利用干细胞重塑细胞外基质的祛皱方法及应用与流程

本发明涉及医美领域与干细胞应用，特别涉及一种利用干细胞重塑细胞外基质的祛皱方法及其在生发领域的应用。
背景技术：
：皱纹是皮肤真皮层组织结构损伤引起表皮塌陷而形成，尤其容易发生在真皮层比较薄的部位，如：眼角、唇角、眼睑、额头、颊、颈部等。皱纹出现的本质原因是皮肤由内向外的张力不足造成，生理原因是皮肤游离自由基不能及时清除的结果，自由基破坏正常细胞膜组织内的胶原蛋白、活性物质，氧化细胞而形成的小细纹、皱纹。皱纹形成的另外两个原因分别是皮肤内水分含量下降与机体内分泌激素的变化。皮肤内水分含量下降后，皮肤表皮内膨压不足，造成皮肤表面形成细小皱纹，这种皱纹可以通过及时补充水分即可解决，可以使用补水剂或补水面膜完成。失水造成的细小皱纹不及时补水会加重皱纹，长期失水对皮肤造成不可逆损伤，再补水也不能回复。内分沁变化造成的皮肤皱纹不能通简单的补水完成，必须进行系统的机体调理，解决造成内分沁变化的机体本质问题才能解决。皱纹形成的信号通路主要是ahr信号通路，ahr除了可以在芳烃受体核转运蛋白(arnt)的作用下进入细胞核与核内特定序列结合，转录出基因编码的外源代谢酶基因，如药物代谢i期酶细胞色素p4501al(cyp1a1)，影响细胞生长和自身稳定的酶基因谷胱甘肽转移酶(gst)等，进而起到损伤的作用；活化的ahr分子还可以进一步激活c-scr，活化了细胞膜上的表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，egfr)，进一步激活了mapk/erk1/2通路，继而引起了一系列的细胞核内的效应，包括基质金属蛋白酶mmp的表达，四氯二苯并-p-二恶英tcdd引起ahr受体的激活，可以增加mmp-1的表达；pm2.5包括重金属离子和多环芳烃化合物pahs、户外紫外线都可激活该信号，从而导致皮肤老化，形成皱纹等现象。基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase)是主要的基质降解酶，其活性表达与真皮中弹力纤维和胶原纤维的降解、再合成及重塑过程密切相关，因此是临床皮肤光老化现象的分子基础。mmps前体被激活后，其活性可被金属蛋白酶组织抑制因子(tissueinhibitorofmetalloproteinases，timps)所抑制，在基质重塑的过程中，真皮胶原的合成或降解受到细胞中mmps与timps的动态平衡的调节。当前祛除皱纹的主要方法是手术法、物理填充法、药物调理法三大类。手术法通过切除部分皮肤，使松弛的皮肤和松驰的肌肉分别拉紧，去除皮肤表面皱纹，手术方法也在不断革新，技术不断进步。物理填充法主要是在皮肤中注入胶原蛋白、透明质酸以及其他隋性物质，形成皮肤内膨压，阻止皱纹形成。药物调理法主要是去除自由基的保健品、各种美容偏方、保健理疗与按摩等。当前的祛皱方法都没有从皮肤真皮的组织结构入手解决皱纹问题，并没有遵循皮肤生长发育规律来解决皱纹问题。干细胞在生命的分子和细胞水平可以发挥调控总指挥的作用，有望从本质上改善皮肤。技术实现要素：本发明为解决现有技术不足，提供了一种利用干细胞重塑细胞外基质的祛皱方法，系统调整机体生理代谢，从重塑皮肤真皮组织结构的根本层面上解决皱纹难题。本发明的构思是：先对患者进行皮肤生理指标检测，确定皱纹形成的本质原因；通过对患者进行机体的生理调整，改善皮肤生理状态，在皮肤真皮中植入干细胞唤，重建皮肤真皮层细胞外基质，恢复皮肤生命活力从而祛除皱纹。为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种利用干细胞重塑细胞外基质的祛皱方法，按照先后顺序包括以下步骤：s1对患者进行检测，确定患者的皱纹的组织结构特点和身体系统状态，根据患者的皱纹的组织结构特点和身体系统状态形成系统的治疗方案；s2根据患者的肠道菌群、血液生化和基因表达信息形成的治疗方案，对患者进行系统调理，恢复健康生理状态；s3将间充质干细胞和辅助调控因子一起注射到皮肤下真皮层，利用间充质干细胞唤醒皮肤真皮层的沉睡干细胞，重新建立生命信息传递体系，重塑皮肤真皮层细胞外基质，恢复皮肤生命活力祛除皱纹。优选的是，步骤s1中，利用肠道菌群、血液生化和基因表达信息，并根据患者的生理状态与皱纹的具体特点通过个性化治疗与精准治疗，形成系统治疗方案。在上述任一方案中优选的是，步骤s2中，对患者进行系统调理并使患者恢复有利于保持皮肤健康的良好生理状态，所述系统调理包括内分泌调理、代谢调理、营养平衡、抗自由基功能调理、日常必要的紫外线防护。在上述任一方案中优选的是，步骤s3中，利用间充质干细胞唤醒皮肤真皮层的沉睡干细胞，重新建立生命信息传递体系，重塑皮肤真皮层细胞外基质，恢复皮肤生命活力祛除皱纹；步骤s1具体为：通过精神、激素、营养、睡眠等多方面调整，消除患者机体的激素紊乱与生理代谢异常，衰减造成皮肤组织结构操作的ahr信号通路，激活wnt/β-catenin信号通路与mapk信号通路，重塑皮肤真皮层的细胞外基质，通过对患者整体系统调理与皮肤真皮层细胞外基质重塑两方面配合达到祛皱目标，不是单纯通过填充方法改变皮肤由内向外的张力。在上述任一方案中优选的是，通过间充质干细胞与功能调控组分激活wnt/β-catenin信号通路与mapk信号通路，解除bmp/tgf-β超家族对患者皮肤干细胞的活性抑制，重新建立生命信息传递体系，基于自组织方式重塑真皮层细胞外基质。在上述任一方案中优选的是，使用的干细胞的来源不局限于间充质干细胞，还包括脂肪组织干细胞、脐带血干细胞或ips细胞。在上述任一方案中优选的是，通过对患者整体系统调理与皮肤真皮层细胞外基质重塑两方面配合达到祛皱目标，不是单纯通过填充方法改变皮肤由内向外的张力。在上述任一方案中优选的是，上述法适用于医美领域。本发明遵循皮肤生长发育规律依托间充质干细胞重建真皮层细胞外基质，使真皮间质细胞重新焕发生命活力，彻底解决祛皱难题。附图说明图1为细胞衰老信号通路图；图2为mmp信号通路图；图3为实施例中应用本发明的结果对比。具体实施方式为了更进一步了解本发明的
发明内容，下面将结合具体实施例详细阐述本发明。下面结合附图、通过具体实施例对本发明作进一步详述。以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。本发明所应用的化学试剂以及仪器如未经特别说明，均可从商业渠道购买。一种利用干细胞重塑细胞外基质的祛皱方法，在具体实施过程需要：首先确定患者的皱纹分布特点与形成皱纹的相关原因，然后从机体系统调理与局部恢复两方面着手解决皱纹问题。对患者肠道菌群与血液生化指标进行诊断与调理，其次对皮肤皱纹形成的分子机制进行基因诊断，基因诊断内容包括ahr信号通路，激活wnt/β-catenin信号通路，mapk信号通路，bmp/tgf-β超家族介导的信号通路等，确定适宜的皱纹处理方案，系统解决皱纹问题。祛皱者为男性，年龄57岁，体重62kg。采集新鲜大便样品收集5g，进行肠道菌群16srna高通量测序检测，肠道菌群检测方法参考(胡海兵等，2016)，同时采集患者外周血30ml，进行生化指标检测。检测后令其服用河北中佳本草生物技术有限公司昶佳胃肠道调节酵素一个周期共25天，同时每天服用阿尔法亚麻酸1500mg两个月，之后用二代测序方法对其肠道菌群16srna进行检测与生物信息学分析，其优势菌群种类与丰度结果如表1所示，生化指标调控前后结果如表2所示。表1：服用胃肠道调节酵素及亚麻酸前后肠道优势菌群变化注：表中↓表示下调，↑表示上调由表1可知，经过胃肠道调节酵素与亚麻酸的调理后，该患者的肠道优势菌群发生了明显变化，其中拟杆菌属呈明显下降，有益菌如双歧杆菌丰度增加。表2：生化指标对照表由表2可以看出该患者血清生化指标发生了明显变化，血脂和血糖都发生了下降，其中同型半胱氨酸属于能够破坏血管的因子，调控后同样发生了下降。选择tgf-β信号通路、wnt信号通路中部分基因表达值作为检查对象，详情见表4，在患者腹部部进行脂肪抽脂。用荧光定量pcr的方法对祛皱患者皱纹分布区皮肤组织与无皱纹区基因表达水平进行检测，采用目的基因与内参基因之间ct值之间的差异来确定目的基因的表达量，本发明中，以gapdh作为内参基因，每个rna样品的定量pcr进行三个重复以消除系统误差。具体操作如下：用highpurernaisolationkit提取总rna，采用taqmanreversetran-scriptionrengents试剂盒将总rna反转录为cdna(25μl体系)，取反转录产物cdna模板2.5μl，按照taqmangeneexpressionmastermix说明书进行定量pcr检测，引物信息如表1所示。扩增程序为：95℃10min，95℃30s，55℃30s，72℃延伸30s共40个循环，定量pcr仪为roche480ⅱ，引物信息如表1所示。表3：定量pcr检测相关基因引物序列表4：皱纹区与干细胞相关基因表达差异基因表达倍数变化p值ahr17.872.65×10-4mmp126.795.29×10-5bmp122.542.92×10-4timp10.126.23×10-4β-catenin0.031.65×10-5gapdh0.055.43×10-5由表4可知实验对象皮肤bmp信号活跃，mmp1，ahr基因表达水平显著高于干细胞，timp1基因表达水平显著低于干细胞，这些特征符合皱纹发生的分子机制。干细胞分离培养与移植：抽取脱发者臀部脂肪2ml，无菌条件下，将获得脂肪用0.1mol/l磷酸盐缓冲液反复冲洗后，去除麻醉药品及血细胞，获得纯度较高的脂肪颗粒。用0.3％ⅰ型胶原酶37℃恒温摇床震荡消化1h。过滤去除未消化组织，800r/min离心10min(离心半径15cm)，以8mlα-mem培养液(含10％fbs)悬浮细胞，接种于培养瓶中，5％co2、37℃标准环境下培养。3d后首次换液，除去未贴壁细胞，随后每2～3d换液1次，当细胞接近80％融合时，及时进行传代。将获得脂肪用0.1mol/l磷酸盐缓冲液反复冲洗后，去除麻醉药品及血细胞，获得纯度较高的脂肪颗粒。用0.3％ⅰ型胶原酶37℃恒温摇床震荡消化1h。过滤去除未消化组织，800r/min离心10min(离心半径15cm)，以8mlα-mem培养液(含10％fbs)悬浮细胞，接种于培养瓶中，5％co2、37℃标准环境下培养。3d后首次换液，除去未贴壁细胞，随后每2～3d换液1次，当细胞接近80％融合时，及时进行传代。干细胞移植将间充质干细胞和辅助调控因子一同注射到皮肤的相应部位，利用间充质干细胞唤醒皮肤中原有干细胞，调控基质细胞与间质细胞活性，分泌形成胶原、纤连蛋白、层黏连蛋白有效形成皮肤真皮网络骨架，形成更多的透明质酸、蛋白聚糖、氨基聚糖以自组织方法重塑皮肤真皮结构。移植前脂肪间充质干细胞悬液的制备：将干细胞经胰蛋白酶消化(0.25％胰蛋白酶/edta，paa)10min，并离心12min，1200rpm/min，沉淀的细胞加生理盐水5ml制成干细胞悬液，子代干细胞密度约6×103个/ml。用专用微针注射器，均匀的注射入被祛皱者面部皮肤，每周注射一次，4次为一个疗程。(3)通过患者机体系统功能的调整恢复，从皮肤皱纹部位的局部重塑和调整患者机体代谢两方面着手，遵循皮肤皱纹形成的本质规律，阻断皱纹形成信号通路，有效解决皮肤健康问题，彻底消除皮肤皱纹，治疗前后结果对比见图3。本领域技术人员不难理解，本发明的利用干细胞重塑细胞外基质的祛皱方法及应用包括上述本发明说明书的
发明内容和具体实施方式部分以及附图所示出的各部分的任意组合，限于篇幅并为使说明书简明而没有将这些组合构成的各方案一一描述。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12