本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种间充质干细胞人工胰岛的制备方法。
背景技术：
糖尿病(dm,diabetesmellitus)是胰岛素分泌相对或绝对不足或胰岛素受体缺陷而引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱性疾病。糖尿病是一种内分泌疾病，具有严重的并发症，极大程度地危害着人类健康。
i型糖尿病是指胰岛β细胞破坏导致胰岛素绝对缺乏。目前治疗i型糖尿病有胰岛素注射和胰岛移植两种方法，但都具有局限性。注射胰岛素，是减轻糖尿病症状最有效的手段。但病人在注射一段时间胰岛素后，会产生胰岛素抵抗。机体会产生胰岛素抗体，导致胰岛素的生物活性大大丧失。而对于病情较为严重的糖尿病患者和胰腺摘除的患者，胰岛移植是他们首选的治疗方式。但胰岛移植时所需胰岛数目过多，并且移植后免疫排斥反应较大，成为治疗i型糖尿病的困扰。为此，我们发明了一种间充质干细胞人工胰岛的制备方法，解决了胰岛素治疗过程中所出现的胰岛素抵抗、胰岛移植时所需胰岛数目较多和较强免疫排斥反应的问题，从而为治疗i型糖尿病进行胰岛移植提供了新的供体。
技术实现要素：
发明目的：本发明针对上述现有技术存在的问题做出改进，即本发明公开了一种间充质干细胞人工胰岛的制备方法。本发明使用复合有间充质干细胞诱导的胰岛样细胞和血管内皮细胞的壳聚糖水凝胶，制备成人工胰岛，为解决糖尿病治疗过程中所出现的胰岛素抵抗、胰岛移植时所需胰岛数目较多和较强免疫排斥反应的问题，并且加入血管内皮细胞可加快人工胰岛血管化，使胰岛样细胞更好地生存，有利于延长治疗时间。
技术方案：一种间充质干细胞人工胰岛的制备方法，包括以下步骤：
(1)间充质干细胞培养并诱导生成胰岛样细胞；
(2)血管内皮细胞的提取与培养；
(3)温敏性壳聚糖水凝胶的制备；
(4)制备复合型水凝胶；
(5)将步骤(4)得到的复合型水凝胶，进行局部移植后，在37℃体温环境下迅速发生凝集，形成人工胰岛。
进一步地，步骤(1)中的间充质干细胞为脐带间充质干细胞，其包括：
(11)脐带间充质干细胞的提取
(111)无菌条件下，取健康的脐带标本10～20cm，置于1％含双抗的pbs缓冲液中；
(112)在超净工作台中，反复用pbs冲洗脐带标本以去除残留血液；
(113)在培养皿中剥离脐带标本的外膜、脐静脉和脐动脉后，将剩余组织块剪碎至体积小于1mm3，然后放入含有dmem/f12完全培养基的细胞培养皿中，置37℃、5％v/v％co2、饱和湿度培养箱中培养，4d后进行半量换液，待发现有细胞爬出后，每3d进行换液一次，传至第3代，待第3代脐带间充质干细胞达到80％～90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打皿底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入dmem/f12完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代的脐带间充质干细胞悬液，其中：
dmem/f12完全培养基包括10v/v％fbs、1v/v％青链霉素，余量为dmem/f12；
脐带间充质干细胞传代方法为：待脐带间充质干细胞达到80％～90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打皿底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：2～3的比例传代；
(12)间充质干细胞诱导胰岛样细胞
(121)取步骤(113)得到的第3代的脐带间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×105个/ml，加入10v/v％fbs、1v/v％青链霉素的dmem/f12完全培养基进行培养，待脐带间充质干细胞融合至70％～80％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导10～14d，其中：
第一诱导培养基含有10～15v/v％fbs、50～150μg/lβ-神经生长因子、4～20mmol/l尼克酰胺和10～40μg/l表皮生长因子，余量为dmem/f12；
(122)将步骤(121)诱导的脐带间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养12～16d，形成胰岛样细胞团，其中：
第二诱导培养基含有5～20mmol/l尼克酰胺、5～15μg/l碱性成纤维细胞生长因子、2～8nmol/l活化素a和1.0～2.0v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为dmem/f12。
进一步地，步骤(1)中的间充质干细胞为外周血间充质干细胞，其包括：
s11外周血间充质干细胞的提取
s111抽取血液20～30ml，肝素抗凝，以等量稀释；
s112另取一离心管，管内注入1.073g/l的ficoll分离液，将步骤s111稀释好的血液缓慢沿管壁均匀滴加在ficoll分离液上，二者比例1：1，然后以2000rpm离心25min，收集中间白色云雾状的单个核细胞层；
s113向步骤s112得到的单个核细胞层中加入pbs缓冲液洗涤1次，采用红细胞裂解液裂解红细胞，pbs洗涤2次，弃上清液，然后用5mllg-dmem完全培养基重悬细胞，按5×105/cm2细胞密度接种于t25培养瓶中，置37℃、5v/v％co2、饱和湿度培养箱中培养，72h首次半量换液，而后每2～3d全量换液1次，传至第3代，待第3代外周血间充质干细胞达到80％～90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，lg-dmem完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入lg-dmem完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代外周血间充质干细胞悬液，其中：
lg-dmem完全培养基含有15v/v％fbs、1v/v％青链霉素，其余为lg-dmem；
外周血间充质干细胞传代方法为：待外周血间充质干细胞达到80％～90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，lg-dmem完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：2～3的比例传代；
s12间充质干细胞诱导胰岛样细胞
s121取步骤s113得到的第3代的外周血间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×105个/ml，加入10v/v％fbs、1v/v％青链霉素的dmem/f12完全培养基进行培养，待外周血间充质干细胞融合至70％～80％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导10～14d，其中：
第一诱导培养基含有10～15v/v％fbs、50～150μg/lβ-神经生长因子、4～20mmol/l尼克酰胺和10～40μg/l表皮生长因子，余量为dmem/f12；
s122将步骤s121诱导的外周血间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养12～16d，形成胰岛样细胞团，其中第二诱导培养基含有5～20mmol/l尼克酰胺、5～15μg/l碱性成纤维细胞生长因子、2～8nmol/l活化素a和1.0～2.0v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为dmem/f12。
进一步地，步骤(1)中的间充质干细胞为脂肪间充质干细胞，其包括：
a脂肪间充质干细胞的提取
a1无菌条件下取脂肪组织，剔除血管筋膜，pbs冲洗三次，去除红细胞，剪碎至体积小于lmm3，然后置入锥形瓶中，加入5～6倍体积的0.1wt％的i型胶原酶，37℃，水浴震荡消化50～70min；
a2向所述锥形瓶中加入等体积的hg-dmem完全培养基终止消化，1500rpm，4℃离心10min，倾去上层脂肪及上清，得到细胞沉淀，其中：
hg-dmem完全培养基包括15v/v％fbs和1v/v％青链霉素，余量为hg-dmem；
a3向所述锥形瓶中加入10～15mlhg-dmem完全培养基，悬浮沉淀，200目滤网过滤，将滤液1500rpm，4℃离心10min，去上清，得到细胞沉淀；
a4向所述锥形瓶中加入5mlhg-dmem完全培养基，悬浮细胞沉淀，接种于t25细胞培养瓶中，置入37℃、5％v/vc02、饱和湿度培养箱中培养，48～72h后首次换液，去除未贴壁细胞，然后每2～3d换液一次，传至第3代，待第3代脂肪间充质干细胞达到80％～90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，hg-dmem完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入hg-dmem完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代的脂肪间充质干细胞悬液，其中：
脂肪间充质干细胞传代方法为：待脂肪间充质干细胞达到80％～90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，hg-dmem完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：2～3的比例传代；
b间充质干细胞诱导胰岛样细胞
b1取步骤a4得到的第3代的脂肪间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×105个/ml，加入10v/v％fbs、1v/v％青链霉素的dmem/f12完全培养基进行培养，待脂肪间充质干细胞融合至70％～80％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导10～14d，其中：
第一诱导培养基含有10～15v/v％fbs、50～150μg/lβ-神经生长因子、4～20mmol/l尼克酰胺和10～40μg/l表皮生长因子，余量为dmem/f12；
b2将步骤b1诱导的脂肪间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养12～16d，形成胰岛样细胞团，其中：
第二诱导培养基含有5～20mmol/l尼克酰胺、5～15μg/l碱性成纤维细胞生长因子、2～8nmol/l活化素a和1.0～2.0v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为dmem/f12。
进一步地，步骤(1)中的间充质干细胞为子宫内膜间充质干细胞，其包括：
(ⅰ)子宫内膜间充质干细胞的提取
(ⅰ1)无菌条件下取子宫内膜组织，用无ca2+和mg2+的pbs缓冲液冲洗三次，然后转入无菌培养皿中，用无菌眼科剪剪至体积小于1mm3，
(ⅰ2)然后向无菌培养皿加入2倍体积的0.1wt％胶原酶，37℃，水浴震荡消化60min，收集消化液于离心管中，向离心管中加入dmem-f12完全培养基终止消化，然后以1000rpm离心10min，弃去上清液，保留细胞沉淀，其中：
dmem/f12完全培养基含10v/v％fbs和1v/v％青链霉素，余量为dmem/f12；
(ⅰ3)然后向离心管中加4倍体积的红细胞裂解液，持续震荡，当离心管内液体逐渐变为红色时，向离心管中添加10mlpbs缓冲液，再次1000rpm离心5min，弃上清，
(ⅰ4)然后向离心管中加入5mldmem/f12完全培养基悬浮细胞沉淀，接种于t25细胞培养瓶中，置入37℃、5v/v％c02、饱和湿度培养箱中培养，24～48h后首次换液，去除未贴壁细胞，然后每2～3d换液一次，传至第3代，待第3代子宫内膜间充质干细胞达到80％～90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入dmem/f12完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代的子宫内膜间充质干细胞悬液，其中：
子宫内膜间充质干细胞传代方法为：待子宫内膜间充质干细胞达到80％～90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：2～3的比例传代；
(ⅱ)间充质干细胞诱导胰岛样细胞
(ⅱ1)取步骤(ⅰ)得到的第3代的子宫内膜间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×105个/ml，加入10v/v％fbs、1v/v％青链霉素的dmem/f12完全培养基进行培养，待脂肪间充质干细胞融合至70％～80％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导10～14d，其中：
第一诱导培养基含有10～15v/v％fbs、50～150μg/lβ-神经生长因子、4～20mmol/l尼克酰胺和10～40μg/l表皮生长因子，余量为dmem/f12；
(ⅱ2)将步骤(ⅱ1)诱导的子宫内膜间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养12～16d，形成胰岛样细胞团，其中：
第二诱导培养基含有5～20mmol/l尼克酰胺、5～15μg/l碱性成纤维细胞生长因子、2～8nmol/l活化素a和1.0～2.0v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为dmem/f12。
进一步地，步骤(1)中的间充质干细胞为骨髓间充质干细胞，包括：
sⅰ骨髓间充质干细胞的提取
sⅰ1无菌条件取出股骨和胫骨，从股骨干和胫骨干中间剪断，用dmem/f12完全培养基反复冲洗骨髓腔得到冲洗液，其中：
dmem/f12完全培养基包括10v/v％fbs和1v/v％青链霉素，余量为dmem/f12；
sⅰ2将冲洗液用200目滤网过滤，取滤液，然后将滤液置于离心管中，1000rpm，离心5min，去上清，得到细胞沉淀；
sⅰ3向离心管中加入5mldmem/f12完全培养基悬浮细胞沉淀，接种于t25细胞培养瓶中，置入37℃、5v/v％c02、饱和湿度培养箱中培养，24～48h后首次换液，去除未贴壁细胞，然后每2～3d换液一次，传至第3代，待第3代骨髓间充质干细胞达到80％～90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入dmem/f12完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代的骨髓间充质干细胞悬液，其中：
骨髓间充质干细胞传代方法为：待骨髓间充质干细胞达到80％～90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：2～3的比例传代；
sⅱ间充质干细胞诱导胰岛样细胞
sⅱ1取步骤sⅰ得到的第3代的骨髓间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×105个/ml，加入10v/v％fbs、1v/v％青链霉素的dmem/f12完全培养基进行培养，待脂肪间充质干细胞融合至70％～80％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导10～14d，其中：
第一诱导培养基含有10～15v/v％fbs、50～150μg/lβ-神经生长因子、4～20mmol/l尼克酰胺和10～40μg/l表皮生长因子，余量为dmem/f12；
sⅱ2将步骤sⅱ1诱导的骨髓间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养12～16d，形成胰岛样细胞团，其中：
第二诱导培养基含有5～20mmol/l尼克酰胺、5～15μg/l碱性成纤维细胞生长因子、2～8nmol/l活化素a和1.0～2.0v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为dmem/f12。
进一步地，步骤(1)中的间充质干细胞为胎盘间充质干细胞，其包括：
(ⅰ)胎盘间充质干细胞的提取
(ⅰ1)无菌条件下取胎盘靠近脐带部位胎盘小叶，剥除羊膜和底蜕膜部分，取胎盘胎儿面组织，然后用pbs反复冲洗至液体较清亮，用眼科剪剪碎至体积小于1mm3，然后置于无菌培养皿中；
(ⅰ2)向无菌培养皿中加入2倍体积的0.1wt％胶原酶，37℃消化30min，然后用200目滤网过滤，取滤液，置于离心管中，然后滤液1000rpm，离心5min，去上清，得到细胞沉淀；
(ⅰ3)向离心管中加入5mldmem/f12完全培养基悬浮细胞沉淀，接种于t25细胞培养瓶中，置入37℃、5v/v％c02、饱和湿度培养箱中培养，24～48h后首次换液，去除未贴壁细胞，然后每2～3d换液一次，传至第3代，待第3代胎盘间充质干细胞达到80％～90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打皿底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入dmem/f12完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代的胎盘间充质干细胞悬液，其中：
dmem/f12完全培养基包括10v/v％fbs和1v/v％青链霉素，余量为dmem/f12；
胎盘间充质干细胞传代方法为：待胎盘间充质干细胞达到80％～90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打皿底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：2～3的比例传代；
(ⅱ)间充质干细胞诱导胰岛样细胞
(ⅱ1)取步骤(ⅰ)得到的第3代的胎盘间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×105个/ml，加入10v/v％fbs、1v/v％青链霉素的dmem/f12完全培养基进行培养，待脂肪间充质干细胞融合至70％～80％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导10～14d，其中：
第一诱导培养基含有10～15v/v％fbs、50～150μg/lβ-神经生长因子、4～20mmol/l尼克酰胺和10～40μg/l表皮生长因子，余量为dmem/f12；
(ⅱ2)将步骤(ⅱ1)诱导的胎盘间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养12～16d，形成胰岛样细胞团，其中：
第二诱导培养基含有5～20mmol/l尼克酰胺、5～15μg/l碱性成纤维细胞生长因子、2～8nmol/l活化素a和1.0～2.0v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为dmem/f12。
进一步地，步骤(2)包括以下步骤：
(21)无菌条件下，取血管标本15～20cm，置于1％含双抗的pbs缓冲液中，然后进入步骤(22)；
(22)在超净工作台中，反复用pbs缓冲液冲洗血管标本的内腔，去除其内的残留血液，然后进入步骤(23)；
(23)将钝型针插入血管标本中,并用止血钳使钝型针牢牢固定在血管标本内，然后进入步骤(24)；
(24)用注射器抽pbs缓冲液注入血管标本中，冲洗残留红细胞,直至洗出液清亮为止，然后进入步骤(25)；
(25)用另一只止血钳夹闭血管标本的另一端，然后抽取0.15wt％～0.25wt％胰酶10～15ml注入血管标本,移入培养箱37℃孵育8～10min，然后进入步骤(26)；
(26)用注射器抽出血管内的胰酶及消化下来的细胞,并注入事先装有rpmi1640完全培养基的离心管中,再将10～15ml该完全培养基注入该血管标本，然后抽出至上述离心管中，然后进入步骤(27)，其中：
rpmi1640完全培养基包括10v/v％fbs和1v/v％青链霉素，余量为rpmi1640；
(27)将离心管以1000rpm的速度离心5分钟，弃上清液,收集内皮细胞,用吸管将其内皮细胞加入装有rpmi1640完全培养基的培养瓶中培养，每3d进行换液，传至3～4代结束培养，其中：
内皮细胞传代方法为：待内皮细胞达到80％～90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，rpmi1640完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：2～3的比例传代。
进一步地，步骤(3)包括以下步骤：
(31)壳聚糖溶液的制备
称取0.2～0.3g脱乙酰度大于90％的壳聚糖粉末于盛有10ml浓度为o.1m稀醋酸水溶液的无菌烧杯中，在搅拌机的搅拌下，使得壳聚糖溶液变得清澈透亮，留取备用；
(32)i型胶原溶液的制备
称取25～50mgi型胶原粉末于盛有10ml浓度为o.02m的稀醋酸水溶液的无菌烧杯中，并用洁净的玻璃棒搅拌至完全溶解；
(33)β-甘油磷酸钠溶液的制备
称取0.4～0.6gβ-甘油磷酸钠粉末于盛有1ml蒸馏水的无菌烧杯中，并用洁净的玻璃棒搅拌至完全溶解；
(34)海藻酸钠溶液的制备
称取0.15～0.25g海藻酸钠粉末于盛有10ml蒸馏水的无菌烧杯中，在搅拌机的搅拌下，使得海藻酸钠溶液变得清澈透亮，留取备用；
(35)壳聚糖/胶原/β-甘油磷酸钠/海藻酸钠溶液的制备
(351)分别取4ml步骤(31)得到的壳聚糖溶液、2ml步骤(32)得到的i型胶原溶液加入到无菌烧杯中，于冰上搅拌均匀，得到混合液，然后进入步骤(352)；
(352)在冰上，缓慢向步骤(351)得到混合液加入事先配好的1ml步骤(32)得到的β-甘油磷酸钠溶溶液形成混合液，然后进入步骤(353)；
(353)向步骤(352)得到的混合液中加入3ml步骤(34)得到的海藻酸钠溶，搅拌均匀后形成混合液，然后进入步骤(354)；
(354)将步骤(353)得到的混合液加入ep管中，并立即放入37℃恒温培养箱中培养8～10分钟，即可得到温敏性壳聚糖水凝胶。
进一步地，步骤(4)包括以下步骤：
(41)将步骤(1)诱导生成的胰岛样细胞稀释成细胞悬液，其细胞浓度为2×104～2×106个/ml；
(42)将步骤(2)制备的血管内皮细胞稀释成细胞悬液，其细胞浓度为1×105～1×107个/ml；
(43)将步骤(41)得到的细胞悬液与步骤(42)得到的细胞悬液按照体积比1：5的比例混合后形成胰岛样细胞与血管内皮细胞混悬液降温至18℃～20℃，在冰浴容器中，将胰岛样细胞与血管内皮细胞混悬液与步骤(3)制备的温敏性壳聚糖水凝胶充分混匀后即得到复合型水凝胶。
壳聚糖是一种具有良好生物相容性的天然阳离子多糖，是用途非常广的生物材料。壳聚糖溶液在室温下呈液态，可以包裹活性细胞和蛋白质，与β-甘油磷酸钠混合后，注射入体内后，可在体温条件下于注射处原位形成生物可降解凝胶。i型胶原是细胞外基质成分，可以使细胞更好地生存。海藻酸钠的加入，为整个水凝胶体系提高了强度。该体系作为包裹活性细胞的载体，被成功地应用于生命体内传递生物活性生长因子及组织工程。因此，本发明利用间充质干细胞诱导的胰岛样细胞作为胰岛细胞供体源，利用血管内皮细胞促成局部微循环建立，利用壳聚糖水凝胶作为细胞包裹材料和3d支架，经人工复合和温敏凝胶聚合构建胰岛等同物。
间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，可诱导分化成成脂细胞、成骨细胞、心肌细胞和胰岛样细胞等。间充质干细胞因其来源广泛、易于获取、增殖能力强、不涉及伦理等优点，可作为新型的种子细胞。研究证实,间充质干细胞及其诱导后的胰岛样细胞均不表达移植排斥相关的细胞表面标记cd80、cd86、cd40、cd40l,表明间充质干细胞诱导前后均为低免疫原性,细胞移植后不会产生免疫排斥反应,这为间充质干细胞诱导前后的移植治疗提供理论基础,从而可以作为移植治疗糖尿病的细胞来源。因此，本发明也采用间充质干细胞诱导的胰岛样细胞作为构建胰岛的细胞。
血管内皮细胞有促进血管化的作用，将血管内皮细胞加入到复合有间充质干细胞诱导的胰岛样细胞的壳聚糖凝胶中，有促成局部微循环建立，有促进人工胰岛血管化的作用，为人工胰岛提供血供。
综合以上因素，为解决胰岛素治疗过程中所出现的胰岛素抵抗、胰岛移植时所需胰岛数目较多和较强免疫排斥反应的问题，我们选用复合有间充质干细胞诱导的胰岛样细胞和血管内皮细胞的壳聚糖温敏水凝胶，在体温环境下细胞复合型水凝胶发生凝集，构建成人工胰岛，用于糖尿病治疗。
有益效果：本发明公开的一种间充质干细胞人工胰岛的制备方法解决了胰岛素治疗过程中所出现的胰岛素抵抗、胰岛移植时所需胰岛数目较多和较强免疫排斥反应的问题，从而为治疗i型糖尿病进行胰岛移植提供了新的供体。
附图说明
图1是本发明制备的一种间充质干细胞人工胰岛的sem图。
具体实施方式：
下面对本发明的具体实施方式详细说明。
实施例1
一种间充质干细胞人工胰岛的制备方法，包括以下步骤：
(1)间充质干细胞培养并诱导生成胰岛样细胞；
(2)血管内皮细胞的提取与培养；
(3)温敏性壳聚糖水凝胶的制备；
(4)制备复合型水凝胶；
(5)将步骤(4)得到的复合型水凝胶，进行局部移植后，在37℃体温环境下迅速发生凝集，形成人工胰岛。
进一步地，步骤(1)中的间充质干细胞为脐带间充质干细胞，其包括：
(11)脐带间充质干细胞的提取
(111)无菌条件下，取健康的脐带标本10cm，置于1％含双抗的pbs缓冲液中；
(112)在超净工作台中，反复用pbs冲洗脐带标本以去除残留血液；
(113)在培养皿中剥离脐带标本的外膜、脐静脉和脐动脉后，将剩余组织块剪碎至体积小于1mm3，然后放入含有dmem/f12完全培养基的细胞培养皿中，置37℃、5％v/v％co2、饱和湿度培养箱中培养，4d后进行半量换液，待发现有细胞爬出后，每3d进行换液一次，传至第3代，待第3代脐带间充质干细胞达到80％～90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打皿底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入dmem/f12完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代的脐带间充质干细胞悬液，其中：
dmem/f12完全培养基包括10v/v％fbs、1v/v％青链霉素，余量为dmem/f12；
脐带间充质干细胞传代方法为：待脐带间充质干细胞达到80％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打皿底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：2的比例传代；
(12)间充质干细胞诱导胰岛样细胞
(121)取步骤(113)得到的第3代的脐带间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×105个/ml，加入10v/v％fbs、1v/v％青链霉素的dmem/f12完全培养基进行培养，待脐带间充质干细胞融合至70％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导10d，其中：
第一诱导培养基含有10v/v％fbs、50μg/lβ-神经生长因子、4mmol/l尼克酰胺和10μg/l表皮生长因子，余量为dmem/f12；
(122)将步骤(121)诱导的脐带间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养12d，形成胰岛样细胞团，其中：
第二诱导培养基含有5mmol/l尼克酰胺、5μg/l碱性成纤维细胞生长因子、2nmol/l活化素a和1.0v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为dmem/f12。
进一步地，步骤(2)包括以下步骤：
(21)无菌条件下，取血管标本15cm，置于1％含双抗的pbs缓冲液中，然后进入步骤(22)；
(22)在超净工作台中，反复用pbs缓冲液冲洗血管标本的内腔，去除其内的残留血液，然后进入步骤(23)；
(23)将钝型针插入血管标本中,并用止血钳使钝型针牢牢固定在血管标本内，然后进入步骤(24)；
(24)用注射器抽pbs缓冲液注入血管标本中，冲洗残留红细胞,直至洗出液清亮为止，然后进入步骤(25)；
(25)用另一只止血钳夹闭血管标本的另一端，然后抽取0.15wt％胰酶10ml注入血管标本,移入培养箱37℃孵育8min，然后进入步骤(26)；
(26)用注射器抽出血管内的胰酶及消化下来的细胞,并注入事先装有rpmi1640完全培养基的离心管中,再将10ml该完全培养基注入该血管标本，然后抽出至上述离心管中，然后进入步骤(27)，其中：
rpmi1640完全培养基包括10v/v％fbs和1v/v％青链霉素，余量为rpmi1640；
(27)将离心管以1000rpm的速度离心5分钟，弃上清液,收集内皮细胞,用吸管将其内皮细胞加入装有rpmi1640完全培养基的培养瓶中培养，每3d进行换液，传至3代结束培养，其中：
内皮细胞传代方法为：待内皮细胞达到80％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，rpmi1640完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：2的比例传代。
进一步地，步骤(3)包括以下步骤：
(31)壳聚糖溶液的制备
称取0.2～0.3g脱乙酰度大于90％的壳聚糖粉末于盛有10ml浓度为o.1m稀醋酸水溶液的无菌烧杯中，在搅拌机的搅拌下，使得壳聚糖溶液变得清澈透亮，留取备用；
(32)i型胶原溶液的制备
称取25mgi型胶原粉末于盛有10ml浓度为o.02m的稀醋酸水溶液的无菌烧杯中，并用洁净的玻璃棒搅拌至完全溶解；
(33)β-甘油磷酸钠溶液的制备
称取0.4gβ-甘油磷酸钠粉末于盛有1ml蒸馏水的无菌烧杯中，并用洁净的玻璃棒搅拌至完全溶解；
(34)海藻酸钠溶液的制备
称取0.15g海藻酸钠粉末于盛有10ml蒸馏水的无菌烧杯中，在搅拌机的搅拌下，使得海藻酸钠溶液变得清澈透亮，留取备用；
(35)壳聚糖/胶原/β-甘油磷酸钠/海藻酸钠溶液的制备
(351)分别取4ml步骤(31)得到的壳聚糖溶液、2ml步骤(32)得到的i型胶原溶液加入到无菌烧杯中，于冰上搅拌均匀，得到混合液，然后进入步骤(352)；
(352)在冰上，缓慢向步骤(351)得到混合液加入事先配好的1ml步骤(32)得到的β-甘油磷酸钠溶溶液形成混合液，然后进入步骤(353)；
(353)向步骤(352)得到的混合液中加入3ml步骤(34)得到的海藻酸钠溶，搅拌均匀后形成混合液，然后进入步骤(354)；
(354)将步骤(353)得到的混合液加入ep管中，并立即放入37℃恒温培养箱中培养8分钟，即可得到温敏性壳聚糖水凝胶。
进一步地，步骤(4)包括以下步骤：
(41)将步骤(1)诱导生成的胰岛样细胞稀释成细胞悬液，其细胞浓度为2×104个/ml；
(42)将步骤(2)制备的血管内皮细胞稀释成细胞悬液，其细胞浓度为1×105个/ml；
(43)将步骤(41)得到的细胞悬液与步骤(42)得到的细胞悬液按照体积比1：5的比例混合后形成胰岛样细胞与血管内皮细胞混悬液降温至18℃，在冰浴容器中，将胰岛样细胞与血管内皮细胞混悬液与步骤(3)制备的温敏性壳聚糖水凝胶充分混匀后即得到复合型水凝胶。如图1所示,实施例1制备的充质干细胞人工胰岛在电镜下可见两种细胞和凝胶成分。
实施例2
一种间充质干细胞人工胰岛的制备方法，包括以下步骤：
(1)间充质干细胞培养并诱导生成胰岛样细胞；
(2)血管内皮细胞的提取与培养；
(3)温敏性壳聚糖水凝胶的制备；
(4)制备复合型水凝胶；
(5)将步骤(4)得到的复合型水凝胶，进行局部移植后，在37℃体温环境下迅速发生凝集，形成人工胰岛。
进一步地，步骤(1)中的间充质干细胞为脐带间充质干细胞，其包括：
(11)脐带间充质干细胞的提取
(111)无菌条件下，取健康的脐带标本20cm，置于1％含双抗的pbs缓冲液中；
(112)在超净工作台中，反复用pbs冲洗脐带标本以去除残留血液；
(113)在培养皿中剥离脐带标本的外膜、脐静脉和脐动脉后，将剩余组织块剪碎至体积小于1mm3，然后放入含有dmem/f12完全培养基的细胞培养皿中，置37℃、5％v/v％co2、饱和湿度培养箱中培养，4d后进行半量换液，待发现有细胞爬出后，每3d进行换液一次，传至第3代，待第3代脐带间充质干细胞达到80％～90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打皿底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入dmem/f12完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代的脐带间充质干细胞悬液，其中：
dmem/f12完全培养基包括10v/v％fbs、1v/v％青链霉素，余量为dmem/f12；
脐带间充质干细胞传代方法为：待脐带间充质干细胞达到80％～90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打皿底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：3的比例传代；
(12)间充质干细胞诱导胰岛样细胞
(121)取步骤(113)得到的第3代的脐带间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×105个/ml，加入10v/v％fbs、1v/v％青链霉素的dmem/f12完全培养基进行培养，待脐带间充质干细胞融合至80％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导14d，其中：
第一诱导培养基含有15v/v％fbs、150μg/lβ-神经生长因子、20mmol/l尼克酰胺和40μg/l表皮生长因子，余量为dmem/f12；
(122)将步骤(121)诱导的脐带间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养16d，形成胰岛样细胞团，其中：
第二诱导培养基含有20mmol/l尼克酰胺、15μg/l碱性成纤维细胞生长因子、8nmol/l活化素a和2.0v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为dmem/f12。进一步地，步骤(2)包括以下步骤：
(21)无菌条件下，取血管标本20cm，置于1％含双抗的pbs缓冲液中，然后进入步骤(22)；
(22)在超净工作台中，反复用pbs缓冲液冲洗血管标本的内腔，去除其内的残留血液，然后进入步骤(23)；
(23)将钝型针插入血管标本中,并用止血钳使钝型针牢牢固定在血管标本内，然后进入步骤(24)；
(24)用注射器抽pbs缓冲液注入血管标本中，冲洗残留红细胞,直至洗出液清亮为止，然后进入步骤(25)；
(25)用另一只止血钳夹闭血管标本的另一端，然后抽取0.25wt％胰酶10～15ml注入血管标本,移入培养箱37℃孵育10min，然后进入步骤(26)；
(26)用注射器抽出血管内的胰酶及消化下来的细胞,并注入事先装有rpmi1640完全培养基的离心管中,再将15ml该完全培养基注入该血管标本，然后抽出至上述离心管中，然后进入步骤(27)，其中：
rpmi1640完全培养基包括10v/v％fbs和1v/v％青链霉素，余量为rpmi1640；
(27)将离心管以1000rpm的速度离心5分钟，弃上清液,收集内皮细胞,用吸管将其内皮细胞加入装有rpmi1640完全培养基的培养瓶中培养，每3d进行换液，传至4代结束培养，其中：
内皮细胞传代方法为：待内皮细胞达到90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，rpmi1640完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：3的比例传代。
进一步地，步骤(3)包括以下步骤：
(31)壳聚糖溶液的制备
称取0.3g脱乙酰度大于90％的壳聚糖粉末于盛有10ml浓度为o.1m稀醋酸水溶液的无菌烧杯中，在搅拌机的搅拌下，使得壳聚糖溶液变得清澈透亮，留取备用；
(32)i型胶原溶液的制备
称取50mgi型胶原粉末于盛有10ml浓度为o.02m的稀醋酸水溶液的无菌烧杯中，并用洁净的玻璃棒搅拌至完全溶解；
(33)β-甘油磷酸钠溶液的制备
称取0.6gβ-甘油磷酸钠粉末于盛有1ml蒸馏水的无菌烧杯中，并用洁净的玻璃棒搅拌至完全溶解；
(34)海藻酸钠溶液的制备
称取0.25g海藻酸钠粉末于盛有10ml蒸馏水的无菌烧杯中，在搅拌机的搅拌下，使得海藻酸钠溶液变得清澈透亮，留取备用；
(35)壳聚糖/胶原/β-甘油磷酸钠/海藻酸钠溶液的制备
(351)分别取4ml步骤(31)得到的壳聚糖溶液、2ml步骤(32)得到的i型胶原溶液加入到无菌烧杯中，于冰上搅拌均匀，得到混合液，然后进入步骤(352)；
(352)在冰上，缓慢向步骤(351)得到混合液加入事先配好的1ml步骤(32)得到的β-甘油磷酸钠溶溶液形成混合液，然后进入步骤(353)；
(353)向步骤(352)得到的混合液中加入3ml步骤(34)得到的海藻酸钠溶，搅拌均匀后形成混合液，然后进入步骤(354)；
(354)将步骤(353)得到的混合液加入ep管中，并立即放入37℃恒温培养箱中培养10分钟，即可得到温敏性壳聚糖水凝胶。
进一步地，步骤(4)包括以下步骤：
(41)将步骤(1)诱导生成的胰岛样细胞稀释成细胞悬液，其细胞浓度为2×106个/ml；
(42)将步骤(2)制备的血管内皮细胞稀释成细胞悬液，其细胞浓度为1×107个/ml；
(43)将步骤(41)得到的细胞悬液与步骤(42)得到的细胞悬液按照体积比1：5的比例混合后形成胰岛样细胞与血管内皮细胞混悬液降温至20℃，在冰浴容器中，将胰岛样细胞与血管内皮细胞混悬液与步骤(3)制备的温敏性壳聚糖水凝胶充分混匀后即得到复合型水凝胶。
实施例3
一种间充质干细胞人工胰岛的制备方法，包括以下步骤：
(1)间充质干细胞培养并诱导生成胰岛样细胞；
(2)血管内皮细胞的提取与培养；
(3)温敏性壳聚糖水凝胶的制备；
(4)制备复合型水凝胶；
(5)将步骤(4)得到的复合型水凝胶，进行局部移植后，在37℃体温环境下迅速发生凝集，形成人工胰岛。
进一步地，步骤(1)中的间充质干细胞为脐带间充质干细胞，其包括：
(11)脐带间充质干细胞的提取
(111)无菌条件下，取健康的脐带标本15cm，置于1％含双抗的pbs缓冲液中；
(112)在超净工作台中，反复用pbs冲洗脐带标本以去除残留血液；
(113)在培养皿中剥离脐带标本的外膜、脐静脉和脐动脉后，将剩余组织块剪碎至体积小于1mm3，然后放入含有dmem/f12完全培养基的细胞培养皿中，置37℃、5％v/v％co2、饱和湿度培养箱中培养，4d后进行半量换液，待发现有细胞爬出后，每3d进行换液一次，传至第3代，待第3代脐带间充质干细胞达到80％～90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打皿底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入dmem/f12完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代的脐带间充质干细胞悬液，其中：
dmem/f12完全培养基包括10v/v％fbs、1v/v％青链霉素，余量为dmem/f12；
脐带间充质干细胞传代方法为：待脐带间充质干细胞达到85％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打皿底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：2.5的比例传代；
(12)间充质干细胞诱导胰岛样细胞
(121)取步骤(113)得到的第3代的脐带间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×105个/ml，加入10v/v％fbs、1v/v％青链霉素的dmem/f12完全培养基进行培养，待脐带间充质干细胞融合至75％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导12d，其中：
第一诱导培养基含有12.5v/v％fbs、100μg/lβ-神经生长因子、12mmol/l尼克酰胺和25μg/l表皮生长因子，余量为dmem/f12；
(122)将步骤(121)诱导的脐带间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养14d，形成胰岛样细胞团，其中：
第二诱导培养基含有12.5mmol/l尼克酰胺、10μg/l碱性成纤维细胞生长因子、5nmol/l活化素a和1.5v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为dmem/f12。
进一步地，步骤(2)包括以下步骤：
(21)无菌条件下，取血管标本17.5cm，置于1％含双抗的pbs缓冲液中，然后进入步骤(22)；
(22)在超净工作台中，反复用pbs缓冲液冲洗血管标本的内腔，去除其内的残留血液，然后进入步骤(23)；
(23)将钝型针插入血管标本中,并用止血钳使钝型针牢牢固定在血管标本内，然后进入步骤(24)；
(24)用注射器抽pbs缓冲液注入血管标本中，冲洗残留红细胞,直至洗出液清亮为止，然后进入步骤(25)；
(25)用另一只止血钳夹闭血管标本的另一端，然后抽取0.2wt％胰酶12.5ml注入血管标本,移入培养箱37℃孵育9min，然后进入步骤(26)；
(26)用注射器抽出血管内的胰酶及消化下来的细胞,并注入事先装有rpmi1640完全培养基的离心管中,再将12.5ml该完全培养基注入该血管标本，然后抽出至上述离心管中，然后进入步骤(27)，其中：
rpmi1640完全培养基包括10v/v％fbs和1v/v％青链霉素，余量为rpmi1640；
(27)将离心管以1000rpm的速度离心5分钟，弃上清液,收集内皮细胞,用吸管将其内皮细胞加入装有rpmi1640完全培养基的培养瓶中培养，每3d进行换液，传至3代结束培养，其中：
内皮细胞传代方法为：待内皮细胞达到85％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，rpmi1640完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：2.5的比例传代。
进一步地，步骤(3)包括以下步骤：
(31)壳聚糖溶液的制备
称取0.25g脱乙酰度大于90％的壳聚糖粉末于盛有10ml浓度为o.1m稀醋酸水溶液的无菌烧杯中，在搅拌机的搅拌下，使得壳聚糖溶液变得清澈透亮，留取备用；
(32)i型胶原溶液的制备
称取37.5mgi型胶原粉末于盛有10ml浓度为o.02m的稀醋酸水溶液的无菌烧杯中，并用洁净的玻璃棒搅拌至完全溶解；
(33)β-甘油磷酸钠溶液的制备
称取0.5gβ-甘油磷酸钠粉末于盛有1ml蒸馏水的无菌烧杯中，并用洁净的玻璃棒搅拌至完全溶解；
(34)海藻酸钠溶液的制备
称取0.2g海藻酸钠粉末于盛有10ml蒸馏水的无菌烧杯中，在搅拌机的搅拌下，使得海藻酸钠溶液变得清澈透亮，留取备用；
(35)壳聚糖/胶原/β-甘油磷酸钠/海藻酸钠溶液的制备
(351)分别取4ml步骤(31)得到的壳聚糖溶液、2ml步骤(32)得到的i型胶原溶液加入到无菌烧杯中，于冰上搅拌均匀，得到混合液，然后进入步骤(352)；
(352)在冰上，缓慢向步骤(351)得到混合液加入事先配好的1ml步骤(32)得到的β-甘油磷酸钠溶溶液形成混合液，然后进入步骤(353)；
(353)向步骤(352)得到的混合液中加入3ml步骤(34)得到的海藻酸钠溶，搅拌均匀后形成混合液，然后进入步骤(354)；
(354)将步骤(353)得到的混合液加入ep管中，并立即放入37℃恒温培养箱中培养9分钟，即可得到温敏性壳聚糖水凝胶。
进一步地，步骤(4)包括以下步骤：
(41)将步骤(1)诱导生成的胰岛样细胞稀释成细胞悬液，其细胞浓度为2×105个/ml；
(42)将步骤(2)制备的血管内皮细胞稀释成细胞悬液，其细胞浓度为1×106个/ml；
(43)将步骤(41)得到的细胞悬液与步骤(42)得到的细胞悬液按照体积比1：5的比例混合后形成胰岛样细胞与血管内皮细胞混悬液降温至18℃～20℃，在冰浴容器中，将胰岛样细胞与血管内皮细胞混悬液与步骤(3)制备的温敏性壳聚糖水凝胶充分混匀后即得到复合型水凝胶。
实施例4
与实施例1大致相同，区别仅仅在于：间充质干细胞的培养方式不同：
步骤(1)中的间充质干细胞为外周血间充质干细胞，其包括：
s11外周血间充质干细胞的提取
s111抽取血液20ml，肝素抗凝，以等量稀释；
s112另取一离心管，管内注入1.073g/l的ficoll分离液，将步骤s111稀释好的血液缓慢沿管壁均匀滴加在ficoll分离液上，二者比例1：1，然后以2000rpm离心25min，收集中间白色云雾状的单个核细胞层；
s113向步骤s112得到的单个核细胞层中加入pbs缓冲液洗涤1次，采用红细胞裂解液裂解红细胞，pbs洗涤2次，弃上清液，然后用5mllg-dmem完全培养基重悬细胞，按5×105/cm2细胞密度接种于t25培养瓶中，置37℃、5v/v％co2、饱和湿度培养箱中培养，72h首次半量换液，而后每2d全量换液1次，传至第3代，待第3代外周血间充质干细胞达到80％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，lg-dmem完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入lg-dmem完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代外周血间充质干细胞悬液，其中：
lg-dmem完全培养基含有15v/v％fbs、1v/v％青链霉素，其余为lg-dmem；
外周血间充质干细胞传代方法为：待外周血间充质干细胞达到80％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，lg-dmem完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：2的比例传代；
s12间充质干细胞诱导胰岛样细胞
s121取步骤s113得到的第3代的外周血间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×105个/ml，加入10v/v％fbs、1v/v％青链霉素的dmem/f12完全培养基进行培养，待外周血间充质干细胞融合至70％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导10d，其中：
第一诱导培养基含有10v/v％fbs、50μg/lβ-神经生长因子、4mmol/l尼克酰胺和10μg/l表皮生长因子，余量为dmem/f12；
s122将步骤s121诱导的外周血间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养12d，形成胰岛样细胞团，其中
第二诱导培养基含有5mmol/l尼克酰胺、5μg/l碱性成纤维细胞生长因子、2nmol/l活化素a和1.0v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为dmem/f12。
实施例5
与实施例2大致相同，区别仅仅在于：间充质干细胞的培养方式不同：
步骤(1)中的间充质干细胞为外周血间充质干细胞，其包括：
s11外周血间充质干细胞的提取
s111抽取血液30ml，肝素抗凝，以等量稀释；
s112另取一离心管，管内注入1.073g/l的ficoll分离液，将步骤s111稀释好的血液缓慢沿管壁均匀滴加在ficoll分离液上，二者比例1：1，然后以2000rpm离心25min，收集中间白色云雾状的单个核细胞层；
s113向步骤s112得到的单个核细胞层中加入pbs缓冲液洗涤1次，采用红细胞裂解液裂解红细胞，pbs洗涤2次，弃上清液，然后用5mllg-dmem完全培养基重悬细胞，按5×105/cm2细胞密度接种于t25培养瓶中，置37℃、5v/v％co2、饱和湿度培养箱中培养，72h首次半量换液，而后每3d全量换液1次，传至第3代，待第3代外周血间充质干细胞达到90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，lg-dmem完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入lg-dmem完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代外周血间充质干细胞悬液，其中：
lg-dmem完全培养基含有15v/v％fbs、1v/v％青链霉素，其余为lg-dmem；
外周血间充质干细胞传代方法为：待外周血间充质干细胞达到90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，lg-dmem完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：3的比例传代；
s12间充质干细胞诱导胰岛样细胞
s121取步骤s113得到的第3代的外周血间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×105个/ml，加入10v/v％fbs、1v/v％青链霉素的dmem/f12完全培养基进行培养，待外周血间充质干细胞融合至70％～80％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导14d，其中：
第一诱导培养基含有15v/v％fbs、150μg/lβ-神经生长因子、20mmol/l尼克酰胺和40μg/l表皮生长因子，余量为dmem/f12；
s122将步骤s121诱导的外周血间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养16d，形成胰岛样细胞团，其中
第二诱导培养基含有20mmol/l尼克酰胺、15μg/l碱性成纤维细胞生长因子、8nmol/l活化素a和2.0v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为dmem/f12。
实施例6
与实施例1大致相同，区别仅仅在于：间充质干细胞的培养方式不同：
步骤(1)中的间充质干细胞为外周血间充质干细胞，其包括：
s11外周血间充质干细胞的提取
s111抽取血液25ml，肝素抗凝，以等量稀释；
s112另取一离心管，管内注入1.073g/l的ficoll分离液，将步骤s111稀释好的血液缓慢沿管壁均匀滴加在ficoll分离液上，二者比例1：1，然后以2000rpm离心25min，收集中间白色云雾状的单个核细胞层；
s113向步骤s112得到的单个核细胞层中加入pbs缓冲液洗涤1次，采用红细胞裂解液裂解红细胞，pbs洗涤2次，弃上清液，然后用5mllg-dmem完全培养基重悬细胞，按5×105/cm2细胞密度接种于t25培养瓶中，置37℃、5v/v％co2、饱和湿度培养箱中培养，72h首次半量换液，而后每2.5d全量换液1次，传至第3代，待第3代外周血间充质干细胞达到85％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，lg-dmem完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入lg-dmem完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代外周血间充质干细胞悬液，其中：
lg-dmem完全培养基含有15v/v％fbs、1v/v％青链霉素，其余为lg-dmem；
外周血间充质干细胞传代方法为：待外周血间充质干细胞达到85％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，lg-dmem完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：2.5的比例传代；
s12间充质干细胞诱导胰岛样细胞
s121取步骤s113得到的第3代的外周血间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×105个/ml，加入10v/v％fbs、1v/v％青链霉素的dmem/f12完全培养基进行培养，待外周血间充质干细胞融合至75％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导12d，其中：
第一诱导培养基含有12.5v/v％fbs、100μg/lβ-神经生长因子、12mmol/l尼克酰胺和25μg/l表皮生长因子，余量为dmem/f12；
s122将步骤s121诱导的外周血间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养14d，形成胰岛样细胞团，其中第二诱导培养基含有12.5mmol/l尼克酰胺、10μg/l碱性成纤维细胞生长因子、5nmol/l活化素a和1.5v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为dmem/f12。
实施例7
与实施例1大致相同，区别仅仅在于：间充质干细胞的培养方式不同：
步骤(1)中的间充质干细胞为脂肪间充质干细胞，其包括：
a脂肪间充质干细胞的提取
a1无菌条件下取脂肪组织，剔除血管筋膜，pbs冲洗三次，去除红细胞，剪碎至体积小于lmm3，然后置入锥形瓶中，加入5倍体积的0.1wt％的i型胶原酶，37℃，水浴震荡消化50min；
a2向所述锥形瓶中加入等体积的hg-dmem完全培养基终止消化，1500rpm，4℃离心10min，倾去上层脂肪及上清，得到细胞沉淀，其中：
hg-dmem完全培养基包括15v/v％fbs和1v/v％青链霉素，余量为hg-dmem；
a3向所述锥形瓶中加入10mlhg-dmem完全培养基，悬浮沉淀，200目滤网过滤，将滤液1500rpm，4℃离心10min，去上清，得到细胞沉淀；
a4向所述锥形瓶中加入5mlhg-dmem完全培养基，悬浮细胞沉淀，接种于t25细胞培养瓶中，置入37℃、5％v/vc02、饱和湿度培养箱中培养，48h后首次换液，去除未贴壁细胞，然后每2d换液一次，传至第3代，待第3代脂肪间充质干细胞达到80％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，hg-dmem完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入hg-dmem完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代的脂肪间充质干细胞悬液，其中：
脂肪间充质干细胞传代方法为：待脂肪间充质干细胞达到80％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，hg-dmem完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：2的比例传代；
b间充质干细胞诱导胰岛样细胞
b1取步骤a4得到的第3代的脂肪间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×105个/ml，加入10v/v％fbs、1v/v％青链霉素的dmem/f12完全培养基进行培养，待脂肪间充质干细胞融合至70％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导10d，其中：
第一诱导培养基含有10v/v％fbs、50μg/lβ-神经生长因子、4mmol/l尼克酰胺和10μg/l表皮生长因子，余量为dmem/f12；
b2将步骤b1诱导的脂肪间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养12d，形成胰岛样细胞团，其中：
第二诱导培养基含有5mmol/l尼克酰胺、5μg/l碱性成纤维细胞生长因子、2nmol/l活化素a和1.0v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为dmem/f12。
实施例8
与实施例1大致相同，区别仅仅在于：间充质干细胞的培养方式不同：
步骤(1)中的间充质干细胞为脂肪间充质干细胞，其包括：
a脂肪间充质干细胞的提取
a1无菌条件下取脂肪组织，剔除血管筋膜，pbs冲洗三次，去除红细胞，剪碎至体积小于lmm3，然后置入锥形瓶中，加入6倍体积的0.1wt％的i型胶原酶，37℃，水浴震荡消化70min；
a2向所述锥形瓶中加入等体积的hg-dmem完全培养基终止消化，1500rpm，4℃离心10min，倾去上层脂肪及上清，得到细胞沉淀，其中：
hg-dmem完全培养基包括15v/v％fbs和1v/v％青链霉素，余量为hg-dmem；
a3向所述锥形瓶中加入15mlhg-dmem完全培养基，悬浮沉淀，200目滤网过滤，将滤液1500rpm，4℃离心10min，去上清，得到细胞沉淀；
a4向所述锥形瓶中加入5mlhg-dmem完全培养基，悬浮细胞沉淀，接种于t25细胞培养瓶中，置入37℃、5％v/vc02、饱和湿度培养箱中培养，72h后首次换液，去除未贴壁细胞，然后每3d换液一次，传至第3代，待第3代脂肪间充质干细胞达到90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，hg-dmem完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入hg-dmem完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代的脂肪间充质干细胞悬液，其中：
脂肪间充质干细胞传代方法为：待脂肪间充质干细胞达到90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，hg-dmem完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：3的比例传代；
b间充质干细胞诱导胰岛样细胞
b1取步骤a4得到的第3代的脂肪间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×105个/ml，加入10v/v％fbs、1v/v％青链霉素的dmem/f12完全培养基进行培养，待脂肪间充质干细胞融合至80％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导14d，其中：
第一诱导培养基含有15v/v％fbs、150μg/lβ-神经生长因子、20mmol/l尼克酰胺和40μg/l表皮生长因子，余量为dmem/f12；
b2将步骤b1诱导的脂肪间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养16d，形成胰岛样细胞团，其中：
第二诱导培养基含有20mmol/l尼克酰胺、15μg/l碱性成纤维细胞生长因子、8nmol/l活化素a和2.0v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为dmem/f12。
实施例9
与实施例1大致相同，区别仅仅在于：间充质干细胞的培养方式不同：
步骤(1)中的间充质干细胞为脂肪间充质干细胞，其包括：
a脂肪间充质干细胞的提取
a1无菌条件下取脂肪组织，剔除血管筋膜，pbs冲洗三次，去除红细胞，剪碎至体积小于lmm3，然后置入锥形瓶中，加入5.5倍体积的0.1wt％的i型胶原酶，37℃，水浴震荡消化60min；
a2向所述锥形瓶中加入等体积的hg-dmem完全培养基终止消化，1500rpm，4℃离心10min，倾去上层脂肪及上清，得到细胞沉淀，其中：
hg-dmem完全培养基包括15v/v％fbs和1v/v％青链霉素，余量为hg-dmem；
a3向所述锥形瓶中加入12.5mlhg-dmem完全培养基，悬浮沉淀，200目滤网过滤，将滤液1500rpm，4℃离心10min，去上清，得到细胞沉淀；
a4向所述锥形瓶中加入5mlhg-dmem完全培养基，悬浮细胞沉淀，接种于t25细胞培养瓶中，置入37℃、5％v/vc02、饱和湿度培养箱中培养，60h后首次换液，去除未贴壁细胞，然后每2.5d换液一次，传至第3代，待第3代脂肪间充质干细胞达到85％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，hg-dmem完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入hg-dmem完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代的脂肪间充质干细胞悬液，其中：
脂肪间充质干细胞传代方法为：待脂肪间充质干细胞达到85％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，hg-dmem完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：2.5的比例传代；
b间充质干细胞诱导胰岛样细胞
b1取步骤a4得到的第3代的脂肪间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×105个/ml，加入10v/v％fbs、1v/v％青链霉素的dmem/f12完全培养基进行培养，待脂肪间充质干细胞融合至75％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导12d，其中：
第一诱导培养基含有12.5v/v％fbs、100μg/lβ-神经生长因子、12mmol/l尼克酰胺和25μg/l表皮生长因子，余量为dmem/f12；
b2将步骤b1诱导的脂肪间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养14d，形成胰岛样细胞团，其中：
第二诱导培养基含有12.5mmol/l尼克酰胺、10μg/l碱性成纤维细胞生长因子、5nmol/l活化素a和1.5v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为dmem/f12。
实施例10
与实施例1大致相同，区别仅仅在于：间充质干细胞的培养方式不同：
步骤(1)中的间充质干细胞为子宫内膜间充质干细胞，其包括：
(ⅰ)子宫内膜间充质干细胞的提取
(ⅰ1)无菌条件下取子宫内膜组织，用无ca2+和mg2+的pbs缓冲液冲洗三次，然后转入无菌培养皿中，用无菌眼科剪剪至体积小于1mm3，
(ⅰ2)然后向无菌培养皿加入2倍体积的0.1wt％胶原酶，37℃，水浴震荡消化60min，收集消化液于离心管中，向离心管中加入dmem-f12完全培养基终止消化，然后以1000rpm离心10min，弃去上清液，保留细胞沉淀，其中：
dmem/f12完全培养基含10v/v％fbs和1v/v％青链霉素，余量为dmem/f12；
(ⅰ3)然后向离心管中加4倍体积的红细胞裂解液，持续震荡，当离心管内液体逐渐变为红色时，向离心管中添加10mlpbs缓冲液，再次1000rpm离心5min，弃上清，
(ⅰ4)然后向离心管中加入5mldmem/f12完全培养基悬浮细胞沉淀，接种于t25细胞培养瓶中，置入37℃、5v/v％c02、饱和湿度培养箱中培养，24h后首次换液，去除未贴壁细胞，然后每2d换液一次，传至第3代，待第3代子宫内膜间充质干细胞达到80％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入dmem/f12完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代的子宫内膜间充质干细胞悬液，其中：
子宫内膜间充质干细胞传代方法为：待子宫内膜间充质干细胞达到80％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：2的比例传代；
(ⅱ)间充质干细胞诱导胰岛样细胞
(ⅱ1)取步骤(ⅰ)得到的第3代的子宫内膜间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×105个/ml，加入10v/v％fbs、1v/v％青链霉素的dmem/f12完全培养基进行培养，待脂肪间充质干细胞融合至70％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导10d，其中：
第一诱导培养基含有10v/v％fbs、50μg/lβ-神经生长因子、4mmol/l尼克酰胺和10μg/l表皮生长因子，余量为dmem/f12；
(ⅱ2)将步骤(ⅱ1)诱导的子宫内膜间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养12d，形成胰岛样细胞团，其中：
第二诱导培养基含有5mmol/l尼克酰胺、5μg/l碱性成纤维细胞生长因子、2nmol/l活化素a和1.0v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为dmem/f12。
实施例11
与实施例2大致相同，区别仅仅在于：间充质干细胞的培养方式不同：
步骤(1)中的间充质干细胞为子宫内膜间充质干细胞，其包括：
(ⅰ)子宫内膜间充质干细胞的提取
(ⅰ1)无菌条件下取子宫内膜组织，用无ca2+和mg2+的pbs缓冲液冲洗三次，然后转入无菌培养皿中，用无菌眼科剪剪至体积小于1mm3，
(ⅰ2)然后向无菌培养皿加入2倍体积的0.1wt％胶原酶，37℃，水浴震荡消化60min，收集消化液于离心管中，向离心管中加入dmem-f12完全培养基终止消化，然后以1000rpm离心10min，弃去上清液，保留细胞沉淀，其中：
dmem/f12完全培养基含10v/v％fbs和1v/v％青链霉素，余量为dmem/f12；
(ⅰ3)然后向离心管中加4倍体积的红细胞裂解液，持续震荡，当离心管内液体逐渐变为红色时，向离心管中添加10mlpbs缓冲液，再次1000rpm离心5min，弃上清，
(ⅰ4)然后向离心管中加入5mldmem/f12完全培养基悬浮细胞沉淀，接种于t25细胞培养瓶中，置入37℃、5v/v％c02、饱和湿度培养箱中培养，48h后首次换液，去除未贴壁细胞，然后每3d换液一次，传至第3代，待第3代子宫内膜间充质干细胞达到90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入dmem/f12完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代的子宫内膜间充质干细胞悬液，其中：
子宫内膜间充质干细胞传代方法为：待子宫内膜间充质干细胞达到90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：3的比例传代；
(ⅱ)间充质干细胞诱导胰岛样细胞
(ⅱ1)取步骤(ⅰ)得到的第3代的子宫内膜间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×105个/ml，加入10v/v％fbs、1v/v％青链霉素的dmem/f12完全培养基进行培养，待脂肪间充质干细胞融合至80％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导14d，其中：
第一诱导培养基含有15v/v％fbs、150μg/lβ-神经生长因子、20mmol/l尼克酰胺和40μg/l表皮生长因子，余量为dmem/f12；
(ⅱ2)将步骤(ⅱ1)诱导的子宫内膜间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养16d，形成胰岛样细胞团，其中：
第二诱导培养基含有20mmol/l尼克酰胺、15μg/l碱性成纤维细胞生长因子、8nmol/l活化素a和2.0v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为dmem/f12。
实施例12
与实施例3大致相同，区别仅仅在于：间充质干细胞的培养方式不同：
步骤(1)中的间充质干细胞为子宫内膜间充质干细胞，其包括：
(ⅰ)子宫内膜间充质干细胞的提取
(ⅰ1)无菌条件下取子宫内膜组织，用无ca2+和mg2+的pbs缓冲液冲洗三次，然后转入无菌培养皿中，用无菌眼科剪剪至体积小于1mm3，
(ⅰ2)然后向无菌培养皿加入2倍体积的0.1wt％胶原酶，37℃，水浴震荡消化60min，收集消化液于离心管中，向离心管中加入dmem-f12完全培养基终止消化，然后以1000rpm离心10min，弃去上清液，保留细胞沉淀，其中：
dmem/f12完全培养基含10v/v％fbs和1v/v％青链霉素，余量为dmem/f12；
(ⅰ3)然后向离心管中加4倍体积的红细胞裂解液，持续震荡，当离心管内液体逐渐变为红色时，向离心管中添加10mlpbs缓冲液，再次1000rpm离心5min，弃上清，
(ⅰ4)然后向离心管中加入5mldmem/f12完全培养基悬浮细胞沉淀，接种于t25细胞培养瓶中，置入37℃、5v/v％c02、饱和湿度培养箱中培养，36h后首次换液，去除未贴壁细胞，然后每2.5d换液一次，传至第3代，待第3代子宫内膜间充质干细胞达到80％～90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入dmem/f12完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代的子宫内膜间充质干细胞悬液，其中：
子宫内膜间充质干细胞传代方法为：待子宫内膜间充质干细胞达到85％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：2.5的比例传代；
(ⅱ)间充质干细胞诱导胰岛样细胞
(ⅱ1)取步骤(ⅰ)得到的第3代的子宫内膜间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×105个/ml，加入10v/v％fbs、1v/v％青链霉素的dmem/f12完全培养基进行培养，待脂肪间充质干细胞融合至75％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导12d，其中：
第一诱导培养基含有12.5v/v％fbs、100μg/lβ-神经生长因子、12mmol/l尼克酰胺和25μg/l表皮生长因子，余量为dmem/f12；
(ⅱ2)将步骤(ⅱ1)诱导的子宫内膜间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养14d，形成胰岛样细胞团，其中：
第二诱导培养基含有12.5mmol/l尼克酰胺、10μg/l碱性成纤维细胞生长因子、5nmol/l活化素a和1.5v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为dmem/f12。
实施例13
与实施例1大致相同，区别仅仅在于：间充质干细胞的培养方式不同：
步骤(1)中的间充质干细胞为骨髓间充质干细胞，包括：
sⅰ骨髓间充质干细胞的提取
sⅰ1无菌条件取出股骨和胫骨，从股骨干和胫骨干中间剪断，用dmem/f12完全培养基反复冲洗骨髓腔得到冲洗液，其中：
dmem/f12完全培养基包括10v/v％fbs和1v/v％青链霉素，余量为dmem/f12；
sⅰ2将冲洗液用200目滤网过滤，取滤液，然后将滤液置于离心管中，1000rpm，离心5min，去上清，得到细胞沉淀；
sⅰ3向离心管中加入5mldmem/f12完全培养基悬浮细胞沉淀，接种于t25细胞培养瓶中，置入37℃、5v/v％c02、饱和湿度培养箱中培养，24h后首次换液，去除未贴壁细胞，然后每2d换液一次，传至第3代，待第3代骨髓间充质干细胞达到80％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入dmem/f12完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代的骨髓间充质干细胞悬液，其中：
骨髓间充质干细胞传代方法为：待骨髓间充质干细胞达到80％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：2的比例传代；
sⅱ间充质干细胞诱导胰岛样细胞
sⅱ1取步骤sⅰ得到的第3代的骨髓间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×105个/ml，加入10v/v％fbs、1v/v％青链霉素的dmem/f12完全培养基进行培养，待脂肪间充质干细胞融合至70％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导10d，其中：
第一诱导培养基含有10v/v％fbs、50μg/lβ-神经生长因子、4mmol/l尼克酰胺和10μg/l表皮生长因子，余量为dmem/f12；
sⅱ2将步骤sⅱ1诱导的骨髓间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养12d，形成胰岛样细胞团，其中：
第二诱导培养基含有5mmol/l尼克酰胺、5μg/l碱性成纤维细胞生长因子、2nmol/l活化素a和1.0v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为dmem/f12。
实施例14
与实施例2大致相同，区别仅仅在于：间充质干细胞的培养方式不同：
步骤(1)中的间充质干细胞为骨髓间充质干细胞，包括：
sⅰ骨髓间充质干细胞的提取
sⅰ1无菌条件取出股骨和胫骨，从股骨干和胫骨干中间剪断，用dmem/f12完全培养基反复冲洗骨髓腔得到冲洗液，其中：
dmem/f12完全培养基包括10v/v％fbs和1v/v％青链霉素，余量为dmem/f12；
sⅰ2将冲洗液用200目滤网过滤，取滤液，然后将滤液置于离心管中，1000rpm，离心5min，去上清，得到细胞沉淀；
sⅰ3向离心管中加入5mldmem/f12完全培养基悬浮细胞沉淀，接种于t25细胞培养瓶中，置入37℃、5v/v％c02、饱和湿度培养箱中培养，48h后首次换液，去除未贴壁细胞，然后每3d换液一次，传至第3代，待第3代骨髓间充质干细胞达到90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入dmem/f12完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代的骨髓间充质干细胞悬液，其中：
骨髓间充质干细胞传代方法为：待骨髓间充质干细胞达到90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：3的比例传代；
sⅱ间充质干细胞诱导胰岛样细胞
sⅱ1取步骤sⅰ得到的第3代的骨髓间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×105个/ml，加入10v/v％fbs、1v/v％青链霉素的dmem/f12完全培养基进行培养，待脂肪间充质干细胞融合至80％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导14d，其中：
第一诱导培养基含有15v/v％fbs、150μg/lβ-神经生长因子、20mmol/l尼克酰胺和40μg/l表皮生长因子，余量为dmem/f12；
sⅱ2将步骤sⅱ1诱导的骨髓间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养16d，形成胰岛样细胞团，其中：
第二诱导培养基含有20mmol/l尼克酰胺、15μg/l碱性成纤维细胞生长因子、8nmol/l活化素a和2.0v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为dmem/f12。
实施例15
与实施例3大致相同，区别仅仅在于：间充质干细胞的培养方式不同：
步骤(1)中的间充质干细胞为骨髓间充质干细胞，包括：
sⅰ骨髓间充质干细胞的提取
sⅰ1无菌条件取出股骨和胫骨，从股骨干和胫骨干中间剪断，用dmem/f12完全培养基反复冲洗骨髓腔得到冲洗液，其中：
dmem/f12完全培养基包括10v/v％fbs和1v/v％青链霉素，余量为dmem/f12；
sⅰ2将冲洗液用200目滤网过滤，取滤液，然后将滤液置于离心管中，1000rpm，离心5min，去上清，得到细胞沉淀；
sⅰ3向离心管中加入5mldmem/f12完全培养基悬浮细胞沉淀，接种于t25细胞培养瓶中，置入37℃、5v/v％c02、饱和湿度培养箱中培养，36h后首次换液，去除未贴壁细胞，然后每2.5d换液一次，传至第3代，待第3代骨髓间充质干细胞达到85％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入dmem/f12完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代的骨髓间充质干细胞悬液，其中：
骨髓间充质干细胞传代方法为：待骨髓间充质干细胞达到85％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：2.5的比例传代；
sⅱ间充质干细胞诱导胰岛样细胞
sⅱ1取步骤sⅰ得到的第3代的骨髓间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×105个/ml，加入10v/v％fbs、1v/v％青链霉素的dmem/f12完全培养基进行培养，待脂肪间充质干细胞融合至75％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导12d，其中：
第一诱导培养基含有12.5v/v％fbs、100μg/lβ-神经生长因子、12mmol/l尼克酰胺和25μg/l表皮生长因子，余量为dmem/f12；
sⅱ2将步骤sⅱ1诱导的骨髓间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养14d，形成胰岛样细胞团，其中：
第二诱导培养基含有12.5mmol/l尼克酰胺、10μg/l碱性成纤维细胞生长因子、5nmol/l活化素a和1.5v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为dmem/f12。
实施例16
与实施例1大致相同，区别仅仅在于：间充质干细胞的培养方式不同：
步骤(1)中的间充质干细胞为胎盘间充质干细胞，其包括：
(ⅰ)胎盘间充质干细胞的提取
(ⅰ1)无菌条件下取胎盘靠近脐带部位胎盘小叶，剥除羊膜和底蜕膜部分，取胎盘胎儿面组织，然后用pbs反复冲洗至液体较清亮，用眼科剪剪碎至体积小于1mm3，然后置于无菌培养皿中；
(ⅰ2)向无菌培养皿中加入2倍体积的0.1wt％胶原酶，37℃消化30min，然后用200目滤网过滤，取滤液，置于离心管中，然后滤液1000rpm，离心5min，去上清，得到细胞沉淀；
(ⅰ3)向离心管中加入5mldmem/f12完全培养基悬浮细胞沉淀，接种于t25细胞培养瓶中，置入37℃、5v/v％c02、饱和湿度培养箱中培养，24h后首次换液，去除未贴壁细胞，然后每2d换液一次，传至第3代，待第3代胎盘间充质干细胞达到80％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打皿底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入dmem/f12完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代的胎盘间充质干细胞悬液，其中：
dmem/f12完全培养基包括10v/v％fbs和1v/v％青链霉素，余量为dmem/f12；
胎盘间充质干细胞传代方法为：待胎盘间充质干细胞达到80％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打皿底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：2的比例传代；
(ⅱ)间充质干细胞诱导胰岛样细胞
(ⅱ1)取步骤(ⅰ)得到的第3代的胎盘间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×105个/ml，加入10v/v％fbs、1v/v％青链霉素的dmem/f12完全培养基进行培养，待脂肪间充质干细胞融合至70％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导10d，其中：
第一诱导培养基含有10v/v％fbs、50μg/lβ-神经生长因子、4mmol/l尼克酰胺和10μg/l表皮生长因子，余量为dmem/f12；
(ⅱ2)将步骤(ⅱ1)诱导的胎盘间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养12d，形成胰岛样细胞团，其中：
第二诱导培养基含有5mmol/l尼克酰胺、5μg/l碱性成纤维细胞生长因子、2nmol/l活化素a和1.0v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为dmem/f12。
实施例17
与实施例2大致相同，区别仅仅在于：间充质干细胞的培养方式不同：
步骤(1)中的间充质干细胞为胎盘间充质干细胞，其包括：
(ⅰ)胎盘间充质干细胞的提取
(ⅰ1)无菌条件下取胎盘靠近脐带部位胎盘小叶，剥除羊膜和底蜕膜部分，取胎盘胎儿面组织，然后用pbs反复冲洗至液体较清亮，用眼科剪剪碎至体积小于1mm3，然后置于无菌培养皿中；
(ⅰ2)向无菌培养皿中加入2倍体积的0.1wt％胶原酶，37℃消化30min，然后用200目滤网过滤，取滤液，置于离心管中，然后滤液1000rpm，离心5min，去上清，得到细胞沉淀；
(ⅰ3)向离心管中加入5mldmem/f12完全培养基悬浮细胞沉淀，接种于t25细胞培养瓶中，置入37℃、5v/v％c02、饱和湿度培养箱中培养，48h后首次换液，去除未贴壁细胞，然后每3d换液一次，传至第3代，待第3代胎盘间充质干细胞达到90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打皿底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入dmem/f12完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代的胎盘间充质干细胞悬液，其中：
dmem/f12完全培养基包括10v/v％fbs和1v/v％青链霉素，余量为dmem/f12；
胎盘间充质干细胞传代方法为：待胎盘间充质干细胞达到90％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打皿底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：3的比例传代；
(ⅱ)间充质干细胞诱导胰岛样细胞
(ⅱ1)取步骤(ⅰ)得到的第3代的胎盘间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×105个/ml，加入10v/v％fbs、1v/v％青链霉素的dmem/f12完全培养基进行培养，待脂肪间充质干细胞融合至80％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导14d，其中：
第一诱导培养基含有15v/v％fbs、150μg/lβ-神经生长因子、20mmol/l尼克酰胺和40μg/l表皮生长因子，余量为dmem/f12；
(ⅱ2)将步骤(ⅱ1)诱导的胎盘间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养16d，形成胰岛样细胞团，其中：
第二诱导培养基含有20mmol/l尼克酰胺、15μg/l碱性成纤维细胞生长因子、8nmol/l活化素a和2.0v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为dmem/f12。
实施例18
与实施例3大致相同，区别仅仅在于：间充质干细胞的培养方式不同：
步骤(1)中的间充质干细胞为胎盘间充质干细胞，其包括：
(ⅰ)胎盘间充质干细胞的提取
(ⅰ1)无菌条件下取胎盘靠近脐带部位胎盘小叶，剥除羊膜和底蜕膜部分，取胎盘胎儿面组织，然后用pbs反复冲洗至液体较清亮，用眼科剪剪碎至体积小于1mm3，然后置于无菌培养皿中；
(ⅰ2)向无菌培养皿中加入2倍体积的0.1wt％胶原酶，37℃消化30min，然后用200目滤网过滤，取滤液，置于离心管中，然后滤液1000rpm，离心5min，去上清，得到细胞沉淀；
(ⅰ3)向离心管中加入5mldmem/f12完全培养基悬浮细胞沉淀，接种于t25细胞培养瓶中，置入37℃、5v/v％c02、饱和湿度培养箱中培养，36h后首次换液，去除未贴壁细胞，然后每2.5d换液一次，传至第3代，待第3代胎盘间充质干细胞达到85％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打皿底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃去上清，向细胞沉淀中加入dmem/f12完全培养基1ml,重悬细胞沉淀，并对其进行细胞计数，完成后即得到第3代的胎盘间充质干细胞悬液，其中：
dmem/f12完全培养基包括10v/v％fbs和1v/v％青链霉素，余量为dmem/f12；
胎盘间充质干细胞传代方法为：待胎盘间充质干细胞达到85％融合时，用0.25wt％胰酶溶液消化细胞，dmem/f12完全培养基终止消化，轻轻吹打皿底并收集细胞，1000rpm离心5分钟，按1：2.5的比例传代；
(ⅱ)间充质干细胞诱导胰岛样细胞
(ⅱ1)取步骤(ⅰ)得到的第3代的胎盘间充质干细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞悬液浓度为2×105个/ml，加入10v/v％fbs、1v/v％青链霉素的dmem/f12完全培养基进行培养，待脂肪间充质干细胞融合至75％后，更换培养基，加入第一诱导培养基进行诱导分化，共诱导12d，其中：
第一诱导培养基含有12.5v/v％fbs、100μg/lβ-神经生长因子、12mmol/l尼克酰胺和25μg/l表皮生长因子，余量为dmem/f12；
(ⅱ2)将步骤(ⅱ1)诱导的胎盘间充质干细胞继续进行诱导，更换培养基，加入第二诱导培养基诱导培养14d，形成胰岛样细胞团，其中：
第二诱导培养基含有12.5mmol/l尼克酰胺、10μg/l碱性成纤维细胞生长因子5nmol/l活化素a和1.5v/v％胰岛素-转铁蛋白-硒，余量为dmem/f12。
上面对本发明的实施方式做了详细说明。但是本发明并不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。