丹叶大黄素在制备治疗脓毒症药物中的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，特别涉及丹叶大黄素在制备治疗脓毒症药物中的应用。

背景技术：

脓毒症作为重症医学科病死率最高的病种之一，全球每年约有两千万患者罹患脓毒症，其中约百分之五十患者还可能合并脓毒症休克。虽然近十年来，对脓毒症的诊断及治疗研究取得了明显的进展，但仍然约有26%的患者死于脓毒症。因此，本领域迫切需要寻找新的诊疗方法。

巨噬细胞作为机体重要的免疫效应细胞，在脓毒症的发生发展中具有重要的作用，其在过度炎症反应时分泌的大量炎症因子可加重脓毒症，导致不良结局。细胞色素p4501a1（cyp1a1）作为一种羟化酶，主要存在于肝脏，肠道及肺脏当中，可催化代谢多种内外源型物质。目前有研究表明，cyp1a1与支原体感染，肺部氧化应激损伤及空气污染中的细颗粒物代谢有关，但其与脓毒症的关系仍不明确。有研究指出，在脂多糖或者脓毒症打击时，小鼠体内多个脏器及巨噬细胞中cyp1a1均高表达，提示可能将cyp1a1作为干预脓毒症进程的靶点。

丹叶大黄素(rhapontigenin)作为cyp1a1的特异性抑制剂，其结构与白藜芦醇有一定的相似性，可抑制前列腺癌细胞，但目前尚无临床应用。有研究报道，丹叶大黄素可明显降低脂多糖诱导的j774巨噬细胞所分泌的白介素6及一氧化氮水平，提示丹叶大黄素在体外对巨噬细胞有一定的抗炎效应，但其在体内的调控效应，尤其对脓毒症的保护效应仍然未知。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种新的治疗脓毒症药物的药物，具体是丹叶大黄素在制备治疗脓毒症药物中的应用。

所述药物通过抑制cyp1a1的表达降低脓毒症的死亡率。

所述药物以注射剂给药

所述丹叶大黄素在药物中的浓度为5毫克每千克体重～10毫克每千克体重。

进一步的技术方案是所述丹叶大黄素在药物中的浓度为5毫克每千克体重或10毫克每千克体重。

丹叶大黄素分子量:258.27g/mol，分子式:c15h14o4，分子结构式：

本发明利用大肠杆菌(e.coli)及盲肠穿刺结扎术（clp）诱导的脓毒症模型，腹腔注射丹叶大黄素药剂，筛选出了可降低小鼠脓毒症死亡率的丹叶大黄素剂量。通过观察小鼠生存率，检测其腹腔灌洗中肿瘤坏死因子α和白介素6水平，检测其外周血清中丙氨酸转移酶(alt)及谷草转氨酶(ast)水平。实验结果表明，5毫克每千克体重～10毫克每千克体重剂量的丹叶大黄素可有效降低脓毒症小鼠死亡率，降低脓毒症小鼠腹腔灌洗液中肿瘤坏死因子α和白介素6及外周血中alt和ast水平。

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为本发明的限制。

附图说明

图1为丹叶大黄素对e.coli诱导的脓毒症的生存保护；

图2为丹叶大黄素对clp诱导的脓毒症的生存保护；

图3为丹叶大黄素对e.coli打击后，小鼠腹腔灌洗液中肿瘤坏死因子α和白介素6及外周血中alt和ast的影响；

图4为丹叶大黄素对clp打击后，小鼠腹腔灌洗液中肿瘤坏死因子α和白介素6及外周血中alt和ast的影响。

具体实施方式

本发明使用的丹叶大黄素粉末购自美国西格玛(sigma)公司,货号为phl83903。丹叶大黄素溶液配制方法（以10毫克每千克体重剂量为例，其他剂量配法相似）：用125微升dmso溶解5毫克纯丹叶大黄素粉末并充分混匀，取80微升混匀后液体加入1.52毫升胎牛血清中充分混匀，再加入14.4毫升1640培养基充分混匀，得到浓度为0.2毫克每毫升的储备液，对每只小鼠（20克）取1毫升储备液于腹腔注射。

对照液配制除不含丹叶大黄素粉末外，其他同上。

实施例1丹叶大黄素对两种脓毒症模型的生存保护

将80只雄性c57bl/6小鼠分为四组，每组20只。其中药物治疗组为三组，对照组为一组。

大肠杆菌（e.coli）诱导的脓毒症模型：

药物治疗组分为三种丹叶大黄素不同剂量组：2.5毫克每千克体重、5毫克每千克体重及10毫克每千克体重。药物治疗组每组按上述剂量分别腹腔注射丹叶大黄素溶液，对照组腹腔注射等量对照液。注射完毕后，马上对每只小鼠腹腔注射大肠杆菌（3x10¹⁰cfus每千克体重）及等量对照液。造模后按每小时观察一次对小鼠生存情况进行观察。

盲肠穿刺结扎术（clp）诱导的脓毒症模型：

分组及给药量同e.coli诱导的脓毒症实施例，按照文献描述的clp造模标准方法(参考文献pubmedid:28850247)进行造模，对照组只开腹不穿刺结扎盲肠。造模后马上腹腔注射丹叶大黄素溶液，按每小时观察一次对小鼠生存情况进行观察。

结果表明，本研究使用的丹叶大黄素剂量为5毫克每千克体重及10毫克每千克体重时对脓毒症小鼠有明显的生存保护作用，可有效降低小鼠死亡率。参见图1和图2（*,p值小于0.05；ns，p值大于0.05）

实施例2丹叶大黄素对两种脓毒症模型小鼠腹腔灌洗液中肿瘤坏死因子α和白介素6及外周血中alt和ast的影响。

e.coli诱导的脓毒症模型和clp诱导的脓毒症模型的建立及对照液使用均同实施例1，丹叶大黄素剂量为10毫克每千克体重。每组小鼠为3只雄性c57bl/6小鼠，每只重约20克。给药后8小时眼球放血法处死小鼠，并收集每只小鼠眼球血约1毫升，于室温下静置半小时后，以300g，五分钟参数下离心，取100微升上清，检测alt及ast水平。放血后立即用5毫升冷无菌生理盐水冲洗小鼠腹腔，取出腹腔灌洗液后于300g，五分钟参数下离心，取1毫升上清用于elisa检测其中肿瘤坏死因子α和白介素6。

结果表明，本发明使用的丹叶大黄素剂量（5毫克每千克体重及10毫克每千克体重）可有效降低腹腔灌洗中肿瘤坏死因子α和白介素6水平及外周血中alt和ast水平。参见图3，图4（*,p值小于0.05）。

结论：通过上述实施例，我们初步证实丹叶大黄素在5毫克每千克体重及10毫克每千克体重剂量时对脓毒症小鼠具有明显的保护效应，可显著降低脓毒症小鼠死亡率，降低脓毒症小鼠腹腔灌洗液中肿瘤坏死因子α和白介素6水平及外周血中alt和ast水平。这为今后丹叶大黄素在制备治疗脓毒症药物中的应用奠定了基础。

技术特征：

技术总结
本发明属于医药技术领域，特别涉及丹叶大黄素在制备治疗脓毒症药物中的应用。本发明利用大肠杆菌(E.coli)及盲肠穿刺结扎术（CLP）诱导的脓毒症模型，注射丹叶大黄素药剂，筛选出了可降低脓毒症死亡率的丹叶大黄素剂量。实验结果表明，5毫克每千克体重～10毫克每千克体重剂量的丹叶大黄素可有效降低脓毒症小鼠死亡率，降低脓毒症小鼠腹腔灌洗液中肿瘤坏死因子α和白介素6及外周血中ALT和AST水平。

技术研发人员：田李星;罗莉;杨雪;唐婉琦;梁华平
受保护的技术使用者：中国人民解放军陆军特色医学中心
技术研发日：2019.03.07
技术公布日：2019.05.10