一种脐带间充质干细胞在制备治疗急性肺损伤药物中的应用的制作方法

本发明涉及肺损伤疾病治疗领域，特别涉及脐带间充质干细胞在急性肺损伤治疗中的用途及其制备方法。

背景技术：

急性肺损伤(ali)可由胃酸吸入、感染、创伤、脂肪栓塞、吸入有毒气体等多种原因引起，炎症反应在其病理改变中起关键作用。ali治疗仍缺乏特别有效的手段。目前，ali的治疗上主要以支持治疗、药物治疗和辅助通气治疗为主，临床上仍然保持着很高的病死率(约在30％～40％)，因此开发有效的ali治疗药物和手段十分迫切。

近年来，干细胞研究的蓬勃发展为难治性疾病治疗带来了新思路和希望。研究表明间充质干细胞是来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增，在细胞替代治疗及组织工程方面有极大的应用价值。脐带间充质干细胞作为一种多潜能干细胞，具有来源丰富、免疫源性低、无伦理问题等诸多优势，已成为干细胞领域的研究热点。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种脐带间充质干细胞在制备治疗ali药物中的用途，即利用脐带间充质干细胞制成的细胞悬液制剂能够降低急性肺损伤程度、改善肺功能，为脐带间充质干细胞提供了一种新用途。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

本发明提供一种脐带间充质干细胞在制备治疗急性肺病理和功能损伤药物中的应用。

进一步，所述脐带间充质干细胞为贴壁生长的成纤维样细胞，表达cd73、cd90和cd105，不表达cd14、cd19、cd34、cd45和hla-dr。脐带间充质干细胞来源于新生儿脐带华氏胶部分，通过酶消化法结合贴壁培养分离，收集3-5代细胞备用。

进一步，所述脐带间充质干细胞以细胞悬液的形式作用，所述细胞悬液按如下方法制备：将脐带间充质干细胞用血清制剂于37℃，5％co2培养箱中培养24～48小时，0.25％胰蛋白酶-edta消化，生理盐水洗涤后，再用生理盐水悬浮，即为脐带间充质干细胞悬液；所述血清制剂是将急性肺损伤供试血液于37℃水浴保温30min后，3500rpm离心10min，取上清，再将上清以体积终浓度0.5-5％的量加入含体积浓度1％谷氨酰胺和体积浓度15％胎牛血清的dmem培养液中，即为血清制剂。

进一步，所述脐带间充质干细胞悬液中细胞浓度为0.5～5×10⁷个/ml。

进一步，所述药物用量以脐带间充质干细胞个数计为4～20×10⁷个/kg体重，静脉单次输注。

在本发明中，供试血液(即肺损伤动物或患者血清)来源于急性肺损伤动物模型或患者血液，经静置和离心后所得上清液。脐带间充质干细胞制备的治疗急性肺损伤药物的实际用法和用量如下：利用生理盐水悬浮脐带间充质干细胞，并调整浓度至(0.5～5)×10⁷个/毫升，然后按照(4～20)×10⁷个/kg体重进行静脉输注，单次输注。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明利用脂多糖lps诱导的急性肺损伤小鼠模型，首次证明通过静脉注射脐带间充质干细胞悬液制剂能够显著改善急性肺损伤中血氧饱和度和氧合指数以及炎症因子等肺功能损伤指标，尤其是用ali患者血清处理后的脐带间充质干细胞制剂效果更为显著。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1是各组肺功能指标检测结果图；其中ali、uc和serum-uc分别表示ali模型组、ali模型脐带间充质干细胞悬液注射组和ali模型血清处理的脐带间充质干细胞制剂注射组。*表示uc组和serum-uc组比较差异显著(p﹤0.05)，**表示ali组和serum-uc组比较差异极显著(p﹤0.01)。

图2是各组血清炎症因子指标检测结果图；其中ali、uc和serum-uc分别表示ali模型组、ali模型脐带间充质干细胞悬液注射组和ali模型血清处理的脐带间充质干细胞制剂注射组。*表示uc组和serum-uc组比较差异显著(p﹤0.05)，**表示ali组和serum-uc组比较差异极显著(p﹤0.01)，***表示ali组和serum-uc组比较差异极显著(p﹤0.001)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：急性肺损伤小鼠模型制备

小鼠注射250μl1％戊巴比妥钠(pbs配制)进行麻醉，沿颈部中间剪开皮肤和肌肉层，暴露气管，用1ml注射器在气管两环中间向心方向刺入，注射2.5mg/ml的lps(pbs配制)，剂量为10mg/kg体重，注射完成后即刻将小鼠竖立旋转，使得溶液均匀分布肺部两侧，缝合后，小鼠在无菌环境下正常饲喂。

实施例2：血清制剂的制备

血清制备：如实施例1所述的急性肺损伤模型小鼠眼眶取血法采集血液，或从急性肺损伤患者采集静脉血，37℃水浴保温30min后，3500rpm离心10min，取上清，-20℃冻存备用。

血清制剂制备：dmem培养液+体积浓度1％谷氨酰胺+体积浓度15％胎牛血清中添加体积终浓度为0.5～5％的上述血清，现用现配。

实施例3：脐带间充质干细胞制剂

(1)脐带间充质干细胞分离培养

脐带间充质干细胞分离培养：取新鲜健康脐带，用pbs冲洗干净后，用剪刀镊子剔去血管，剥出里面的华氏胶组织，将所得组织充分剪碎至1mm3大小；加入2倍体积的酶溶液(浓度300iu/ml的ⅰ型胶原酶+浓度40iu/ml的dna酶i，生理盐水配制)，于37℃下消化1小时；消化产物70μm滤网过滤去除其中的组织残渣，得到细胞悬液；将细胞悬液用1.077g/ml的ficoll进行密度梯度离心，分离单核细胞，用生理盐水将分离到的单个核细胞洗涤3次；用α-mem培养液(添加体积浓度均为1％的青霉素、链霉素、两性霉素b和谷氨酰胺，以及体积浓度为15％胎牛血清，α-mem培养液购自invitrogen公司)悬浮细胞，以1×10⁶/cm²密度接种至75cm²塑料细胞培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、含5％co2培养箱中培养，48h后倾倒除去未贴壁细胞，换新鲜培养液，而后每2～3天换液，待细胞长至90％汇合时，消化传代，p3～5代细胞收集备用。

(2)脐带间充质干细胞制剂的制备

取步骤(1)3～5代长至90％左右汇合的脐带间充质干细胞，用实施例2制备的血清制剂于37℃，5％co2培养箱中培养处理24～48小时，0.25％胰蛋白酶-edta消化，生理盐水洗涤2次后，用生理盐水悬浮并调整浓度至(0.5～5)×10⁷个/ml，即为脐带间充质干细胞制剂。

实施例4：脐带间充质干细胞制剂输注改善肺功能、降低炎症因子含量

(1)利用实施例1所述方法建立的小鼠急性肺损伤(ali)模型，实验为3组：组1为ali模型组(ali组)、组2为ali模型脐带间充质干细胞悬液注射组(uc组)、组3为ali模型血清处理的脐带间充质干细胞制剂注射组(serum-uc组)。2组、3组于建模后6h，按8×10⁷个/kg体重剂量通过尾静脉输注，分别注射实例3制备的脐带间充质干细胞悬液和脐带间充质干细胞制剂。注射后72h取样进行血气分析和炎症因子检测，分析脐带间充质干细胞对ali的作用效果。

(2)血气分析检测：小鼠经注射250μl1％戊巴比妥钠(pbs配制)麻醉后，用1ml注射器(1mg/ml肝素钠抗凝)从腹主动脉抽取500μl左右动脉血，通过血气分析仪进行检测，分析血氧饱和度和氧合指数。

(3)炎症因子检测：小鼠血样分离血清，用试剂盒检测各组小鼠血清中il-1β与tnfα两种炎症因子的含量。

血气分析检测结果表明，脐带间充质干细胞悬液和制剂注射均能改善血氧饱和度和氧合指数，而用血清处理的间充质干细胞制剂组(serum-uc组)改善效果更为显著(如图1所示)。

血清炎症因子检测结果表明，脐带间充质干细胞悬液和制剂注射均能降低血清中il-1β和tnfα两种炎症因子的含量，而用血清处理的间充质干细胞制剂(serum-uc组)改善效果更为显著(如图2所示)。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。