积雪草苷在促进缺血超长随意皮瓣存活的作用的制作方法

本发明涉及积雪草苷的新用途，具体是积雪草苷在促进缺血超长随意皮瓣存活的作用。

背景技术：

整形外科一直在“美”跟“血供”之间进行较量，在这持久的战役中，整形外科医生的使命就是避免皮瓣“部分”或者“完全”坏死。虽然皮瓣外科技术有了很大的进展，但在临床应用中，皮瓣坏死是整形外科中常见并发症。临床上，随意皮瓣作为创面修复最基本且最常用的手术方法因其“灵活性”、“随意性”，被临床上广泛应用于修复组织缺损。然而随意皮瓣的血液灌注有限，往往出现皮瓣远端的缺血坏死。如何能改善随意皮瓣远端的血供状况以及组织对缺血的耐受能力，有效减少可能发生的缺血坏死，成为创面治疗修复中核心问题之一，具有较强的社会价值、经济价值和理论、实践研究价值。

积雪草苷，是从伞形科植物积雪草centellaasiatica(l.)urban的全草的提取物，淡黄色至淡棕黄色的粉末，它的分子式为c48h78o16，分子量为959.12g/mol,积雪草苷分子结构式如下：

积雪草苷具有无臭，味苦，稍具有引湿性,有促进创伤愈合作用,用于治疗外伤，手术创伤，烧伤，疤痕疙瘩及硬皮病，但是对皮瓣存活的影响未见报道。

技术实现要素：

本发明目的在于开发积雪草苷的新用途，具体为积雪草苷在促进缺血超长随意皮瓣存活的作用。

积雪草苷在促进缺血超长随意皮瓣存活的过程中采用口腔灌胃的方式，按每1毫克积雪草苷粉末溶于1毫升的生理盐水，配成1mg/ml溶液，使用方法为每千克体重大鼠每日通过口腔灌胃40mg积雪草苷，7天为一疗程。

通过大量的动物实验得出结论，使用积雪草苷可以使得皮瓣的成活面积比明显提高，能很好地促进缺血超长随意皮瓣存活。下面将结合具体实施例及附图对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1积雪草苷实验组与生理盐水对照组术后7天大鼠背部皮瓣存活情况的对比图；

图2积雪草苷实验组与生理盐水对照组术后七天两组皮瓣血流灌注量对比观察；

图3积雪草苷实验组与生理盐水对照组皮瓣氧化铅造影对比观察；

图4显微镜下（100倍和200倍）积雪草苷组与生理盐水组中间区域皮瓣he染色观察情况；

图5积雪草苷实验组与生理盐水组皮瓣血管内皮生长因子（vegf）、白细胞介素-1β(il-1β)、白细胞介素-6（il-6）和逆转肿瘤坏死因子-α（tnf-α）等蛋白表达（免疫组化×400）。

具体实施方式

积雪草苷可以促进缺血超长随意皮瓣存活性明显提高。在促进缺血超长随意皮瓣存活的过程中采用口腔灌胃的方式。按每1毫克积雪草苷粉末溶于1毫升的生理盐水，配成1mg/ml溶液，使用方法为每千克体重大鼠每日通过口腔灌胃40mg积雪草苷，7天为一疗程。

以下为积雪草苷在促进缺血随意皮瓣存活的作用评价：

1、缺血随意皮瓣模型建立

选用健康的雄性sd大鼠36只，由温州医科大学实验动物中心提供，清洁级，scxk（浙）2015-0019，体重200-250g，2—3个月龄。将大鼠按照随机数字表法分为积雪草苷实验组和生理盐水对照组，每组18只。采用改良的mcfarlane皮瓣制作方法，1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，将动物俯卧位固定，脱毛，碘伏消毒，铺巾，以大鼠尾部两髂嵴连线为蒂，在背部正中设计一宽3cm、长9cm矩形随意型皮瓣，设计线切开皮肤，皮下组织，达深筋膜浅层，保留真皮下毛细血管网，于深筋膜浅层表面分离皮下组织，遇到知名血管即以4-0号丝线结扎。皮瓣完全掀起后，彻底止血，立即用4-0医用慕丝缝线间断缝合。切口周围碘伏消毒后涂抹金霉素软膏，腹腔注射生理盐水(50ml／kg)抗休克。

积雪草苷实验组：40mg/kg积雪草苷灌胃；生理盐水对照组：相同剂量灌胃，均每日1次，连续注射7天，并独笼喂养。为减少手术操作带来的误差，所有手术由1人完成。

2、观察指标：

2.1皮瓣存活面积比的检测

皮瓣存活面积比的检测：术后第7天，各组大鼠在麻醉状态下用透明纸准确测量皮瓣成活及坏死面积，并剪成成活或死亡两部分，分别以电子秤称重。按以下公式计算皮瓣存活面积比：皮瓣存活面积比=皮瓣存活面积玻璃纸重量/皮瓣总表面积玻璃纸重量×100%。皮瓣坏死标准：皮瓣颜色发黑，组织回缩、弹性差，质地坚硬，切割组织不出血。病理表现为组织崩解、细胞核消失、炎症细胞广泛浸润、有局灶出血。

术后7天，积雪草苷组中间区域皮瓣颜色淡红，表面无痂壳形成，弹性较好，远端区域颜色发黑，表明有痂壳，弹性差，原位掀起皮瓣时见皮瓣出血活跃，出血量多，肉膜下无积血，积液，血管丰富。生理盐水组皮瓣中间区域及远端区域颜色均发黑，表面有痂壳形成，弹性极差，原位掀起皮瓣见皮瓣出血较少，肉膜下炎性分泌物较多，血管相对较疏（参见图1）。

7天后实验组皮瓣的成活面积比为(76.60±3.48%)，对照组皮瓣成活面积比为(49.54±2.67%),比较两组皮瓣的成活面积比，差异有统计学意义（p<0.01）。

2.2激光多普勒血流仪测定新生血管

在术后第7天，将两组共12只sd大鼠麻醉备用。大鼠取俯卧，头部及四肢用尼龙线捆绑固定于操作台上，用激光多普勒血流仪测量大鼠皮瓣各区域（皮瓣近端（ⅰ区）、中端（ⅱ区）、远端（ⅲ区））血流灌注的血流量。灌注量（pu）表示测量局部组织深度内的微循环血流量大小的相对单位，即在多普勒下红细胞的流动产生的位移值，pu值的变化直接反应了组织微循环血流量的改变，间接反映皮瓣新生血管形成。数据予专用软件moorldireviewv6.1进行分析、统计。

7天后激光多普勒血流仪显示积雪草苷组皮瓣的中间端血流量明显多于对照组，积雪草苷组皮瓣的血流灌注量为(236.24±42.00)，对照组皮瓣血流灌注量为(48.45±14.90),比较两组皮瓣的血流灌注量，差异有统计学意义（p<0.01）（参见图2）。

2.3明胶-氧化铅血管造影

术后第7天，麻醉后先通过向大鼠一侧颈动脉注入0.9%生理盐水，同侧颈静脉放血排净大鼠体内血液，然后将预置的明胶+氧化铅灌注液（100ml/kg）缓慢注射入颈动脉，当观察到大鼠巩膜及四肢末端色泽变成造影剂颜色后停止注射。灌注成功后将大鼠冷藏12-24小时，使明胶凝集，最后将大鼠背部皮瓣及周围皮肤解剖，平铺行x线摄影。

积雪草苷组皮瓣远端造影剂充盈，而对照组的造影剂局限在皮瓣近端和中间区域（参见图3）。

2.4组织学检测

术后7天，在皮瓣中点处取样。样本经10％甲醛固定，石蜡包埋，he染色，术后7d光镜下(×100和×200)观察肉芽组织层厚度、毛细血管的结构变化、组织水肿、坏死、炎性细胞浸润等情况。

积雪草苷组见成纤维细胞增生，肉芽组织较薄，组织水肿较少，炎症细胞浸润少。生理盐水组成纤维细胞增生较少，组织水肿明显，炎症细胞浸润严重（参见图4）。

积雪草苷组在皮瓣中区微血管密度为(34.16±2.77)，对照组在皮瓣中区微血管密度为(14.72±2.14)，两组皮瓣中区微血管密度比较，差异有统计学意义（p＜0.01)。

积雪草苷组在皮瓣中区中性粒细胞密度为（23.97±6.24）个/mm²比生理盐水对照组中性粒细胞密度（37.45±3.39）个/mm²明显降低，两组比较差异有统计学意义（p<0.01）。

2.5免疫组化观察

使用基于链霉亲和素/过氧化物酶的实验原理对血管内皮生长因子（vegf）、白细胞介素-1β(il-1β)、白细胞介素-6（il-6）和逆转肿瘤坏死因子-α（tnf-α）等蛋白表达水平进行免疫组织化学评估。采用image-proplus6.0彩色图像分析系统分析各组切片免疫组织化学染色结果（参见图5）。

免疫组化染色发现积雪草苷组大鼠皮瓣vegf表达明显高于对照组。积雪草苷组的vegf表达为(4245.83±182.64)ia，对照组的vegf表达为(1941.00±173.52ia)，两组vegf表达比较，差异有统计学意义（p＜0.01)。积雪草苷组il-1β表达(1361.00±256.39）、il-6表达(2102.50±185.79)和tnf-α表达（1859.33±156.57）均明显低于生理盐水对照组il-1β表达(2467.33±342.43）、il-6表达(5637.83±267.56)和tnf-α表达（2951.67±254.84），两组表达比较，差异有统计学意义（p＜0.01)。

2.6超氧化物歧化酶（sod）、丙二醛（mda）表达的检测

术后7天，于皮瓣中区正中部位切取0.5cm×0.5cm全层组织，去除肉膜层，称质量，稀释，冰水匀浆液．按照sod、mda检测试剂盒说明书，检测二者含量。

积雪草苷实验组每毫克蛋白sod活性表达量（(58.57±2.23）u显著高于生理盐水对照组(23.89±2.51）u，积雪草苷实验组每毫克蛋白mda表达量（21.69±3.00)nmol显著低于生理盐水组（(56.74±1.67)nmol(p＜0.01)。两组sod值和mda含量比较，差异有统计学意义（p＜0.05)。

结论：积雪草苷可以促进大鼠缺血随意皮瓣的成活，其机制可能：

1、积雪草苷上调皮瓣血管内皮生长因子（vegf）的表达、刺激皮瓣远端血管新生，改善皮瓣血供，从而提高皮瓣的成活面积；

2、积雪草苷可以减轻组织炎症反应，降低炎症因子白细胞介素-1β(il-1β)、白细胞介素-6（il-6）和逆转肿瘤坏死因子-α（tnf-α）等蛋白表达，从而促进皮瓣存活；

3、积雪草苷可以拮抗组织脂质过氧化反应、抑制皮瓣缺血再灌注损伤，促进随意皮瓣存活。