本发明涉及铁螯合剂deferasirox(dfx)或含有其的药物组合物在治疗宫颈癌中的应用，属于医药领域。
背景技术：
宫颈癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤之一，尽管国内预防宫颈癌的疫苗已经上市，但由于价格昂贵、周期较长、远期效果未知等原因，目前国内宫颈癌的发病率仍然呈上升趋势，居高不下，每年宫颈癌新发病例和死亡人数已超过全球的1/4，其发病率和死亡率位于中国妇科恶性肿瘤的第一位，且宫颈癌的发病年龄趋于年轻化。
目前宫颈癌患者的治疗仍以手术、放疗、新辅助化疗等综合治疗为主，但术后复发率高、肿瘤恶性程度增强，化疗副作用严重、效果不好，且易出现耐药性，严重影响患者的生存及生活质量，病人的5年生存率仅为66％。因此，寻找宫颈癌新的治疗靶点和途径，是患者和临床医护人员的迫切需求。
铁是人体必需的微量元素，广泛参与重要的生命代谢过程。肿瘤细胞具有分裂旺盛的特点，并表现出对铁需求的增加，铁过多促进肿瘤生长，铁剥夺则可抑制肿瘤细胞生长，甚至诱导肿瘤细胞凋亡。同时，铁可通过fenton反应促进细胞内氧化应激水平增加。研究表明，低剂量氧化应激可通过激活细胞增殖相关信号通路如erk,加快细胞增殖，肿瘤细胞较正常细胞的细胞内氧化应激水平高。已有报道，铁螯合剂dfo(deferoxamine)对宫颈癌细胞增殖具有一定抑制效果，但对体内肿瘤的抑制效果不明显，铁螯合剂dfx(deferasirox)是近些年被批准用于临床的可口服的铁螯合剂，临床上用于铁过载相关疾病的治疗，相比于dfo，dfx的半衰期更长，服用方式简单，药效较好，在临床研究中已被证明是安全和有效的，研究发现dfx对食道癌、肝癌、胃癌等细胞均具有增殖抑制作用，而对于宫颈癌细胞和肿瘤的作用未见报道。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明研究了dfx对人宫颈癌hela细胞增殖和侵袭能力的抑制作用，探索了dfx对生长相关信号激酶erk激活的影响，对肿瘤细胞侵袭和转移相关分子ndrg1和c-myc表达的影响。进一步研究了dfx对宫颈癌细胞裸鼠异种移植瘤的生长抑制作用，检测了荷瘤裸鼠铁代谢水平及对生存状态的影响,并观察了dfx的副反应，提供了铁螯合剂dfx在治疗宫颈癌的药物中的应用，为探索宫颈癌治疗新途径提供理论参考。
治疗宫颈癌的药物，其成分包括铁螯合剂dfx以及一种或多种药学上可接受的药物赋形剂，药物赋形剂为黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂和抗氧化剂中的一种或多种。
本发明治疗宫颈癌的药物中含有铁螯合剂dfx，利用铁螯合剂dfx抑制宫颈癌细胞内自由铁池(lip)和氧化应激(ros)的水平，显著降低肿瘤组织中的铁含量，并通过阻滞宫颈癌细胞的裂变周期，从而抑制宫颈癌细胞的增殖分裂，抑制肿瘤的生长。dfx还可显著上调具有抑制肿瘤细胞侵袭和转移作用的n-myc下游调节基因ndrg1的表达，并降低癌基因c-myc蛋白的表达，从而抑制宫颈癌细胞的侵袭，达到治疗宫颈癌的目的。
本发明具有以下优点：
(1)服用方式简单且药效较好，随着dfx作用时间的延长及浓度的增加，hela细胞的增殖抑制作用增强，即这种抑制作用呈时间-浓度依赖性；
(2)安全性高，副作用低，能够显著抑制宫颈癌细胞的增殖分裂和侵袭，抑制宫颈癌肿瘤的生长，且不会对机体的其它机能造成显著损害；
(3)成本低廉，适合大规模生产。
附图说明
图1为本发明实施例1中mtt法检测不同浓度的dfx和不同培养时间对人子宫颈癌hela细胞活力的影响图；
图2为本发明实施例2中长时间动态活细胞成像及功能分析系统检测不同浓度的dfx对人子宫颈癌hela细胞密度的影响图；
图3为本发明实施例3中流式细胞术检测50μm的dfx对人子宫颈癌hela细胞周期的影响图；
图4为本发明实施例4中westernblot检测不同浓度的dfx对人子宫颈癌hela细胞周期调控蛋白表达的影响图；
图5为本发明实施例5中transwell检测50μm的dfx对人子宫颈癌hela细胞侵袭能力的影响图；
图6为本发明实施例6中westernblot检测不同浓度的dfx对人子宫颈癌hela细胞肿瘤发生相关蛋白表达的影响图；
图7为本发明实施例7中流式细胞术检测不同浓度的dfx对宫颈癌细胞内自由铁池(lip)和氧化应激水平(ros)的影响图；
图8为本发明实施例8中westernblot检测不同浓度的dfx对人子宫颈癌hela细胞中erk磷酸化水平的影响图；
图9为本发明实施例9中dfx对宫颈癌异种移植瘤肿瘤体积的影响图；
图10为本发明实施例9中dfx对宫颈癌异种移植瘤肿瘤重量的影响图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
mtt法检测dfx对人子宫颈癌hela细胞活力的影响
实验原理
检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2h-四氮唑溴盐(mtt)还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(dmso)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(od值)，来判断活细胞数量，od值越大，细胞活性越强。mtt法是一种快速，简便的能够半自动化定量分析细胞增殖及药物细胞毒作用的方法。
实验仪器与材料
细胞培养箱(thermofisher)，elx-800酶标仪(bio-tec)，倒置显微镜(nikon)，胎牛血清(biologicalindustries)，dmem(高糖)培养基(gibco)，mtt(sigma)，dmso(amresco)，deferasirox(dfx)(大连美仑)，96孔细胞培养板(nest)，hela细胞系(中科院上海细胞所)。
实验步骤
将hela细胞以约10000个/孔的密度接种于96孔板，在37℃，5％co2，含10％胎牛血清的dmem高糖培养液中培养。当细胞密度达到70-80％时，加入梯度终浓度为5、10、20、50、100、200μm的dfx，以经dmso处理的细胞为阴性对照组，每种细胞设三个复孔。分别继续培养24、48和72小时后，倒置显微镜下观察其形态。每孔加入含终浓度5mg/mlmtt培养液100μl，继续培养4h后吸去培养液，每孔加入dmso溶液100μl，吸打溶解紫色结晶，置于振荡培养箱中震荡培养10分钟，到结晶紫充分溶解，酶标仪490nm处测定吸光度。结果如图1所示。
细胞存活率按下式计算：细胞存活率＝实验组od值/空白对照组od值×100％；
数据统计以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验。
由图1可知，随着dfx作用时间的延长及浓度的增加，hela细胞的增殖抑制作用增强。结果说明dfx可以抑制宫颈癌细胞的增殖，且这种抑制作用呈时间-浓度依赖性。
实施例2
长时间动态活细胞成像及功能分析系统检测dfx对人子宫颈癌hela细胞的影响
实验原理
将成像系统incucytes3放置于培养箱中，实时记录分析细胞生长变化，实现多组细胞数天或数十天细胞生长发育、运动、蛋白表达等指标的长期监测，扩充了记录和研究细胞生长、细胞行为和细胞形态的途径。
实验仪器与材料
细胞培养箱(thermofisher)，incucytes3(sartorius)，胎牛血清(biologicalindustries)，dmem(高糖)培养基(gibco)，dmso(amresco)，deferasirox(dfx)(大连美仑)，24孔细胞培养板(nest)，hela细胞系(中科院上海细胞所)。
实验步骤
将hela细胞以约1×106个/板的密度接种于24孔板，在37℃，5％co2，含10％胎牛血清的dmem高糖培养液中培养。当细胞密度达到70-80％时，加入梯度终浓度为5、10、20、50、100、200μm的dfx，以经dmso处理的细胞为阴性对照组。每孔细胞选取三个复点，分别继续培养24、48和72小时，通过长时间动态活细胞成像及功能分析系统拍摄的明场实时记录分析细胞生长变化，结果如图2。
由图2可知，细胞密度随着dfx的浓度增加逐渐降低，说明dfx可以有效抑制宫颈癌细胞的增殖，这与mtt结果一致。
实施例3
流式细胞术检测dfx对人子宫颈癌hela细胞周期的影响
实验原理
细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。细胞周期分为间期与分裂期两个阶段。间期又分为三期：即dna合成前期(g1期)、dna合成期(s期)与dna合成后期(g2期)。某些细胞在分裂结束后暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，执行一定生物学功能(g0期)。由于细胞周期各时相的dna含量不同，通常正常细胞的g1/g0期具有二倍体细胞的dna含量(2n)，而g2/m期具有四倍体细胞的dna含量(4n)，而s期的dna含量介于二倍体和四倍体之间。
pi，即碘化丙锭，通常情况下不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞)。但在70％的冷乙醇或其他破膜剂增强细胞膜通透性的条件下，可使pi进入细胞内与核酸结合。pi在一定波长光的激发下发出荧光，其荧光强度与dna含量成正比，直接反映了细胞内dna含量。通过流式细胞仪pi染色法对细胞内dna含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为g1/g0期，s期和g2/m期,获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过软件计算各时相的细胞百分率。
实验仪器与材料
细胞培养箱(thermofisher)，流式细胞仪facscalibur(bd)，碘化丙啶(pi)(bd)，rnasea(solarbio)，胎牛血清(biologicalindustries)，dmem(高糖)培养基(gibco)，dmso(amresco)，deferasirox(dfx)(大连美仑)，6孔细胞培养板(nest)，hela细胞系(中科院上海细胞所)。
实验步骤
将hela细胞以约3×106个/板的密度接种于6孔细胞培养板，在37℃，5％co2，含10％胎牛血清的dmem高糖培养液中培养。当细胞密度达到70-80％时，加入终浓度为50μm的dfx作用于hela细胞24h，以经dmso处理的细胞为阴性对照组。流式细胞仪检测细胞周期分布情况：收集培养皿中全部hela细胞，包括贴壁的活细胞及漂浮的死细胞，4℃条件下800rpm离心5min，再将hela细胞用pbs轻柔洗涤2-3次，4℃800rpm离心5min，弃上清液后加入-20℃预冷的70％冰乙醇轻柔摇晃混匀细胞，放置于4℃冰箱内固定6-24h；将冰乙醇固定好的细胞在4℃离心800rpm离心5min，弃去上清后用冷pbs轻柔洗涤2-3次，以800rpm离心5min，弃掉上清，用pbs重悬细胞并调整细胞浓度至1×106/ml，加入dna染色剂pi和rnasea至二者的终浓度分别为5μl/ml和100μg/ml，37℃避光孵育30min；染色后的细胞悬液用滤网过滤并收集至流式细胞仪检测管，启动流式细胞仪进行检测，每例标本至少要检测10,000个细胞，获得数据后由系统自带的cellquest软件并结合另一流式细胞仪分析软件flowjo计算分析细胞周期分布情况，并绘制细胞周期分布图，结果如图3所示。
由图3可知，dfx处理后，细胞周期被显著阻滞于g0/g1期。
实施例4
westernblot检测dfx对人子宫颈癌hela细胞周期调控蛋白表达的影响实验原理
westernblot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。sds-page可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体——例如聚偏二氟乙烯膜(pvdf)上。固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的pvdf膜就称为一个印迹(blot)，用蛋白溶液(如5％脱脂奶粉溶液)处理，封闭pvdf膜上的疏水结合位点。用目标蛋白的抗体(一抗)处理pvdf膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。用一抗处理过的pvdf膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠igg的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。
实验仪器与材料
细胞培养箱(thermofisher)，基础电泳仪电源(bio-rad)，电泳仪(六一)，转印槽(bio-rad)，胎牛血清(biologicalindustries)，dmem(高糖)培养基(gibco)，dmso(amresco)，deferasirox(dfx)(大连美仑)，6cm细胞培养皿(nest)，hela细胞系(中科院上海细胞所)，pvdf膜(rocheappliedscience)，cyclind1(dcs6)mousemab(cellsignalingtechnology)，cycline1(he12)mousemab(cellsignalingtechnology)，beta-actin(proteintech)，兔二抗gtanti-rb/hrp(kirkegard&perrylaboratories)，鼠二抗gtanti-ms/hrp(kirkegard&perrylaboratories)。
实验步骤
将hela细胞以约1.5×106个/皿的密度接种于6cm细胞培养皿，在37℃，5％co2，含10％胎牛血清的dmem高糖培养液中培养。当细胞密度达到70-80％时，加入梯度终浓度为50、100、200μm的dfx作用于hela细胞24h，以经dmso处理的细胞为阴性对照组，收集人子宫颈癌hela细胞后提取总蛋白，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺(sds-page)电泳分离，然后转印蛋白至聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上，5％脱脂奶粉封闭1h后，4℃孵育一抗过夜，检测细胞周期调控相关蛋白cyclind1、cycline的变化情况，采用β-actin作为内参，以tbst漂洗后加入二抗常温孵育1h后，再经tbst洗涤3次，最后使用化学发光剂ecl发光液显色，在化学发光成像系统中显影，结果如图4。
由图4可知，dfx可显著降低细胞周期蛋白cyclind1和cycline的表达。以上结果提示，铁螯合剂dfx能够通过影响细胞周期来抑制宫颈癌细胞的增殖。
实施例5
transwell细胞体外侵袭实验检测dfx对人子宫颈癌hela细胞侵袭能力的影响
实验原理
将transwell小室放入培养板中，小室内称为上室，培养板内成为下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多方面的研究。
实验仪器与材料
细胞培养箱(thermofisher)，正置荧光显微镜(zeiss)，胎牛血清(biologicalindustries)，dmem(高糖)培养基(gibco)，mtt(sigma)，dmso(amresco)，deferasirox(dfx)(大连美仑)，24孔细胞培养板(nest)，hela细胞系(中科院上海细胞所)，transwellcostar小室(corning)，matrigel(bd)。
实验步骤
将transwell小室先置于24孔板中，在冰上将稀释为1mg/ml的matrigel加入transwell小室中，200μl/well，4℃静置过夜。将matrigel弃去后用基本培养基清洗transwell小室一遍，将离心后的细胞用基本培养基洗一次，重悬于基本培养基并计数，之后稀释细胞至如下密度1×105个/孔，每孔接种200μl，向培养板实验孔的下室加入含5％胎牛血清的dmem培养液600μl；并向上室与下室均加入终浓度50μm的dfx。侵袭24h后将膜进行固定染色并观察拍照，结果如图5。
由图5可知，dfx能够显著抑制宫颈癌细胞的侵袭能力。
实施例6
westernblot检测dfx对人子宫颈癌hela细胞肿瘤发生相关蛋白表达的影响
实验原理同实施例4。
实验仪器与材料
细胞培养箱(thermofisher)，基础电泳仪电源(bio-rad)，电泳仪(六一)，转印槽(bio-rad)，胎牛血清(biologicalindustries)，dmem(高糖)培养基(gibco)，dmso(amresco)，deferasirox(dfx)(大连美仑)，6cm细胞培养皿(nest)，hela细胞系(中科院上海细胞所)，pvdf膜(rocheappliedscience)，ndrg1rabbitpolyclonalantibody(proteintech)，c-mycrabbitpolyclonalantibody(proteintech)，beta-actin(proteintech)，兔二抗gtanti-rb/hrp(kirkegard&perrylaboratories)，鼠二抗gtanti-ms/hrp(kirkegard&perrylaboratories)。
实验步骤
将hela细胞以约1.5×106个/皿的密度接种于6cm细胞培养皿，在37℃，5％co2，含10％胎牛血清的dmem高糖培养液中培养。当细胞密度达到70-80％时，加入梯度终浓度为50、100、200μm的dfx作用于hela细胞24h，以经dmso处理的细胞为对阴性照组，收集人子宫颈癌hela细胞后提取总蛋白，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺(sds-page)电泳分离，然后转印蛋白至聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上，5％脱脂奶粉封闭1h后，4℃孵育一抗过夜，检测细胞肿瘤发生相关蛋白ndrg1、c-myc的变化情况，采用β-actin作为内参，以tbst漂洗后加入二抗常温孵育1h后，再经tbst洗涤3次，最后使用化学发光剂ecl发光液显色，在化学发光成像系统中显影，结果如图6。
由图6可知，n-myc下游调节基因ndrg1具有抑制肿瘤细胞的侵袭和转移作用。westernblot研究结果表明，dfx可显著上调ndrg1的表达，并且降低了癌基因c-myc蛋白的表达，这与侵袭实验的结果一致。
实施例7
流式细胞术检测dfx对宫颈癌细胞内自由铁池(lip)和氧化应激水平(ros)的影响
实验原理
calcein-am是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，calcein-am由于在calcein(钙黄绿素)的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为calcein留在细胞内，发出强绿色荧光。而当细胞中自由铁池水平升高时，calcein与铁离子发生络合后，荧光淬灭。
dcfh-da本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成dcfh。而dcfh不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧ros可以氧化无荧光的dcfh生成有荧光的dcf。检测dcf的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
实验仪器与材料
细胞培养箱(thermofisher)，流式细胞仪facscalibur(bd)，calcein-am(sigma)，dcfh-da(sigma)，胎牛血清(biologicalindustries)，dmem(高糖)培养基(gibco)，dmso(amresco)，deferasirox(dfx)(大连美仑)，6孔细胞培养板(nest)，hela细胞系(中科院上海细胞所)。
实验步骤
将hela细胞按1×106/板接种至12孔细胞培养板中，在37℃，5％co2，含10％胎牛血清的dmem高糖培养液中培养。当细胞密度达到70-80％时，加入终浓度为50μm的dfx作用于hela细胞24h，以经dmso处理的细胞为阴性对照组。处理时间到后在4℃条件下800rpm离心5min，再将hela细胞用pbs轻柔洗涤2-3次，4℃800rpm离心5min，弃上清液后分别加入0.05μm的calcein-am工作液和5μm的dcfh-da工作液轻柔摇晃混匀细胞，37℃细胞培养箱避光孵育染色20min。染色后的细胞悬液用滤网过滤并收集至流式细胞仪检测管，启动流式细胞仪进行检测，每例标本至少要检测10,000个细胞，获得数据后分析由铁池(lip)和氧化应激水平(ros)变化情况，结果如图7。
由图7可知，dfx能显著抑制宫颈癌细胞中lip和ros的水平。
实施例8
westernblot检测dfx对人子宫颈癌hela细胞中erk磷酸化水平的影响
实验原理同实施例4。
实验仪器与材料
细胞培养箱(thermofisher)，基础电泳仪电源(bio-rad)，电泳仪(六一)，转印槽(bio-rad)，胎牛血清(biologicalindustries)，dmem(高糖)培养基(gibco)，dmso(amresco)，deferasirox(dfx)(大连美仑)，6cm细胞培养皿(nest)，hela细胞系(中科院上海细胞所)，pvdf膜(rocheappliedscience)，p-p44/42(p-erk)antibody(cellsignalingtechnology)，p44/42(erk)antibody(cellsignalingtechnology)，兔二抗gtanti-rb/hrp(kirkegard&perrylaboratories)。
实验步骤
将hela细胞以约1.5×106个/皿的密度接种于6cm细胞培养皿，在37℃，5％co2，含10％胎牛血清的dmem高糖培养液中培养。当细胞密度达到70-80％时，加入梯度终浓度为50、100、200μm的dfx作用于hela细胞24h，以经dmso处理的细胞为阴性对照组，收集人子宫颈癌hela细胞后提取总蛋白，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺(sds-page)电泳分离，然后转印蛋白至聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上，5％脱脂奶粉封闭1h后，4℃孵育一抗过夜，检测细胞p-erk、erk的变化情况，以tbst漂洗后加入二抗常温孵育1h后，再经tbst洗涤3次，最后使用化学发光剂ecl发光液显色，在化学发光成像系统中显影，结果如图8所示。
由图8可知，dfx可时间依赖性抑制erk的磷酸化激活。
实施例9
dfx对宫颈癌异种移植瘤的抑制作用及对小鼠生存状态的影响。
实验仪器与材料
药品：地拉罗司(dfx)，含量125mg/片，由瑞士诺华制药公司提供，批准文号：h20150208；动物：裸鼠(balb/cnude)，雌性，5-6周龄，体重18-19g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证编号：scxk:2014-0004。裸鼠均在spf级环境中应用无菌饲料及灭菌纯净水饲养，环境温度及湿度适宜。
实验步骤
1、建立人宫颈癌hela细胞裸鼠皮下移植瘤模型
将对数生长期的hela细胞制成单细胞悬液，将细胞1×107个，用0.5mlpbs重悬，接种于裸鼠右侧的大腿皮下，建立人宫颈癌裸鼠移植瘤模型。每周1次用游标卡尺测量移植瘤的长径及与其垂直的短径，计算移植瘤的体积。移植瘤体积v(mm3)＝1/2×长径×短径2。大约两周后，当移植瘤体积大于100mm3时视为造模成功。
2、裸鼠分组及给药处理
将24只造模成功的裸鼠随机分为3组，即对照组(n＝8)：灌胃等量灭菌生理盐水；dfx低剂量组(n＝8)：灌胃dfx100mg/kg隔日1次，连续3周；dfx高剂量组(n＝8)：灌胃dfx200mg/kg隔日1次，连续3周。每3天1次用游标卡尺测量移植瘤的体积。每日观察裸鼠精神、饮食、活动、皮肤颜色及排便等情况。连续给药3周，停药后观察肿瘤大小。当对照组移植瘤体积大于1500mm3或治疗结束后移植瘤体积维持在一定大小不再生长时实验终止。实验结束后，戊巴比妥麻醉后，处死所有裸鼠并取注射部位的肿瘤组织，一部分保存于4％多聚甲醛溶液中，一部分置于-80℃冰箱保存，以备后续实验。
3、观察指标
3.1肿瘤生长曲线
每3天1次用游标卡尺测量移植瘤的长径和短径，计算肿瘤体积，绘制生长曲线，结果如图9所示。
3.2肿瘤重量
当对照组移植瘤体积大于1500mm3或治疗结束后移植瘤体积维持在一定大小不再生长时，处死裸鼠，完全剥离皮下肿瘤，称重，结果如图10所示。
3.3普鲁士蓝染色检测肿瘤组织中铁的含量
将切片脱蜡至蒸馏水，用普鲁士蓝染液染色30min后，蒸馏水冲洗，用3％甲醇双氧水常温孵育30min，蒸馏水冲洗3min后，dab显色20min，自来水冲洗，苏木素复染，常规脱水透明，中性树胶封片，黄染部分为铁沉积，显微镜下观察黄染面积及程度并拍照。
3.4免疫组织化学法检测肿瘤组织中fth蛋白的表达
采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(sp)法。常规石蜡切片脱蜡水化，edta抗原热修复10min，3％h2o2封闭内源性过氧化物酶15min，正常山羊血清封闭30min，滴加一抗，4℃过夜，滴加二抗，在37℃烘箱培育30min，滴加辣根过氧化酶标记的链霉素卵白素，二氨基联苯胺(dab)显色，以pbs作为阴性对照。于400倍显微镜下随机选取5个视野，对fth蛋白进行染色评分。标准为染色强度“-”着色同空白对照，“+”为浅染黄色，“++”为棕黄色，“+++”为黄褐色，依次记为0、1、2、3分；阳性细胞比率为阴性、1％-25％、26％-50％、51％-75％、76％-100％、依次记为0、1、2、3、4分；积分为二者之积。
3.5血液指标测定
裸鼠处死前12h开始禁食，摘眼球采血，采取2管血样。1号管血样应用全自动血细胞分析仪检测血常规；2号管血样于4℃离心机3000r/min离心15min，分离血清，采用全自动化学发光仪检测血清铁(si)、血清铁蛋白(sf)，采用全自动生化分析仪检测以下指标：总蛋白(tp)、白蛋白(alb)、谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)、碱性磷酸酶(alp)、尿素氮(bun)。
3.6dfx对机体其他器官的毒性检测
采用he染色法观察dfx对裸鼠腹腔脏器的毒副作用，将4％多聚甲醛固定6小时后的标本转移至0.01mpbs缓冲液中12小时，中间更换一次液体，再分别放入梯度酒精中脱水，二甲苯中透明后常规石蜡包埋，组织切片机连续切片。二甲苯ⅰ、二甲苯ⅱ、100％酒精ⅰ、100％酒精ⅱ各10min；放入梯度酒精中各5min；蒸馏水冲洗5min。苏木精染色3min，用自来水冲洗染液。1％盐酸酒精分化数秒，自来水下进行冲洗。伊红染色2分钟后，进行常规的梯度酒精脱水。二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察并拍照。
结果显示，dfx高剂量组能够显著抑制移植瘤的生长(图9，图10)，而对小鼠的整体体重无显著影响；对剥除的肿瘤组织进行普鲁士蓝染色检测肿瘤组织的铁含量，结果显示，dfx可以显著降低肿瘤组织中的铁含量；利用免疫组化法检测肿瘤组织中铁蛋白的表达，结果显示，铁蛋白重链的表达呈剂量依赖性降低；小鼠的血液生化指标检测，结果显示，与对照组相比，dfx高剂量治疗组裸鼠的血清铁蛋白(sf)含量显著降低，其他血液各项生化指标未出现明显异常；治疗组小鼠的心、肝、肺和肠的he染色未见异常。