一种用于肿瘤光热治疗联合免疫治疗的抗体偶联硒化铋纳米颗粒及其制备方法与流程

本发明属于药物制剂领域，涉及一种用于肿瘤光热治疗联合免疫治疗的抗体偶联硒化铋纳米颗粒及其制备方法，具体涉及一种利用近红外激光和抗cd47抗体实现肿瘤的光热治疗联合免疫治疗的硒化铋纳米粒及其制备方法。

技术背景

过去几百年来，癌症是严重威胁人类健康和生命的疾病之一。据有关数据显示，我国居民恶性肿瘤死亡率比70年代中期增加了83.1％。目前，肿瘤治疗的主要三种治疗方法包括外科切除、放射治疗和化学治疗。但是上述方法对正常组织会造成附带损害和严重毒性，治疗效果不甚理想。光热疗法(ptt)作为一种光触发的非侵入性治疗策略，可以选择性高效杀死肿瘤细胞，近年来受到了极大的关注。该方法采用对组织穿透力较强的近红外光(nir)辐射肿瘤组织，在光热转换试剂的作用下,将激光能量转换为局部热量使肿瘤组织温度升高，从而达到杀伤肿瘤细胞的目的。但是有些肿瘤体积过大，处在照射边缘的肿瘤组织很难被完全消融，导致光热治疗后肿瘤易复发。因此，单一的光热治疗不足以彻底根除肿瘤，有必要联合其他手段共同对抗肿瘤来提高疗效。

癌症免疫治疗方兴未艾。巨噬细胞在人体的免疫活动中起着极其重要的作用，在肿瘤组织中，肿瘤相关巨噬细胞更是占肿瘤浸润免疫细胞的很大一部分。但如此数量庞大的巨噬细胞却没有发挥他们的吞噬作用。其中一个重要的原因是大部分肿瘤细胞表面都高表达cd47。cd47又称整联蛋白相关蛋白，其配体为巨噬细胞表面的信号调节蛋白α链(sirpα)。肿瘤细胞与巨噬细胞形成cd47-sirpα信号复合体可引起巨噬细胞表面sirpα的胞内结构域中免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)发生磷酸化，传导抑制性信号即“不吃我”信号而降低巨噬细胞的吞噬活性，从而促进肿瘤细胞的免疫逃逸。目前，已经有三种针对cd47的拮抗剂已经进入一期临床试验。虽然在肿瘤细胞表面都高表达cd47，但是在人体一些其他细胞上，例如红细胞，表面也普遍表达cd47，全身给予这些拮抗剂会引起严重贫血。因此，如何将cd47拮抗剂靶向递送至肿瘤部位从而减轻贫血反应是亟待解决的难题。

因此，开发新型的多功能纳米制剂用于肿瘤光热治疗和靶向cd47的免疫治疗是非常有必要的。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种光热治疗联合阻断cd47免疫检查点的硒化铋纳米组合物及其制备方法。

本发明采用的技术方案为：

一种用于肿瘤光热治疗联合免疫治疗的抗体偶联硒化铋纳米颗粒，该抗体偶联硒化铋纳米颗粒以氨基化的硒化铋为载体，peg为交联剂，将抗cd47抗体偶联于纳米颗粒表面。在静脉注射该抗体偶联硒化铋纳米粒悬液后，纳米粒会通过epr效应大量靶向聚集在肿瘤部位，避免了单独抗cd47抗体全身给药而引起的贫血。同时，表面修饰的抗cd47抗体与肿瘤细胞表面高表达的cd47分子特异性识别，封闭cd47与sirpα信号通路，从而使巨噬细胞重新获得吞噬肿瘤细胞的能力。特别是在光热治疗后，残余的肿瘤细胞会因为“不吃我”信号通路被封闭而被巨噬细胞清除，达到彻底根除肿瘤的目的。

一种用于肿瘤光热治疗联合免疫治疗的抗体偶联硒化铋纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

第一步，合成硒化铋纳米颗粒

1.1)将铋盐完全溶解于硝酸溶液中，并加入氢氧化钠调节反应体系ph。室温下，将聚乙烯吡咯烷酮与乙二醇在功率为1200-1500r/min磁力搅拌器上搅拌30-60min得到混合溶液。然后混合两种溶液继续搅拌，搅拌时间不低于30min。所述的铋盐的质量与硝酸溶液体积比为1g:(20～30)ml；铋盐的质量与聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1:(2～4)；铋盐的质量与乙二醇溶液体积比为1g:(100～200)ml。

1.2)将步骤1.1)得到的混合液移至高压反应釜中，130-170℃水热反应2h-5h后得到乳白色液体，反应液用去离子水清洗2-3次，得到氧化铋纳米粒子。

1.3)室温下，将氧化铋纳米粒子溶于水中，再加入硒源搅拌后，再向其中加入氧化剂，得到反应液，反应液中硒化铋纳米颗粒的浓度为(7～10)mg/ml；最后将反应体系移至高压反应釜中，130-180℃水热反应8h-24h后，得到黑褐色液体，反应溶液用去离子水与乙醇清洗3-5次，烘干得到硒化铋纳米颗粒。

所述的硒源为na2seo3。所述的氧化剂为葡萄糖，硒源与葡萄糖的质量比为1：(2～4)；所述的氧化铋纳米粒子与硒源质量比为1:(0.3-0.8)。

第二步，合成peg偶联的硒化铋纳米颗粒

2.1)室温下，将硒化铋纳米颗粒溶于水溶液中的，得到浓度为2.5mg/ml的硒化铋溶液；再将硒化铋溶液加入无水乙醇中搅拌均匀后，再加入三氨丙基三甲氧基硅烷(aptms)，并加入氨水保证反应在碱性条件下进行，避光搅拌24-36h使其充分反应，得到反应液。将反应液用无水乙醇和去离子水清洗2-3次，冷冻干燥得到氨基化的硒化铋纳米颗粒。

所述的每4-20ml的无水乙醇对应加入2-10ml的硒化铋溶液、0.5-2.5ml的aptms、2ml-10ml的氨水。

2.2)peg2000用edc与nhs活化0.5-4h。所述的peg2000与edc的摩尔比为1:(1.5-4)；peg2000与nhs的摩尔比为1:(1.5-4)。

2.3)在活化好的peg2000中加入步骤2.1)得到的氨基化硒化铋纳米粒子，室温条件下搅拌24-36h得到peg-bi2se3，所得反溶液中peg的浓度为5-10mg/ml。

第三步，合成抗体偶联的硒化铋纳米颗粒

3.1)将2.3)得到的反应液用edc与nhs活化0.5-4h，并溶解于pbs溶液中。所述的peg2000与edc的摩尔比为1:(1.5-4)；peg2000与nhs的摩尔比为1:(1.5-4)。

3.2)将抗cd47抗体加入上述溶液中，在4℃-24℃下搅拌24-36h，得到抗cd47抗体偶联的peg-bi2se3纳米粒子，抗cd47抗体与peg质量之比为1：(300～700)，所得纳米粒子中抗cd47抗体的浓度为1-10μg/ml。

本发明的有益效果为：本发明提供一种能够将光热治疗与免疫治疗结合起来根除肿瘤的新型抗体偶联纳米粒子。硒化铋纳米复合物在近红外范围内具有强而广泛的吸收，较高的光热转换性能以及高的转换稳定性，在近红外激光的照射下，能够有效的杀伤肿瘤细胞。大面积的肿瘤死亡会分泌大量的抗肿瘤细胞因子从而激活免疫反应，由于纳米粒表面修饰的抗cd47抗体与肿瘤细胞表面cd47分子结合，封闭“不吃我”信号，进而增强巨噬细胞的吞噬作用，达到清除残留肿瘤细胞防止肿瘤复发的目的。此外，由于epr效应，该纳米颗粒能够在肿瘤部位靶向蓄积，避免了抗cd47抗体全身给药引起的不良反应，如贫血。本发明方法设计合理，制备工艺简单，具有广阔的应用前景，同时也为相应给药系统的设计和发展打下基础。

附图说明

图1为用透射电镜观察到的硒化铋纳米粒形态图；

图2为用能谱仪分析硒化铋纳米粒的元素组成图；

图3为用透射电镜观察到的抗体偶联的硒化铋纳米粒形态图；

图4为用能谱仪分析抗体偶联的硒化铋纳米粒的元素组成图；

图5为采用动态光散射仪分析得到的硒化铋纳米粒和抗体偶联硒化铋纳米粒的粒径分布图；

图6为硒化铋纳米粒和抗体偶联硒化铋纳米粒的红外光谱对比图；

图7为不同浓度的抗体偶联硒化铋纳米粒分散液的光热升温曲线图；

图8为不同浓度抗体偶联硒化铋纳米颗粒分散液光热升温温差图；

图9为200μg/ml抗体偶联硒化铋纳米颗粒分散液光热升温循环图；

图10为不同浓度的抗体偶联的硒化铋纳米粒与a549细胞孵育并在不同激光照射时长下的细胞活性；

图11为用单独抗cd47抗体，peg偶联的硒化铋纳米粒和抗体偶联的硒化铋纳米粒孵育肿瘤细胞后巨噬细胞的吞噬能力；

图12为各组小鼠的肿瘤体积变化图；

图13为各组小鼠的肿瘤质量图；

图14为各浓度下的纳米粒子对a549细胞以及mcf10a细胞的毒性图。

图15为各组小鼠的红细胞和血红蛋白值。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

一种用于肿瘤光热治疗联合免疫治疗的抗体偶联硒化铋纳米颗粒，该抗体偶联硒化铋纳米颗粒以氨基化的硒化铋为载体，peg为交联剂，将抗cd47抗体偶联于纳米颗粒表面。。在静脉注射该抗体偶联硒化铋纳米粒悬液后，纳米粒会通过epr效应大量靶向聚集在肿瘤部位，避免了单独抗cd47抗体全身给药而引起的贫血。同时，表面修饰的抗cd47抗体与肿瘤细胞表面高表达的cd47分子特异性识别，封闭cd47与sirpα信号通路，从而使巨噬细胞重新获得吞噬肿瘤细胞的能力。特别是在光热治疗后，残余的肿瘤细胞会因为“不吃我”信号通路被封闭而被巨噬细胞清除，达到彻底根除肿瘤的目的。

一种用于肿瘤光热治疗联合免疫治疗的抗体偶联硒化铋纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

第一步，合成硒化铋纳米颗粒(bi2se3)

1.1)精密称取365mg的bi(no3)3·5h2o溶于10ml1mol/l的nho3溶液并置于100ml小烧杯中，然后向混合液中加入106mg的naoh得到混合溶液。50ml乙二醇(eg)放在磁力搅拌器上以1200r/min功率边搅拌边加入聚乙烯吡咯烷酮(pvp)1.2g，然后将混合溶液超声5min。最后混合上述两种反应溶液移至高压反应釜内，150℃水热3h。将得到的反应液用去离子水洗3次，再次溶于10ml去离子水以备后续反应。

1.2)将10ml氧化铋溶液与200mg的na2seo3混合在一起并搅拌10min，然后过程中加入还原剂葡萄糖614mg，将反应液移至高压反应釜中150℃水热12h。将得到的反应液用去离子水和乙醇洗三次，冷冻干燥后得到硒化铋纳米颗粒。反应液中硒化铋纳米颗粒浓度为9mg/ml。

将硒化铋纳米颗粒制成溶液滴加到硅片上，待自然晾干后，用透射电镜进行观察，如图1所示，形貌为球形，粒径约为150nm。同时进行元素扫描分析，如图2所示，证实了所合成的纳米颗粒包含硒元素和铋元素。

第二步，合成peg偶联的硒化铋纳米颗粒

2.1)将5mg硒化铋溶于2ml去离子水中，并与4ml乙醇混合均匀搅拌，并向混合液中依次加入0.5mlaptms和2ml氨水，避光搅拌24小时得到反应液，用去离子水清洗3次，得到氨基化的硒化铋纳米颗粒。

2.2)10mgpeg2000与1.91mgedc和1.15mgnhs溶于2ml去离子水中搅拌2h，活化peg2000的羧基。

2.3)将活化好的peg2000用去离子洗2次后溶于2ml去离子水中，与2.1)中制备的氨基化的硒化铋混合搅拌24h。得到的反应液用去离子水洗3次，得到peg-bi2se3溶液，所得到的溶液的peg浓度为6.5mg/ml。

第三步，合成抗体偶联的硒化铋纳米颗粒

3.1)将2.3)中制备好的peg-bi2se3溶液与1.24mgedc和0.75mgnhs混合搅拌2h，活化peg-bi2se3的羧基。

3.2)两个小时后将上诉溶液用pbs洗两次并最终溶于1mlpbs溶液，然后加入10μg抗cd47抗体在4℃下搅拌24h。最终用pbs洗三次，冷冻干燥得到ab-peg-bi2se3纳米颗粒，抗cd47抗体最终浓度达到9μg/ml。

将抗体偶联硒化铋纳米颗粒制成溶液滴加到硅片上，待自然晾干后，用透射电镜进行观察，如图3所示，形貌为球形，粒径约为170nm。同时进行元素扫描分析，如图4所示，对比硒化铋，抗体偶联的硒化铋增加了c、n、o和si，证明peg和抗cd47抗体的成功修饰。将硒化铋与抗体偶联硒化铋纳米颗粒用动态光散射仪进行粒径分析，图5为粒径分布，可以看出硒化铋粒径主要分布在180nm处，抗体偶联硒化铋粒径主要分布在210nm处。将硒化铋和抗体偶联的硒化铋制成粉末，用于红外分析，如图6所示，对比硒化铋，抗体偶联的硒化铋增加了来自羧基的特征吸收峰(1081cm^-1,1746cm^-1)和酰胺键的特征吸收峰(1236cm^-1)，进一步证明了peg与抗体的成功偶联。

抗体偶联的硒化铋纳米粒光热性能的测试

将体积为1ml的抗体偶联硒化铋纳米颗粒分散液在不同浓度梯度下(0，10,50,100和200μg/ml)用808nm近红外激光照射10分钟，每隔30秒用热电偶测量溶液温度。图7是各个浓度纳米粒子的升温图。可以看到水在10min的激光照射下几乎不升温，而200μg/ml的抗体偶联硒化铋纳米颗粒在10min照射内从24.5℃升到了66.3℃。图8是不同浓度抗体偶联硒化铋纳米颗粒分散液光热升温温差图。从图中更能直观的看见分散液的浓度越高，升温越高，证明抗体偶联硒化铋纳米颗粒优异的升温性能。

将1ml200μg/ml抗体偶联硒化铋纳米颗粒分散液用808nm近红外激光照射下照射十分钟，然后自然冷却至初始温度，之后再开启近红外激光照射十分钟，自然冷却至室温，如此反复五次。每隔30s用热电偶记录溶液温度。图9是抗体偶联硒化铋纳米颗粒的光热升温循环图。可以看到五次反复循环以后，抗体偶联硒化铋纳米颗粒的温度仍能升到第一次照射十分钟后的温度，证明此纳米粒子拥有良好的光热转换稳定性。

抗体偶联的硒化铋纳米粒对细胞的光热治疗

将a549细胞置于96孔板放在37℃co2培养箱中孵育过夜。第二天移除培养基，并分别向孔内加入不同浓度的抗体偶联的硒化铋纳米粒(0，5，10，20，40和60μg/ml)，孵育12小时后，将旧培养基移除，加入新鲜培养基，并用808nm近红外激光分别照射0,5和10min，放在co2培养箱37℃继续培养12h，然后每孔中加入10μlcck-8溶液，继续培养1h。取出后在酶标仪上于450nm测定吸光度od值。按以下公式计算细胞存活率。

细胞存活率(％)＝(od样品/od对照)×100％

图10是不同浓度的抗体偶联的硒化铋纳米粒在不同激光照射时长下的细胞活性。可以看到在没加激光照射下各组细胞存活率均在90％以上，当在5min照射下高浓度的抗体偶联的硒化铋纳米粒显示出对细胞较强的杀伤，而激光照射时长达到10min时，60μg/ml的抗体偶联的硒化铋纳米粒对细胞的杀伤率达到95％以上，证明了抗体偶联的硒化铋纳米粒对细胞有良好的光热治疗能力。

抗体偶联的硒化铋纳米粒对细胞的免疫治疗

首先提取小鼠腹腔内巨噬细胞放在37℃co2培养箱中培养以备后用。将100μla549细胞悬液分别与抗cd47抗体、peg偶联的硒化铋纳米粒和抗体偶联的硒化铋纳米颗粒于96孔板上共同孵育30min后，每个孔加入100μl巨噬细胞，继续孵育4h。然后利用cck-8试剂盒检测每孔细胞存活率。每孔内巨噬细胞：a549细胞＝20:1，并保证抗cd47抗体的量为每孔1μg。图11为用单独抗cd47抗体，peg偶联的硒化铋纳米粒和抗体偶联的硒化铋纳米粒孵育肿瘤细胞后巨噬细胞的吞噬情况。从图中可以看出当用单独抗体和抗体偶联的硒化铋纳米粒孵育肿瘤细胞以后，巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力明显增强，证明了抗体偶联的硒化铋纳米粒能够成功封闭肿瘤表面cd47分子与巨噬细胞表面sirpα的信号通路，从而使巨噬细胞重新获得吞噬能力。

抗体偶联的硒化铋纳米粒在体内的组合治疗

将4t1细胞(1×10⁶200μlpbs悬液)皮下注射到每只小鼠的左下肢以形成肿瘤。在肿瘤体积达到100mm³时将小鼠随机分成6组，每组4只小鼠。(1)pbs；(2)peg偶联硒化铋纳米颗粒；(3)仅激光照射；(4)抗体偶联的硒化铋纳米颗粒；(5)peg偶联硒化铋纳米颗粒+激光照射；(6)抗体偶联的硒化铋纳米颗粒+激光照射。分别在第一天和第四天静脉注射pbs，peg偶联硒化铋纳米粒悬液和抗体偶联硒化铋纳米粒悬液(10mg/ml，100μl)，静脉注射12小时后，将组(3)，(5)和(6)的小鼠肿瘤用激光照射10min。每隔两天记录小鼠的肿瘤体积。并在实验结束后，将各组小鼠安乐死，取出肿瘤并称重。图12为各组小鼠的肿瘤体积变化图。从图中可以看出用pbs，peg偶联硒化铋纳米粒和单独激光处理组的小鼠肿瘤呈现自然生长趋势；peg偶联硒化铋纳米粒+激光照射组肿瘤在治疗的前三天明显受到抑制，但第5天肿瘤复发并疯狂增殖；单独注射抗体偶联硒化铋纳米粒组的小鼠肿瘤，可能由于抗体的作用，在治疗的第3～7天显示肿瘤抑制作用，但肿瘤在第7天像第四组一样复发；而由抗体偶联的硒化铋纳米粒子加激光照射处理的组的小鼠肿瘤在开始时便被有效抑制，并且在整个实验期间没有观察到肿瘤复发。图13是各组小鼠的肿瘤质量，与上述结果一致，由抗体偶联的硒化铋纳米粒子加激光照射处理的组的小鼠肿瘤质量最轻，几乎为零。证明了抗体偶联的硒化铋纳米粒子有效的体内光热治疗和免疫治疗。

抗体偶联的硒化铋纳米粒的生物安全性

将a549细胞和mcf10a细胞接种于96孔板，5×10³/孔，过夜培养使贴壁。第二天移除培养基，分别加入不同浓度梯度的抗体偶联的硒化铋纳米粒悬液(0，5，10，100，200，300，400和500μg/ml)继续在37℃co2培养箱中孵育24h。然后用cck-8试剂盒检测每孔细胞活性。图14显示当纳米粒子浓度高达500μg/ml时，a549细胞和mcf10a细胞的活性仍在90％以上，证明纳米粒子的安全性。此外，在体内实验结束的同时进行了各组小鼠的血常规分析。图15为各组小鼠的红细胞和血红蛋白值。从图中观察到各处理组的红细胞和血红蛋白的值与正常组小鼠没有明显差异，进一步证明了抗体偶联的硒化铋纳米粒子良好的血液相容性以及生物安全性。

实施例2

一种用于肿瘤光热治疗联合免疫治疗的抗体偶联硒化铋纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

第一步，合成硒化铋纳米颗粒(bi2se3)

1.1)精密称取182mg的bi(no3)3·5h2o溶于5ml1mol/l的nho3溶液并置于100ml小烧杯中，然后向混合液中加入80mg的naoh得到混合溶液。25ml乙二醇(eg)放在磁力搅拌器上以1500r/min功率边搅拌边加入聚乙烯吡咯烷酮(pvp)0.8g，然后将混合溶液超声5min。最后混合上述两种反应溶液移至高压反应釜内，130℃水热3h。将得到的反应液用去离子水洗3次，再次溶于5ml去离子水以备后续反应。

1.2)将5ml氧化铋溶液与35mg的na2seo3混合在一起并搅拌10min，然后过程中加入还原剂葡萄糖100mg，将反应液移至高压反应釜中130℃水热8h。将得到的反应液用去离子水和乙醇洗三次，冷冻干燥后得到硒化铋纳米颗粒。反应液中的硒化铋纳米颗粒浓度为4mg/ml。

将硒化铋纳米颗粒制成溶液滴加到硅片上，待自然晾干后，用透射电镜进行观察，同时进行元素扫描分析，证实了所合成的纳米颗粒包含硒元素和铋元素。

第二步，合成peg偶联的硒化铋纳米颗粒

2.1)将2mg硒化铋溶于1ml去离子水中，并与2ml乙醇混合均匀搅拌，并向混合液中依次加入0.2mlaptms和1ml氨水，避光搅拌24小时得到反应液，用去离子水清洗3次，得到氨基化的硒化铋纳米颗粒。

2.2)5mgpeg2000与0.72mgedc和0.43mgnhs溶于2ml去离子水中搅拌0.5h，活化peg2000的羧基。

2.3)将活化好的peg2000用去离子洗2次后溶于2ml去离子水中，与2.1)中制备的氨基化的硒化铋混合搅拌24h。得到的反应液用去离子水洗3次，得到peg-bi2se3溶液，所得到的溶液的peg浓度为3mg/ml。

第三步，合成抗体偶联的硒化铋纳米颗粒

3.1)将2.3)中制备好的peg-bi2se3溶液与0.43mgedc和0.26mgnhs混合搅拌2h，活化peg-bi2se3的羧基。

3.2)两个小时后将上诉溶液用pbs洗两次并最终溶于1mlpbs溶液，然后加入5μg抗cd47抗体在4℃下搅拌24h。最终用pbs洗三次，冷冻干燥得到ab-peg-bi2se3纳米颗粒，抗cd47抗体最终浓度达到4μg/ml。

实施例3

一种用于肿瘤光热治疗联合免疫治疗的抗体偶联硒化铋纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

第一步，合成硒化铋纳米颗粒(bi2se3)

1.1)精密称取728mg的bi(no3)3·5h2o溶于20ml1mol/l的nho3溶液并置于100ml小烧杯中，然后向混合液中加入320mg的naoh得到混合溶液。100ml乙二醇(eg)放在磁力搅拌器上以1500r/min功率边搅拌边加入聚乙烯吡咯烷酮(pvp)1.8g，然后将混合溶液超声5min。最后混合上述两种反应溶液移至高压反应釜内，180℃水热5h。将得到的反应液用去离子水洗3次，再次溶于20ml去离子水以备后续反应。

1.2)将20ml氧化铋溶液与300mg的na2seo3混合在一起并搅拌10min，然后过程中加入还原剂葡萄糖614mg，将反应液移至高压反应釜中150℃水热24h。将得到的反应液用去离子水和乙醇洗三次，冷冻干燥后得到硒化铋纳米颗粒。反应液中的硒化铋纳米颗粒浓度为9mg/ml。

将硒化铋纳米颗粒制成溶液滴加到硅片上，待自然晾干后，用透射电镜进行观察，同时进行元素扫描分析，证实了所合成的纳米颗粒包含硒元素和铋元素。

第二步，合成peg偶联的硒化铋纳米颗粒

2.1)将10mg硒化铋溶于4ml去离子水中，并与8ml乙醇混合均匀搅拌，并向混合液中依次加入1mlaptms和4ml氨水，避光搅拌24小时得到反应液，用去离子水清洗3次，得到氨基化的硒化铋纳米颗粒。

2.2)20mgpeg2000与7.0mgedc和4.6mgnhs溶于5ml去离子水中搅拌4h，活化peg2000的羧基。

2.3)将活化好的peg2000用去离子洗2次后溶于2ml去离子水中，与2.1)中制备的氨基化的硒化铋混合搅拌24h。得到的反应液用去离子水洗3次，得到peg-bi2se3溶液，所得到的溶液的peg浓度为13mg/ml。

第三步，合成抗体偶联的硒化铋纳米颗粒

3.1)将2.3)中制备好的peg-bi2se3溶液与2.5mgedc和1.5mgnhs混合搅拌4h，活化peg-bi2se3的羧基。

3.2)两个小时后将上诉溶液用pbs洗两次并最终溶于1mlpbs溶液，然后加入25μg抗cd47抗体在4℃下搅拌24h。最终用pbs洗三次，冷冻干燥得到ab-peg-bi2se3纳米颗粒，抗cd47抗体最终浓度达到21μg/ml。

以上所述实施例仅表达本发明的实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利的范围的限制，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。