一种治疗痤疮的制剂及其制备方法与流程

本发明涉及一种治疗痤疮的制剂及其制备方法，属于细胞
技术领域：
。
背景技术：
：痤疮为常见的慢性炎症性损容性皮肤病，发病机制主要涉及皮脂腺分泌皮脂增加、痤疮丙酸杆菌增殖、皮脂腺导管角化过度、炎症反应及免疫应答等方面。结节性痤疮是一种严重的痤疮，好发于面部，以炎性结节化脓为特征，常反复发作，迁延难愈，易遗留色素沉着或瘢痕，严重影响容貌及身心健康。目前治疗原则为：纠正毛囊内的异常角化；降低皮脂腺的活性；减少毛囊内的菌群，特别是痤疮丙酸菌；抗炎及预防继发感染等。常用治疗方法有：局部使用抗生素或维a酸类药物，口服抗生素或维a酸类药物，光动力疗法，果酸治疗等，但常用治疗方法均存在一定的缺陷。维a酸类药物副作用较多。外用易出现皮肤刺激反应，如局部红斑、脱屑、紧绷和烧灼感；内用易出现皮肤黏膜干燥，特别是口唇干燥。少数可引起肌肉骨骼疼痛、血升高、肝酶异常、眼睛受累、骨骺过早闭合、骨质增生、骨质疏松等，具有明确的致畸作用。抗生素类药物易诱导痤疮丙酸杆菌耐药。其不良反应有：胃肠道反应、药疹、肝损害、光敏反应、前庭受累(如头昏、眩晕)和良性颅内压增高症(如头痛等)；罕见的不良反应有狼疮样综合征，特别是应用米诺环素时。果酸治疗后局部可出现淡红斑、白霜、肿胀、刺痛、烧灼感等，可在3～5天内恢复，皮肤敏感者不能耐受。光动力疗法在治疗时有瘙痒、灼烧感、针刺感，少部分人疼痛感较明显，术后需避光48h，以免产生光毒反应；产生面部水肿性红斑，以治疗后第1天最为严重，一般3天左右可自行缓解，这期间需要局部冷敷或冷喷以减轻面部水肿型红斑现象；出现皮肤干燥、局部结痂、脱屑、暂时性的色素沉着；有极少部分患者在接受光动力治疗后可能出现反应性痤疮，即出现一过性的痤疮加重现象，常发生于口周。此前有报告使用白细胞富血小板血浆(l-prp)面部注射治疗难治性痤疮，将l-prp均匀注射于面部，每隔1.5cm取一个点，每点注射0.1ml，每隔30天重复上述操作一次，共5次为一疗程，即每个疗程5个月。但，使用l-prp面部多点注射较为疼痛，出血情况不可避免，亦有感染可能，且疗程较长。富血小板血浆对痤疮的主要致病菌座疮丙酸杆菌有良好的抑菌效果；富血小板血浆涂抹病变部位，可减轻兔耳痤疮动物模型毛囊异常角化，抑制皮脂腺增生，并且明显减轻真皮的炎症反应。目前l-prp的应用存在一定的难点，l-prp含有较多大分子物质，正常情况下不能透过健康皮肤的角质层；l-prp抗菌作用明显，虽有修复皮肤缺损的作用，但修复皮肤及皮肤屏障作用较缓慢，现有治疗方案注射l-prp一个疗程需5个月，时间太长，依从性低。因此，研发一种使用方便、不产生痛感、无感染风险，也不会造成皮肤损伤、不需要避光或恢复期，无不良反应，适合日常使用的含白细胞富血小板血浆的治疗重度结节性痤疮的复合制剂具有良好的使用前景。技术实现要素：本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种治疗痤疮的制剂及其制备方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种治疗痤疮的制剂，所述制剂包含含白细胞富血小板血浆、间充质干细胞和二甲基亚砜。作为本发明所述治疗痤疮的制剂的优选实施方式，所述制剂中每15～25ml含白细胞富血小板血浆含有0.5～2×107间充质干细胞。作为本发明所述治疗痤疮的制剂的优选实施方式，所述制剂中每20ml含白细胞富血小板血浆含有1×107间充质干细胞。作为本发明所述治疗痤疮的制剂的优选实施方式，每20ml制剂中含50～100μl二甲基亚砜。作为本发明所述治疗痤疮的制剂的优选实施方式，所述含白细胞富血小板血浆来源于脐带血。作为本发明所述治疗痤疮的制剂的优选实施方式，所述含白细胞富血小板血浆的制备方法为：将脐带血装入离心管内，离心，取上层血浆后离心，弃上层血浆，得富血小板血浆，于-20℃保存；离心分离血浆后，抽取剩余血液的上层，加入二甲基亚砜，置液氮中保存，得脐血有核细胞；复苏脐血有核细胞，加入生理盐水后离心，弃去上层，剩余细胞加入解冻的富血小板血浆，混匀，即为含白细胞富血小板血浆，其中，所述二甲基亚砜的加入体积量为剩余血液上层体积的20％。作为本发明所述治疗痤疮的制剂的优选实施方式，所述含白细胞富血小板血浆的制备方法为：(1)在超净台内将140g脐带血分装入2个50ml的离心管内，用超速离心法分离富血小板血浆(2200rmp离心13分钟，取上层血浆后3600rmp离心15分钟，弃上层血浆)，获得20ml富血小板血浆，放-20℃保存；(2)第一次离心分离血浆后，抽取剩余血液的上层，加入20％二甲基亚砜，置液氮中保存至少2日，得脐血有核细胞；(3)复苏脐血有核细胞，加入生理盐水后在800g离心力下离心6分钟，弃去上层，再加入生理盐水后在200g离心力下离心10分钟，弃去上层，剩余细胞加入解冻的富血小板血浆，混匀，即为含白细胞富血小板血浆。制备过程中，通过控制生理盐水的使用量和使用次数，达到留取微量二甲基亚砜和低分子右旋糖酐的目的。作为本发明所述治疗痤疮的制剂的优选实施方式，所述间充质干细胞是从脐带分离出来的。作为本发明所述治疗痤疮的制剂的优选实施方式，所述间充质干细胞的制备方法为：将脐带消毒、清洗、剪成小段，放入离心管中，加入培养基，将其剪成碎块，再加入培养基，混匀后放入培养瓶中；将培养瓶放入培养箱中培养，定时更换新鲜培养基，当超过半数培养瓶中的细胞达到80％密度时，细胞进行传代；细胞培养至第四代出库使用，加入胰酶，用细胞上清液终止消化，倒入离心管中，离心，弃上清，加入生理盐水，将细胞完全吹散后离心，弃上清，即得间充质干细胞。作为本发明所述治疗痤疮的制剂的优选实施方式，所述间充质干细胞的制备方法为：(1)将脐带消毒、清洗后，将脐带剪成0.5cm长短的小段，放入50ml离心管中，加入培养基，用剪刀将其剪成碎块，再加入培养基，混匀后平均放入6个培养瓶中；(2)将培养瓶放入培养箱中37℃、5％co2培养，定时更换新鲜培养基，当超过半数培养瓶中的细胞都已经达到80％密度时，细胞可以传代；(3)细胞培养至第四代即可出库使用，加入胰酶，使细胞完全脱落，再利用细胞上清液终止消化，倒入离心管中，600g、4min离心，20℃离心完成后弃上清，加入10ml生理盐水，将细胞完全吹散后600g、4min离心，离心完成后弃上清，即得间充质干细胞。本发明还提供了上述治疗痤疮的制剂的制备方法，包含以下步骤：向含白细胞富血小板血浆中加入间充质干细胞，充分混合均匀，即得治疗痤疮的制剂。本发明治疗痤疮的制剂的使用方法为：患者洁面后，用无菌棉签蘸取制剂涂于痤疮及附近皮肤上，每日2次，每次用1.5ml，持续至少一个月经周期。本发明治疗痤疮的制剂外涂至少应使用一个月经周期：(1)通常严重的痤疮发病规律与月经周期有关，故应使用一个月经周期，使含白细胞富血小板血浆和间充质干细胞的混合制剂中的有效成分在痤疮最严重的时候充分进入皮肤进行修复，并在之后坚持使用补充修复皮损，建立皮肤屏障；(2)皮肤表皮层更新时间约为28天，坚持使用一个月经周期有助于皮肤长出新的、健康的角质层。与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)本发明治疗痤疮的制剂结合含白细胞富血小板血浆与间充质干细胞，使用方便、不产生痛感、无感染风险，也不会造成皮肤损伤、不需要避光或恢复期，无不良反应，适合日常使用，加快皮肤修复，缩短治疗周期，修复皮肤屏障，减少痤疮复发可能；制剂内含微量二甲基亚砜，增加皮肤通透性，使大分子有效成分更容易进入皮肤，修复皮损。(2)本发明含白细胞富血小板血浆的制备中冻存脐血有核细胞时，使用二甲基亚砜作为冷冻保护剂，制备时通过控制生理盐水的使用量和使用次数，使微量二甲基亚砜残留在细胞内；二甲基亚砜同时为皮肤渗透剂，能将溶于其中的其它药物通过皮肤涂抹渗入体内，代替口服或注射，因此，产品中含有微量的二甲基亚砜能促进制剂中有效成分被皮肤吸收。附图说明图1为效果例2中案例1的患者使用本发明制剂的面部治疗效果图。具体实施方式为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。本发明实施例中，含白细胞富血小板血浆制备中所使用的脐带血来源为健康人24h内的新鲜脐带血。脐带血的供者筛选依照如下标准：采集脐血前将由产妇填写《脐带血采集信息表》中的《孕妇健康调查表》部分，获取准确的产妇健康情况，以及其和家人的疾病史。相关病史应在脐血采集前获得，最迟不得晚于采集后7天。若病史获得早于脐血采集前7天，则需在脐血采集时再次确认母亲的疾病和健康史有无变化。供者入选标准：(1)产妇年龄≥18周岁，孕期≥34周；(2)新生儿无先天性感染和先天性畸形；(3)胎盘无脓肿、无炎症；(4)产妇产前24h内未使用抗生素；(5)获取产妇签证确认的《脐带血采集知情同意书》。供者排除标准：(1)产妇和配偶是近亲；(2)双胞胎或多胞胎者，不可捐献脐带血；(3)产妇患有严重疾病，如癌症、血液病、遗传性疾病、血液感染(败血症)，包括但不限于白血病、淋巴瘤、范可尼贫血、镰状细胞贫血、地中海贫血、g6pd缺乏症、血友病、慢性肉芽肿病等；(4)曾经具有hbv、hcv、hiv、梅毒等感染的既往史，或12个月内与上述感染者有过密切接触，或产前化验检查hbsag、hcv抗体、hiv抗体、梅毒阳性者；(5)产妇被诊断患有南美洲锥虫病、结核病，或12个月内被西尼罗病毒感染，或三年内患过疟疾，或12个月内访问或居住过疟疾流行区；(6)产妇曾静脉注射未经医生允许使用的毒品；(7)产妇12个月内与易感染人类免疫缺陷病毒的高危人群，如吸毒史者、同性恋者、多个性伴侣者有过密切接触；(8)产妇12个月内接受过心、肺、肾、骨髓或其它器官或组织移植；(9)产妇12个月内进行过纹身；(10)产妇12个月内因为梅毒或淋病接受治疗或梅毒检测阳性者；(11)产妇12个月内输注过乙型肝炎免疫球蛋白或接种过活病毒疫苗，或接种过天花疫苗并出现皮疹、皮肤溃疡等症状；(12)产妇12个月内被动物咬伤和注射过狂犬病疫苗；(13)产妇12个月内接受过异体的血液输注；(14)从1980年到1996年，在英联邦国家累计停留3个月及以上，或从1980年至今，累计在欧洲停留5年及以上；(15)产妇配偶、子女或家族成员患有恶性肿瘤、遗传性疾病(包括遗传性血液病)；(16)产妇及家族成员被诊断患有克雅氏病，或其它人类传染性海绵状脑病。本发明实施例中，间充质干细胞制备中所使用的脐带来源为：18～35周岁孕妇，母婴无并发症，健康调查表各项指标正常，胎儿父母无遗传性疾病，孕期各项检查指标正常(谷丙转氨酶alt、谷草转氨酶ast；巨细胞病毒cmv；艾滋病毒hiv；梅毒tp；乙肝病毒表面抗原hbsag；丙肝病毒抗体hcv；地贫；g6pd)。实施例1本发明治疗痤疮的制剂的一种实施例，所述制剂包含含白细胞富血小板血浆、间充质干细胞和二甲基亚砜，本实施例中每15ml含白细胞富血小板血浆含有2×107间充质干细胞。本实施例所述制剂的制备方法为：(1)含白细胞富血小板血浆的制备方法为：在超净台内将140g脐带血分装入2个50ml的离心管内，用超速离心法分离富血小板血浆(2200rmp离心13分钟，取上层血浆后3600rmp离心15分钟，弃上层血浆)，获得20ml富血小板血浆，放-20℃保存；第一次离心分离血浆后，抽取剩余血液的上层10ml，加入二甲基亚砜(体积为剩余血液上层体积的20％)，置液氮中保存至少2日，得脐血有核细胞；复苏脐血有核细胞，加入生理盐水后在800g离心力下离心6分钟，弃去上层，再加入生理盐水后在200g离心力下离心10分钟，弃去上层，剩余细胞加入解冻的富血小板血浆，混匀，即为含白细胞富血小板血浆；(2)间充质干细胞的制备方法为：将脐带消毒、清洗后，将脐带剪成0.5cm长短的小段，放入50ml离心管中，加入培养基，用剪刀将其剪成碎块，再加入培养基，混匀后平均放入6个培养瓶中；将培养瓶放入培养箱中37℃、5％co2培养，定时更换新鲜培养基，当超过半数培养瓶中的细胞都已经达到80％密度时，细胞可以传代；细胞培养至第四代即可出库使用，加入胰酶，使细胞完全脱落，再利用细胞上清液终止消化，倒入离心管中，600g、4min离心，20℃离心完成后弃上清，加入10ml生理盐水，将细胞完全吹散后600g、4min离心，离心完成后弃上清，即得间充质干细胞；(3)向含白细胞富血小板血浆中加入间充质干细胞，充分混合均匀，即得治疗痤疮的制剂。实施例2本发明治疗痤疮的制剂的一种实施例，所述制剂包含含白细胞富血小板血浆、间充质干细胞和二甲基亚砜，本实施例中每25ml含白细胞富血小板血浆含有0.5×107间充质干细胞。本实施例所述制剂的制备方法同实施例1。实施例3本发明治疗痤疮的制剂的一种实施例，所述制剂包含含白细胞富血小板血浆、间充质干细胞和二甲基亚砜，本实施例中每20ml含白细胞富血小板血浆含有1×107间充质干细胞。本实施例所述制剂的制备方法同实施例1。效果例1本发明实施例1～3的治疗效果试验选取轻、中、重度面部痤疮志愿者共30名；在涂抹制剂前2周，未使用过糖皮质类激素、维a酸类和抗生素类药物，无高血脂及肝肾功能异常，避免强烈阳光或紫外线过度照射。将30名志愿者随机分为3组，每组10人，分别使用实施例1～3的制剂。志愿者洁面后，用无菌棉签蘸取制剂涂于痤疮及附近皮肤上，每日2次，每次用1.5ml，持续至少一个月经周期，使用期间停用其他药物或化妆品，一个月经周期后判定疗效。分别对志愿者判定疗效，结果如表1所示。判定标准：痊愈：症状完全消失，主要理化检查指标正常；有效：主要症状消失，病变面积变小，主要理化指标有所改善；无效：与治疗前相比，各方面均无改善；有效率＝(痊愈例数+有效例数)/全部例数×100％。表1痊愈(例数)有效(例数)无效(例数)有效率(％)实施例152370％实施例252370％实施例372190％由表1可知，本发明的制剂治疗痤疮的有效率高。且在治疗过程中，使用方便、不产生痛感、无感染风险，也不会造成皮肤损伤、不需要避光或恢复期，无不良反应，适合日常使用，加快皮肤修复，缩短治疗周期，修复皮肤屏障，减少痤疮复发可能。当本发明制剂每20ml含白细胞富血小板血浆含有1×107间充质干细胞时，具有最佳的疗效。效果例2本发明治疗痤疮的制剂的具体案例案例1患者女，22岁，面部严重结节性痤疮5年，加重半年。每逢月经来潮则新发带脓痤疮，未完全消退下一次月经时又有新发，面部凹凸不平，痘坑与痤疮结节布满整个面部。该案例患者使用本发明制剂后，面部治疗效果如图1所示。使用本发明制剂15天后，患者痤疮、结节较前消退，皮损颜色变暗；使用35天后，患者第二次月经时新出带脓痤疮数量减少约40％；使用66天后，患者第三次月经时新发化脓痤疮数量减少约70％。案例2患者女，23岁，20岁以后面部患有痤疮，逐渐严重，寻医治疗多年无显著疗效，经涂敷本发明的制剂一个月经周期后，面部暗疮症状减轻，连续使用三个月经周期，面部暗疮全部消失，随访6个月无反弹。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页12