhisargproglyarggluleuasnpheleu

202530

aspproserargleuaspgluleuleuphealaalathrleuglupro

354045

gluthralaargleugluhisaspasnphethrthrvalleulysasn

505560

glnglyvalasnvalilegluleualaaspleuvalserglnthrtyr

65707580

serlysvalaspserlysvallyslysglupheileaspglntyrleu

859095

asnglualathrprolysleuthrsergluleuserlyslysvaltyr

100105110

asppheleuthrlysglnlysserasnargglumetvalaspphemet

115120125

metglyglyileleuserseraspleuasnilelysglyglnprotyr

130135140

leuilevalgluprometproasnleutyrphethrargaspprophe

145150155160

alaservalglyasnglyalathrilehistrpmetlyshisasnval

165170175

argargarggluvalleuphealaasnpheilephelystyrasnglu

180185190

argpheglnasnthrprolystyrilethrprothrlysglyleuasp

195200205

ilegluglyglyaspvalphevaltyrasnlyslysthrleuvalval

210215220

glyvalsergluargthrlysmetgluthrilelysgluleualalys

225230235240

asnileserlysasnlysglucysthrphethrlysiletyralaile

245250255

asnvalprolysmetproasnleumethisleuaspthrtrpleuthr

260265270

metleuasptyrasnlyspheleutyrserproasnmetleuserval

275280285

leulysvaltrpgluileasnileserasnasnlysvalseralapro

290295300

lysgluleuasnvalasnleuglulysalaleusermetileilegly

305310315320

lyslysproileleuileprovalalaglyalaasnalaserglnile

325330335

aspileasnilegluthrasnpheaspalathrasntyrleuvalile

340345350

gluproglyvalvalvalglytyrserargasnlyslysthrgluglu

355360365

alaleuvallysalaglyilelysvalleuprophehisglyasngln

370375380

leuserleuglymetglyseralaargcysmetsermetproleutyr

385390395400

arggluaspval

<210>52

<211>410

<212>prt

<213>穿透支原体（mycoplasmapenetrans）

<400>52

metserserileasplysasnserleuglyasnglyileasnvaltyr

151015

sergluileglygluleulysgluvalleuvalhisthrproglyasp

202530

gluileargtyrthralaproserargleuglugluleuleupheser

354045

alavalleulysalaaspthralaileglugluhislysglypheval

505560

lysileleuglnasnasnglyilelysvalileglnleucysaspleu

65707580

valalagluthrtyrgluleucysserlysgluvalargasnserphe

859095

ilegluglntyrleuaspglualaleuprovalleulyslysgluile

100105110

argprovalvallysasptyrleuleuserpheprothrvalglnmet

115120125

valarglysmetmetserglyileleualaasngluleuasnilelys

130135140

glnaspasnproleuileileaspglymetproasnleutyrphethr

145150155160

argaspprophealasermetglyasnglyvalserileasncysmet

165170175

lystyrprothrarglysarggluvalilepheserargphevalphe

180185190

thrasnasnprolystyrlysasnthrproargtyrpheaspileval

195200205

glyasnasnglythrilegluglyglyaspilepheiletyrasnser

210215220

lysthrleuvalileglyasnsergluargthrasnphealaalaile

225230235240

gluservalalalysasnileglnalaasnlysaspcysthrpheglu

245250255

argilevalvalileasnvalproprometproasnleumethisleu

260265270

aspthrtrpleuthrmetleuasptyrasplyspheleutyrserpro

275280285

asnmetmetasnvalleulysiletrpgluileaspleuasnvallys

290295300

provallysphevalglulyslysglythrleuglugluvalleutyr

305310315320

serileileasplyslysproileleuileproilealaglylysgly

325330335

alaasnglnleuaspileaspilegluthrhispheaspglythrasn

340345350

tyrleuthrilealaproglyvalvalvalglytyrgluargasnglu

355360365

lysthrglnlysalaleuvalglualaglyilelysvalleuserphe

370375380

asnglyserglnleuserleuglymetglyseralaargcysmetser

385390395400

metproleuilearggluasnleulyslys

405410

<210>53

<211>404

<212>prt

<213>发酵支原体（mycoplasmafermentans）

<400>53

metlyslysileasnvaltyrserglutyrglylysleulysgluval

151015

leuvalhisthrproglyaspgluileargargilealaproserarg

202530

leuaspgluleuleupheseralaileleugluproaspseralaile

354045

alagluhislysargphevalglnleuleulysaspasnglyilelys

505560

valileglnleuaspgluleuphealalysthrpheaspleuvalser

65707580

gluservallysglnserpheilegluargtrpleuaspglucysglu

859095

prolysleuaspalathrleuargalalysvallysglutyrileleu

100105110

gluleulysalalysserserlyslysmetvalargvalmetmetala

115120125

glyileasplyslysgluleuglyilegluleuaspargaspleuval

130135140

valaspprometproasnleutyrphethrargaspprophealaser

145150155160

valglyasnglyileserleuhishismetlystyrvalthrarggln

165170175

arggluthrilepheserglupheilepheaspasnasnleuasptyr

180185190

asnthrvalproargtrppheasparglysaspgluglyargileglu

195200205

glyglyaspvalpheiletyrseralaaspthrleuvalvalglyval

210215220

sergluargthrasnlysglualaileasnvalmetalaarglysile

225230235240

alaalaasplysgluvallysphelysargiletyralaileasnval

245250255

proprometproasnleumethisleuaspthrtrpleuthrmetleu

260265270

asplysasnlyspheleutyrserproasnmetleuservalleulys

275280285

valtrpargileaspleuasnaspproaspphevaltrphisgluile

290295300

gluglyserleuglugluileleugluglnileileglymetlyspro

305310315320

ileleuileproilealaglylysglyalaserglnleuaspileasp

325330335

ilegluthrhispheaspglythrasntyrleuthrilealaproser

340345350

valvalvalglytyrserargasnglulysthrglulysalaleulys

355360365

alaalalysvallysvalleuserphegluglyasnglnleuserleu

370375380

glymetglyseralaargcysmetsermetproleuilearggluasp

385390395400

ilelyslyslys

<210>54

<211>404

<212>prt

<213>肺炎支原体（mycoplasmapneumoniae）

<400>54

metlystyrasnileasnvalhissergluileglyglnleuglnthr

151015

valleuvalhisthrproglyasngluileargargileserproarg

202530

argleuaspaspleuleupheseralavalilegluproaspthrala

354045

ileglngluhisglnthrphecysglnleuleuglngluglnasnile

505560

gluvalvalglnleuthraspleuthralathrthrpheasplysala

65707580

asnalathralaglnasnglnpheilegluthrtrpleuaspglnala

859095

gluprolysleuthrprogluhisarglysvalalalysglntyrleu

100105110

leugluglnlysalalysserthrleusermetvalargsermetmet

115120125

glyglyileasplysarglysvalalaalaalaasnthrileasngly

130135140

asppheleuvalaspprometproasnleutyrphethrargasppro

145150155160

phealaserileglyhisglyileserileasnargmetlystyrleu

165170175

thrargargarggluthrleuphealaserpheilephealaasnhis

180185190

proileilealaalaarglysphetyrphelysproileaspmetgly

195200205

thrilegluglyglyaspilephevaltyraspglnglnthrvalval

210215220

metglyleusergluargthrthrglualaalaileasnvalleuala

225230235240

lyslysileglnglnaspserserthrserphelysargilepheval

245250255

ileasnvalproglnleuproasnleumethisleuaspthrtrpleu

260265270

thrmetleuaspargasnlyspheleutyrserproasnmetleuala

275280285

valleulysalatrpargileaspphethraspproalaleulystrp

290295300

asngluilealaglyaspleuserthrileleuhisthrileilegly

305310315320

glnlysprometleuileproilealaglyalaaspalaasnglnthr

325330335

gluileaspilegluthrhispheaspglythrasntyrleuthrile

340345350

alaproservalvalvalglytyralaargasnlysleuthrhisgln

355360365

thrleuglualaalaglyvallysvalilealaphelysglyasngln

370375380

leuserleuglymetglyseralaargcysmetsermetproleuval

385390395400

arglysproleu

<210>55

<211>414

<212>prt

<213>支原体属cag:877（mycoplasmasp.cag:877）

<400>55

metglulysilehisvalthrsergluileglyproleulyslysval

151015

leuleuhisargproglyasngluleuleuasnleuthrproaspthr

202530

leuserargleuleupheaspaspileprotyrleuproaspalaile

354045

lysgluhisaspgluphealaaspalaleuargalaasnglyvalglu

505560

valvaltyrleugluasnleumetalaaspvalleuaspleuserasp

65707580

gluileargasplyspheilelysglnpheiletyrglualaglyile

859095

argthrprolystyrlystyrleuvalpheasptyrleuaspglnile

100105110

thrasnserlyslysleuvalleulysthrmetgluglyileglnile

115120125

seraspileproargarglysarggluileglulysserleuvalasp

130135140

leuilegluthrgluaspglupheilealaaspprometproasnleu

145150155160

tyrphethrargaspprophealaservalglygluglyileserleu

165170175

asnlysmettyrservalthrargasnarggluthriletyralaglu

180185190

tyrilephelystyrhisproasptyrlysaspglnalaargleutyr

195200205

tyraspargtyrasnprotyrhisilegluglyglyaspvalleuasn

210215220

ileasnasphisvalleualaileglyileserglnargthrthrala

225230235240

glualaileaspglnilealalysasnleuphelysaspproglucys

245250255

lysileaspthrileleualapheasnileprogluserargalaphe

260265270

methisleuaspthrvalphethrglnvalasptyrasplysphethr

275280285

tyrhisproglyilemetglythrleuglnvalphegluilethrglu

290295300

glyaspaspproasnseraspgluaspleuthrvalthrgluileasn

305310315320

alaproleuglugluileleuthrlystyrvalglyarglysvalthr

325330335

leuileprocysalaglyglyasplysvalseralagluargglugln

340345350

trpasnaspglyserasnthrleucysilealaproglyvalvalval

355360365

valtyraspargasnasnleuthrasnalavalleuargsertyrgly

370375380

leulysvalilegluilehisglyalagluleuserargglyarggly

385390395400

glyproargcysmetsermetproleuvalarggluaspile

405410

<210>56

<211>408

<212>prt

<213>支原体属cag:472（mycoplasmasp.cag:472）

<400>56

methisvalthrsergluilelyslysleulyslysvalleuvalhis

151015

argproglylysgluleuleuasnleuthrproaspthrleuglyarg

202530

leuleupheaspaspileprotyrleulysaspalaileleugluhis

354045

aspgluphecysglnileleuargaspasnaspvalgluvalvaltyr

505560

leugluaspleumetalagluthrleuaspgluasnproglnvallys

65707580

proserpheileargglnpheiletyrglualaglyvalargthrpro

859095

lystyrlysaspleuleupheasptyrleumetsertyrthrasnasn

100105110

lysgluleuvalleulysthrmetgluglyilelysvalsergluval

115120125

hisargasnlysglnaspserglutyrserleuvalaspglnileser

130135140

glugluthrlyspheleualagluprometproasnleutyrphethr

145150155160

argaspprophealaservalglyaspglyileileleuasnlysmet

165170175

hisservalthrargserarggluthriletyralatyrtyrilephe

180185190

asntyrhisproasptyrmetasplysvalprolystyrtyrasparg

195200205

gluasnpropheserilegluglyglyaspvalleuasnleuasnglu

210215220

histhrleualaileglyileserglnargthrseralaglualaile

225230235240

aspleuvalalalysasnmetpheasnaspglulyscysasnileasp

245250255

thrileleualaphelysileproglucysargalaphemethisleu

260265270

aspthrvalphethrglnileaspileasplysphethrtyrhispro

275280285

glyilemetaspthrleugluvalphegluilethrlysasngluasp

290295300

aspleuaspgluvalargvalilelyslysgluglyserleugluasn

305310315320

ileleugluglutyrleuglyileaspilethrleuileprocysala

325330335

glyglyasplysilealasergluarggluglntrpasnaspglythr

340345350

asnthrleucysilealaproglyvalvalvalvaltyrasnargasn

355360365

asnilethrasngluvalleuargglulysglyilelysvalileglu

370375380

metasnseralagluleuserargglyargglyglyproargcysmet

385390395400

sermetproleugluarggluasp

405

<210>57

<211>401

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-鸽支原体-鸡支原体嵌合adi

<400>57

metserlysileasnvaltyrsergluileglygluleulysgluval

151015

leuvalhisthrproglyaspgluileargargileserproserarg

202530

leuaspgluleuleupheseralaileleugluproasnglualaile

354045

lysgluhislysglypheleulysileleuglnasplysglyilelys

505560

valileglnleuseraspleuvalalagluthrtyrvallystyrala

65707580

thralagluglnlysalaalapheileglulystyrleuaspgluala

859095

thrproalaleuseralagluasnarggluargalalyslystyrile

100105110

leuserleuglumetglnprovallysmetileargthrmetmetala

115120125

glyleuserlystyrgluleuasnvalgluserasnilegluleuile

130135140

ileaspprometproasnleutyrphethrargaspprophealaser

145150155160

alaglyasnglyileserleuasnasnmetlystyrvalthrarglys

165170175

arggluthrilephealaglupheilephealathrhisproasptyr

180185190

lysthrthrprohistrppheaspargleuaspgluglyasnileglu

195200205

glyglyaspvalpheiletyrasnlysaspthrleuvalileglyval

210215220

sergluargthrasnlysglualaileleuthrilealalyslysile

225230235240

lysasnasnlysglualalysphelyslysilevalalaileasnval

245250255

proprometproasnleumethisleuaspthrtrpleuthrmetval

260265270

asplysasplyspheleutyrserproasnmetleuservalleulys

275280285

valtrpgluileaspleuserlysgluileglumetvalgluthrasn

290295300

lysproleualaaspvalleugluserileileglyvallysproval

305310315320

leuileproilealaglylysglyalathrglnleuaspileaspile

325330335

gluthrhispheaspglythrasntyrleuthrilealaproglyval

340345350

valvalglytyrserargasnilelysthrglualaalaleuargala

355360365

alaglyvalthrvalleuserphegluglyasnglnleuserleugly

370375380

metglyseralaargcysmetsermetproleuvalarggluaspval

385390395400

lys

<210>58

<211>401

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-鸽支原体-惰性支原体嵌合adi

<400>58

metserlysileasnvaltyrsergluileglygluleulysgluval

151015

leuvalhisthrproglyaspgluileargargileserproserarg

202530

leuaspgluleuleupheseralaileleugluproasnglualaile

354045

lysgluhislysglypheleulysileleuglnasplysglyilelys

505560

valileglnleuseraspleuvalalagluthrtyrlyshistyrala

65707580

serglualaglulysglualapheileglulystyrleuaspgluala

859095

thrprovalleuserlysaspmetargalalysvallysasntyrile

100105110

leusermetglnglygluprovallysmetvalargthrmetmetala

115120125

glyvalserlysglngluleuasnvalglusergluvalgluleuile

130135140

valaspprometproasnleutyrphethrargaspprophealaser

145150155160

alaglyasnglyileserleuasnasnmetlystyrvalthrarglys

165170175

arggluthrilephealaglupheilephealathrhisproasptyr

180185190

lysthrthrprohistrppheaspargleuaspgluglyasnileglu

195200205

glyglyaspvalpheiletyrasnlysaspthrleuvalileglyval

210215220

sergluargthrasnlysglualaileleuthrilealalyslysile

225230235240

lysasnasnlysglualalysphelyslysilevalalaileasnval

245250255

proprometproasnleumethisleuaspthrtrpleuthrmetval

260265270

asplysasplyspheleutyrserproasnmetleuservalleulys

275280285

valtrpgluileaspleuserlysgluileglumetvalgluthrasn

290295300

lysproleualaaspvalleugluserileileglyvallysproval

305310315320

leuileproilealaglylysglyalathrglnleuaspileaspile

325330335

gluthrhispheaspglythrasntyrleuthrilealaproglyval

340345350

valvalglytyrserargasnilelysthrglualaalaleuargala

355360365

alaglyvalthrvalleuserphegluglyasnglnleuserleugly

370375380

metglyseralaargcysmetsermetproleuvalarggluaspval

385390395400

lys

<210>59

<211>401

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-鸽支原体-火鸡支原体嵌合adi

<400>59

metserlysileasnvaltyrsergluileglygluleulysgluval

151015

leuvalhisthrproglyaspgluileargargileserproserarg

202530

leuaspgluleuleupheseralaileleugluproasnglualaile

354045

lysgluhislysglypheleulysileleuglnasplysglyilelys

505560

valileglnleuseraspleuvalalagluthrtyrvallystyrala

65707580

thrserlysglulysgluserpheileglulystrpleuaspgluala

859095

thrproalaleuasnsergluasnargalaargvallysasntyrile

100105110

thralametglnglyglnprovallysmetvalargalametmetala

115120125

glyvalserlysglngluleuasnilegluseraspvalgluleuile

130135140

valaspprometproasnleutyrphethrargaspprophealaser

145150155160

alaglyasnglyileserleuasnasnmetlystyrvalthrarglys

165170175

arggluthrilephealaglupheilephealathrhisproasptyr

180185190

lysthrthrprohistrppheaspargleuaspgluglyasnileglu

195200205

glyglyaspvalpheiletyrasnlysaspthrleuvalileglyval

210215220

sergluargthrasnlysglualaileleuthrilealalyslysile

225230235240

lysasnasnlysglualalysphelyslysilevalalaileasnval

245250255

proprometproasnleumethisleuaspthrtrpleuthrmetval

260265270

asplysasplyspheleutyrserproasnmetleuservalleulys

275280285

valtrpgluileaspleuserlysgluileglumetvalgluthrasn

290295300

lysproleualaaspvalleugluserileileglyvallysproval

305310315320

leuileproilealaglylysglyalathrglnleuaspileaspile

325330335

gluthrhispheaspglythrasntyrleuthrilealaproglyval

340345350

valvalglytyrserargasnilelysthrglualaalaleuargala

355360365

alaglyvalthrvalleuserphegluglyasnglnleuserleugly

370375380

metglyseralaargcysmetsermetproleuvalarggluaspval

385390395400

lys

<210>60

<211>401

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-鸡支原体-鸽支原体嵌合adi

<400>60

metserlysileargvaltyrsergluileglyasnleulyslysval

151015

leuvalhisthrproglyaspgluileargargileserproserarg

202530

leuglugluleuleupheseralavalleugluproasnalaalaile

354045

glugluhislysargphevallysleuleugluaspargglyilegln

505560

alaileglnleuseraspleuvalalagluthrtyrthrtyrhisala

65707580

thrglnlysgluargglualapheileglulystrpleuaspgluala

859095

gluproalaleuthrlysaspleuargalalysvallyssertyrval

100105110

leuserlysgluglythrprovalalametvalargthrmetmetala

115120125

glyvalserlysglngluleuasnvalglusergluthrgluleuval

130135140

valaspprometproasnleutyrphethrargaspprophealaser

145150155160

alaglyasnglyileserleuasnasnmetlystyrvalvalarglys

165170175

arggluthrilephealaglupheilephealailehisproglutyr

180185190

lysgluthrprohistrppheaspargleuasphisglyserileglu

195200205

glyglyaspvalphevaltyrasnlysaspthrleuvalileglyval

210215220

sergluargthrasnlysglualaileilethrilealalyshisile

225230235240

glnaspasnlysglualagluphelyslysilevalalaileasnval

245250255

proprometproasnleumethisleuaspthrtrpleuthrmetval

260265270

asplysasnlyspheiletyrserproasnmetleuservalleulys

275280285

iletrpgluileaspleualalysproileglumetvalgluserasn

290295300

lysserleuthrgluvalleugluserileileglyglulysproile

305310315320

leuileproilealaglygluglyalaserglnleuaspileaspile

325330335

gluthrhispheaspglythrasntyrleuthrilealaproglyval

340345350

valvalglytyrserargasnglulysthrglulysalaleulysala

355360365

alaglyilethrvalleuserphegluglyasnglnleuserleugly

370375380

metglyseralaargcysmetsermetproleuvalarggluaspval

385390395400

lys

<210>61

<211>401

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-鸡支原体-惰性支原体嵌合adi

<400>61

metserlysileargvaltyrsergluileglyasnleulyslysval

151015

leuvalhisthrproglyaspgluileargargileserproserarg

202530

leuglugluleuleupheseralavalleugluproasnalaalaile

354045

glugluhislysargphevallysleuleugluaspargglyilegln

505560

alaileglnleuseraspleuvalalagluthrtyrlyshistyrala

65707580

serglualaglulysglualapheileglulystyrleuaspgluala

859095

thrprovalleuserlysaspmetargalalysvallysasntyrile

100105110

leusermetglnglygluprovallysmetvalargthrmetmetala

115120125

glyvalserlysglngluleuasnvalglusergluvalgluleuile

130135140

valaspprometproasnleutyrphethrargaspprophealaser

145150155160

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lys

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<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

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lys

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<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

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225230235240

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asplysasnlyspheleutyrserproasnmetleuservalleulys

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lys

<210>66

<211>401

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-火鸡支原体-鸽支原体嵌合adi

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151015

leuvalhisthrproglyaspgluileargargileserproserarg

202530

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145150155160

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165170175

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180185190

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275280285

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lys

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<213>人工序列（artificialsequence）

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lys

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<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

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<223>实验室制备-火鸡支原体-惰性支原体嵌合adi

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asplysasnlyspheleutyrserproasnmetleuservalleulys

275280285

iletrpgluileaspleuserlysgluilelysmetvalgluthrser

290295300

lysproleualaaspvalleugluserileileglyglulysproile

305310315320

leuileproilealaglygluasnalaserglnleuaspileaspile

325330335

gluthrhispheaspglythrasntyrleuthrilealaproglyval

340345350

valvalglytyrserargasnvallysthrglualaalaleulysala

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alaglyvalthrvaltyrserpheaspglyasnglnleuserleugly

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lys

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<213>智人（homosapiens）

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354045

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lystrpglnleuargglnleuvalarglysmetileleuargthrser

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115120125

thrargglyargserasnthrleuserserproasnserlysasnglu

130135140

lysalaleuglyarglysileasnsertrpgluserserargsergly

145150155160

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165170175

hisglulysglyphetyrtyriletyrserglnthrtyrpheargphe

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glnglugluilelysgluasnthrlysasnasplysglnmetvalgln

195200205

tyriletyrlystyrthrsertyrproaspproileleuleumetlys

210215220

seralaargasnsercystrpserlysaspalaglutyrglyleutyr

225230235240

seriletyrglnglyglyilephegluleulysgluasnaspargile

245250255

phevalservalthrasngluhisleuileaspmetasphisgluala

260265270

serphepheglyalapheleuvalgly

275280

<210>70

<211>168

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>70

valarggluargglyproglnargvalalaalahisilethrglythr

151015

argglyargserasnthrleuserserproasnserlysasnglulys

202530

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354045

serpheleuserasnleuhisleuargasnglygluleuvalilehis

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859095

iletyrlystyrthrsertyrproaspproileleuleumetlysser

100105110

alaargasnsercystrpserlysaspalaglutyrglyleutyrser

115120125

iletyrglnglyglyilephegluleulysgluasnaspargilephe

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145150155160

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165

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<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>71

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151015

leuprolyslysthrglyglyproglnglyserargargcysleuphe

202530

leuserleupheserpheleuilevalalaglyalathrthrleuphe

354045

cysleuleuhispheglyvalileglyproglnargglugluphepro

505560

argaspleuserleuileserproleualaglnalavalargserser

65707580

serargthrproserasplysprovalalahisvalvalalaasnpro

859095

glnalagluglyglnleuglntrpleuasnargargalaasnalaleu

100105110

leualaasnglyvalgluleuargaspasnglnleuvalvalproser

115120125

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130135140

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valsertyrglnthrlysvalasnleuleuseralailelysserpro

165170175

cysglnarggluthrprogluglyalaglualalysprotrptyrglu

180185190

proiletyrleuglyglyvalpheglnleuglulysglyaspargleu

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seralagluileasnargproasptyrleuaspphealaglusergly

210215220

glnvaltyrpheglyileilealaleu

225230

<210>72

<211>281

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>72

metglnglnpropheasntyrprotyrproglniletyrtrpvalasp

151015

serseralaserserprotrpalaproproglythrvalleuprocys

202530

prothrservalproargargproglyglnargargpropropropro

354045

proproproproproleuproproproproproproproproleupro

505560

proleuproleuproproleulyslysargglyasnhisserthrgly

65707580

leucysleuleuvalmetphephemetvalleuvalalaleuvalgly

859095

leuglyleuglymetpheglnleuphehisleuglnlysgluleuala

100105110

gluleuarggluserthrserglnmethisthralaserserleuglu

115120125

lysglnileglyhisproserproproproglulyslysgluleuarg

130135140

lysvalalahisleuthrglylysserasnserargsermetproleu

145150155160

glutrpgluaspthrtyrglyilevalleuleuserglyvallystyr

165170175

lyslysglyglyleuvalileasngluthrglyleutyrphevaltyr

180185190

serlysvaltyrpheargglyglnsercysasnasnleuproleuser

195200205

hislysvaltyrmetargasnserlystyrproglnaspleuvalmet

210215220

metgluglylysmetmetsertyrcysthrthrglyglnmettrpala

225230235240

argsersertyrleuglyalavalpheasnleuthrseralaasphis

245250255

leutyrvalasnvalsergluleuserleuvalasnpheglugluser

260265270

glnthrphepheglyleutyrlysleu

275280

<210>73

<211>4

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-连接子

<400>73

glyserglyser

1

<210>74

<211>4

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-连接子

<400>74

glyglysergly

1

<210>75

<211>4

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-连接子

<400>75

glyglyglyser

1

<210>76

<211>5

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-连接子

<400>76

glyglyglyglyser

15

<210>77

<211>4

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-连接子

<400>77

glyasnglyasn

1

<210>78

<211>4

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-连接子

<400>78

glyglyasngly

1

<210>79

<211>4

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-连接子

<400>79

glyglyglyasn

1

<210>80

<211>5

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-连接子

<400>80

glyglyglyglyasn

15

<210>81

<211>7

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-连接子

<400>81

alaglualaalaalalysala

15

<210>82

<211>12

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-连接子

<400>82

alaglualaalaalalysglualaalaalalysala

1510

<210>83

<211>6

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-连接子

<400>83

alaproalaprolyspro

15

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<211>12

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-连接子

<400>84

alaproalaprolysprogluproalaprolyspro

1510

<210>85

<211>10

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-连接子

<400>85

glyglyglyglyserglyglyglyglyser

1510

<210>86

<211>5

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-连接子

<400>86

aspglyglyglyser

15

<210>87

<211>5

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-连接子

<400>87

thrglyglulyspro

15

<210>88

<211>4

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-连接子

<400>88

glyglyargarg

1

<210>89

<211>14

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-连接子

<400>89

gluglylysserserglyserglysergluserlysvalasp

1510

<210>90

<211>18

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-连接子

<400>90

lysgluserglyservalsersergluglnleualaglnpheargser

151015

leuasp

<210>91

<211>8

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-连接子

<400>91

glyglyargargglyglyglyser

15

<210>92

<211>9

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-连接子

<400>92

leuargglnargaspglygluargpro

15

<210>93

<211>12

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-连接子

<400>93

leuargglnlysaspglyglyglysergluargpro

1510

<210>94

<211>16

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-连接子

<400>94

leuargglnlysaspglyglyglyserglyglyglysergluargpro

151015

<210>95

<211>10

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>共有kozak序列

<400>95

rccrccatgg10

<210>96

<211>6

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-连接子

<220>

<221>mod_res

<222>(1)..(1)

<223>xaa是任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(3)..(3)

<223>xaa是任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(5)..(5)

<223>xaa是任何氨基酸

<400>96

xaaproxaaproxaapro

15

<210>97

<211>12

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>实验室制备-连接子

<220>

<221>mod_res

<222>(1)..(1)

<223>xaa是任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(3)..(3)

<223>xaa是任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(5)..(5)

<223>xaa是任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(7)..(7)

<223>xaa是任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(9)..(9)

<223>xaa是任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(11)

<223>xaa是任何氨基酸

<400>97

xaaproxaaproxaaproxaaproxaaproxaapro

1510