一种用于促进雄激素睾酮的姜黄素类成份的提取物方法及应用与流程

本发明属于医药技术领域，更具体涉及一种用于促进雄激素睾酮的姜黄素类成份的提取物方法，同时还涉及一种姜黄素类成份的提取物的用途，它适用于雄激素睾酮合成相关细胞模型及肾阳虚动物模型，对雄激素睾酮的促进作用及壮阳。

背景技术：

雄激素主要是由睾丸内的睾丸间质细胞合成和分泌的，天然的雄激素就是睾酮，具有雄激素活性，其在促进胚胎期生殖器官的发育、男性第二性征的发育和维持、精子发生、激发性欲以及性功能维持、心血管系统保护、骨量维持等方面具有重要作用。随着身体年龄增长，体内睾酮水平逐渐降低，由此可引起肥胖、ⅱ型糖尿病、心血管病证、代谢紊乱、骨骼肌肉质量下降、性功能减退、情绪抑郁低落和认知障碍等不良反应。睾酮属于类固醇激素，因此临床以前常补给激素药物如美雄酮制剂、司坦等替代睾酮以调节体内雄激素缺乏症，但是这类药物常带有严重副作用。随着研究发现，在正常生理状态下，体内的雄激素和雌激素水平常保持着动态平衡，两者还可以互相转化，因此目前常寻求具有类雌激素或雄激素相关活性的中药及成分以调节体内的雄/雌激素水平。

睾酮的合成、分泌受下丘脑-垂体-性腺轴的控制，在生理状态下，下丘脑能够释放促性腺激素释放激素刺激垂体分泌黄体生成素(lh)和卵泡刺激素(lsh)。lh与细胞相关受体作用参与雄激素睾酮合成与分泌，而卵泡刺激素则影响精细胞的产生。一方面当lh与leydig细胞上的雄激素受体(ar)结合，活化腺苷酸环化酶，加速环磷腺苷(camp)的生成，并通过蛋白激酶a(pka)的对camp元件蛋白(creb)磷酸化作用，从而促进类固醇急性调节蛋白(star)调控胆固醇转移至线粒体内膜中，然后胆固醇经历一系列酶如细胞色素p450家族(p450scc及p450c17)和羟基固醇脱氢酶(3β-hsd、17β-hsd)的作用，转化为活性睾酮，这便是传统的camp-pka信号途径。

姜黄素是一种酚性色素，在姜科植物姜黄、郁金、莪术和天南星科菖蒲中广泛存在。姜黄，味辛、温，具有破血行气、通经止痛的功用。传统中医多用于闭经，跌打肿痛，风湿肩臂疼痛等疾病。在《本草拾遗》中注有：姜黄，性热不冷，因姜黄辛温发散之功，一些温肾助阳复方如永春液、温阳汤的常用姜黄以增功效。姜黄素作为姜黄主要成分，其不溶于水，易溶于乙醇，安全性高，具有广泛的药理活性，可用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、炎症、肝硬化、慢性疾病等多种病症，而且其作为一种天然抗癌新药，被美国国立肿瘤研究所列为第三代癌化学预防药。据报道，姜黄素可以对雄激素依赖性、非依赖性的前列腺癌细胞株均有抑制增殖、诱导癌细胞凋亡的作用；同时还发挥抗睾丸生殖细胞凋亡、下调多囊卵巢综合征大鼠雄激素水平的作用。这些研究均表明姜黄及其成分姜黄素可能与雄激素具有一定关系，但具体对雄激素的作用以及可能的作用机制均没有详细报道。同时姜黄素稳定性差，生物利用度低，为提高其稳定性和生物利用度，人们常将其制成姜黄素衍生物、脂质体、胶束、水溶性制剂等使用。本发明目的是证实姜黄素类成分及其中药提取物能够促进雄激素合成，并且与睾丸间质细胞camp-pka信号通路中睾酮相关基因、蛋白表达有关联，同时姜黄素类成分及其中药提取物还表现出一定壮阳作用。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供了一种用于促进雄激素睾酮的姜黄素类成份的中药提取物方法，方法易行，操作简便，易于大规模生产，该提取方法以姜黄素类化合物及姜黄、郁金、莪术、菖蒲等含姜黄素类成分的植物为原料，原料资源丰富，该提取物药食两用，并且服用方便可作为食品添加剂。

本发明的另一个目的是在于提供了一种姜黄素类成分的提取物在制备治疗或预防雄激素合成和壮阳药物中的应用。该类成分及提取物可促进睾丸间质细胞分泌睾酮，调节camp-pka信号途径促进睾酮合成，并对肾阳虚小鼠具有明显的壮阳作用，体内标本同治，疗效优越，长期服用无明显毒副作用。

为了实现上述的目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种用于促进雄激素睾酮的姜黄素类成份，其主要成分包括姜黄素、脱甲氧基姜黄素、双脱甲氧基姜黄素等，以及该类成分制成的改善分散度和溶解能力的剂型。随老龄化加剧，中老年体内雄激素水平急剧降低，通过睾丸间质细胞和肾阳虚动物模型，本发明所述的姜黄素、水溶性姜黄素(环糊精包合物)及中药提取物等均可以上调camp-pka中关键蛋白表达进而促进雄激素睾酮合成，并且可以有效改善阳虚动物的脏器系数，提高雄激素的合成及交配能力，显示其均有一定的壮阳作用。对比姜黄素及提取物，本发明证明的水溶性姜黄素具有较好的促进雄激素合成和壮阳的效果，此外姜黄素还具有一定雄激素受体拮抗活性，说明姜黄素对雄激素合成具有双向调控作用。

一种用于促进雄激素睾酮的姜黄素类成份的中药提取物方法，其步骤是：

a、称取50g干燥的含姜黄类中药粉碎至20目，用80％(体积比)乙醇进行加热回流提取，收集提取液，回收乙醇，得到浓缩原液100ml；

b、浓缩原液用石油醚萃取两次，每次200ml，分离石油醚层，保留水相；

c、收集步骤b水相，挥去水分，得到一种具有促进雄激素睾酮的含姜黄类成分的中药总提取物；

d、将步骤c得到的总提取物，加甲醇稍稀释使之溶解，用硅胶g柱层析分离纯化，用蒸馏水、甲醇溶液冲洗，收集洗脱液，过滤，挥干溶剂，得到一种具有促进雄激素睾酮的含姜黄类成分的纯化后提取物。

所述的步骤a中的含姜黄类中药为姜黄、莪术、郁金、菖蒲中任一种。

所述的步骤b中的加热回流的条件为65～85℃进行。

所述的步骤d中的醇溶液在甲醇溶液或乙醇溶液任一种；

所述的乙醇溶液的浓度为体积百分比为50～80％；

所述的甲醇溶液的浓度为体积百分比为50～80％；

所述的洗脱液洗脱体积为10-20倍柱体积。

该发明提供了一种含姜黄素类中药提取物的提取纯化方法，通过乙醇提取后去除油脂类成分得到总提取物，总提取物过硅胶柱后得到纯提取物，该提取方法简单，健康环保无污染，易于大规模生产，尽可能去除无用成分，有效成分纯度高。该提取方法以姜黄素类化合物及姜黄、郁金、莪术、菖蒲等含姜黄素类成分的植物为原料，原料资源丰富，该提取物药食两用，并且服用方便可作为食品添加剂。

以姜黄素、水溶性姜黄素为活性成分，而中药提取物如姜黄提取物，为乙醇提取，石油醚脱脂后所得，包括姜黄素、去甲氧基姜黄素等。

一种用于促进雄激素睾酮的姜黄素类成份及提取物的应用，实验证明姜黄素类成分及提取物具有补肾壮阳、促进睾酮合成、调节体内代谢的作用，同时该类成分具有雄激素拮抗活性，对前列腺癌等疾病具有治疗作用。该发明针对于市面上西药西地那非或酚妥拉明疗效期短，长期服用具有一定副作用，治标不治本，并产生患者依赖的影响，本发明利用的中药具有双向调节作用，对肾阳虚小鼠具有明显的壮阳作用，促进体内雄激素合成和分泌而具有壮阳作用，而对前列腺癌等的雄激素分泌过多具有拮抗作用，并标本同治，疗效优越，长期服用无明显毒副作用。

本发明与现有技术的进步是：本发明利用的中药由天然药物组成，具有双向调节作用，对阳虚小鼠具有壮阳作用，对前列腺癌具有治疗作用，长期服用无明显毒副作用。同时，采用服用中药提取物或者改善剂量给药体内吸收利用度高。

本技术方案与现有技术的主要区别是：

一种具有促进雄激素合成活性的姜黄素类成分的中药提取物在制备治疗或预防雄激素合成和壮阳药物中的应用，其步骤是：

1、睾丸间质细胞睾酮分泌的影响；

2、对睾酮合成信号通路的影响；

3、转基因酵母细胞雌/雄激素的影响；

4、阳虚小鼠交配能力和睾酮分泌的影响；

通过上述实验，本发明治疗组效果显著，对阳虚模型及正常动物皆有效果。具有壮阳，促进睾酮合成、调节体内代谢的作用。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

(1)以含姜黄素类成分的植物为原料，原料资源丰富，该提取物药食两用，并且服用方便可作为食品添加剂。

(2)通过乙醇提取后去除油脂类成分得到总提取物，总提取物过硅胶柱后得到纯提取物，该提取方法简单，健康环保无污染，易于大规模生产，尽可能去除无用成分，有效成分纯度高。

(3)姜黄素类成分及提取物具有补肾壮阳、促进睾酮合成、调节体内代谢的作用。

(4)姜黄素类成分的激素活性表现为雄激素拮抗活性。

(5)姜黄素类成分及提取物对体内激素具有双向调节作用，一方面促进睾丸间质细胞分泌睾酮而具有壮阳作用，另一方面对体内雄激素分泌过多具有拮抗作用。

(6)姜黄素类成分及提取物药效好，毒性低，副作用小，可作为壮阳的备选功能食品或药品。

附图说明

图1a、b一种姜黄提取物对睾丸间质细胞中star、3β-hsd、nr5a1蛋白的表达的影响示意图。

注：相对空白control组，*p<0.05，**p<0.01。结果显示5μg/ml的姜黄提取物可以显著提高star、3β-hsd、nr5a1蛋白的表达(p<0.05)。

图1c、d为一种姜黄素对睾丸间质细胞中star、3β-hsd、nr5a1蛋白的表达的影响示意图。

注：相对空白control组，*p<0.05，**p<0.01。结果显示5μm的姜黄素可以显著提高star、3β-hsd、nr5a1蛋白的表达(p<0.05)。

图2为一种姜黄素对转基因酵母细胞雄激素拮抗活性。

结果显示姜黄素具有雄激素拮抗活性。

图3为一种姜黄提取物及姜黄素对肾阳虚小鼠血清睾酮含量的影响示意图。注：与模型组比，*p<0.05；**p<0.01。结果显示姜黄提取物和姜黄素的各剂量组阳虚小鼠血清中睾酮浓度均比正常组高，甚至优于阳性组，表明姜黄提取物和姜黄素能够提高阳虚小鼠雄激素睾酮的分泌量。

具体实施方式

实施例1：

一种用于促进雄激素睾酮的中药提取物方法，其步骤是：

a、称取50g干燥的含姜黄类中药粉碎至20目，用80％乙醇进行加热回流提取，收集提取液，回收乙醇，得到浓缩原液100ml；

b、浓缩原液用石油醚萃取两次，每次200ml，分离石油醚层，保留水相；

c、收集步骤b水相烘干，得到一种具有促进雄激素睾酮的含姜黄类成分的中药总提取物；

d、将步骤c得到的总提取物，加甲醇稍稀释、溶解，用硅胶g柱层析分离纯化，用蒸馏水、甲醇溶液冲洗，收集洗脱液，过滤，挥干溶剂，得到一种具有促进雄激素睾酮的含姜黄类成分的纯化后提取物。

所述的步骤a中的含姜黄类中药为姜黄、莪术、郁金、菖蒲中任一种。

所述的步骤b中的加热回流的条件为65～85℃进行。

所述的步骤d中的醇溶液在甲醇溶液或乙醇溶液任一种；

所述的乙醇溶液的浓度为体积百分比为50～80％；

所述的甲醇溶液的浓度为体积百分比为50～80％；

所述的洗脱液洗脱体积为10-20倍柱体积。

通过上述的技术措施，获得的一种用于促进雄激素睾酮的姜黄素类成份提取物，其主要成分包括姜黄素、脱甲氧基姜黄素、双脱甲氧基姜黄。

通过上述的技术措施，获得的一种用于筛选促进雄激素睾酮的姜黄素类成份提取物，其主要成分为以姜黄素制成的环糊精包合物、脂质体包合物以及其它水溶性制剂。

实施例2：

一种具有促进雄激素合成活性的姜黄素类成分的中药提取物在制备治疗或预防雄激素合成和壮阳药物中的应用，其使用过程是：

姜黄素和姜黄提取物对睾丸间质细胞睾酮分泌的影响以及对睾酮合成信号通路的影响。

1、实验材料

dme/f-12培养基(hyclone公司)；mtt(美国sigma)；胶原酶i(invitrogen公司)；percoll分离液、nbt(biosharp生物科技)；dhea、β-nad(上海麦克林)，睾酮酶联免疫试剂盒(南京建成生物工程研究)；人绒毛膜促性腺激素hcg(中国食品药品检定研究院)；sd雄性大鼠购于湖北省实验动物研究中心。

2、细胞分离与培养

取大鼠睾丸组织，用pbs浸洗后剪碎，加入胶原酶i使其含量约0.05％，于37℃水浴恒温振荡器(120r/min)消化15min，随后加入dmem-f12培养液(含9％v/v胎牛血清、1％v/v马血清)终止消化，然后用70μm尼龙滤网过滤，置4℃，230g离心机内离心10min，用培养基洗涤细胞两次，弃上清，细胞沉淀由2ml培养基重悬。将重悬细胞加到预制的percoll浓度梯度离心液上(梯度至上而下为5％,30％,58％,70％，每个梯度各2ml)，4℃800g，离心30min后，用吸管小心吸取第二条条带，并加完全培养基1000rpm离心洗涤两次，每次5min，取细胞沉淀。再加入适量完全培养液接种到细胞瓶内，于37℃，5％co2培养箱内培养，得最终贴壁生长的为睾丸间质细胞。

3、elisa法测定睾酮含量

收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度3×104个/ml，以每孔300μl接种于24孔培养板，置培养箱中培养24h后，设置空白组，阳性组(hcg)和给药组。给药组均包括4个浓度梯度剂量组，每组均3个复孔。待细胞单层铺满孔底，各组更换270μl新鲜培养液，阳性对照组加入的hcg终浓度为3iu/ml；给药组加入不同浓度的姜黄素或姜黄提取物，空白组加入等量0.1％dmso作为对照。培养箱培养24h。向预先包被抗体的elisa酶标孔中加入样本，利用elisa睾酮测试试剂盒检测样本中睾酮含量。

4、蛋白印迹(westernblot)试验：应用常规蛋白提纯方法提取细胞总蛋白。设定蛋白量为50μg以gapdh为内参，加入一抗(star、3β-hsd1、nr5a1兔抗大鼠单克隆抗体)和二抗羊抗兔，应用ecl化学发光试剂盒进行显色。

5、实验结果与分析

如表1所示，姜黄提取物和姜黄素可促进睾丸间质细胞分泌睾酮。如附图1所示，姜黄提取物和姜黄素可促进camp-pka信号途径中star、3β-hsd1、nr5a1等蛋白的表达。

表1姜黄素及姜黄提取物对睾丸间质细胞睾酮分泌的影响

注：**与空白组比较p<0.01；*与空白组比较p<0.05。

实施例3：

一种具有促进雄激素合成活性的姜黄素类成分的中药提取物在制备治疗或预防雄激素合成和壮阳药物中的应用，其使用过程是：

1、实验材料

xenoscreenyesstrain菌株(no5-230-e)和xenoscreenyasstrain(no5-230-a)菌株购于瑞士xenometrix公司。xenoscreenyes/yasculturemaintenanceset、xenoscreenxl4samplekitwithoutcells-348measuringp试剂盒，瑞士xenometrix公司。

2、实验方法

将雌激素菌株(yes)、雄激素菌株(yas)培养于试剂盒提供的培养液中，测试前24h，将获得的浑浊培养液按1：10稀释。然后取四块96孔板，分别标记yes、yas激动板；yes、yas拮抗板。具体测试方法参考试剂盒说明书进行。

3、实验结果

结果表明雌/雄激素激动板β-半乳糖苷酶的活性没有明显变化，显示姜黄素无明显的雌/雄激素激动活性，但是在雄激素拮抗板中，β-半乳糖苷酶的活性明显高于阳性对照药-氟他胺(fl，拮抗雄激素与ar受体结合药物)，显示具有一定的雄激素拮抗活性。附图2显示姜黄素对雄激素受体的拮抗活性结果。

实施例4：

一种具有促进雄激素合成活性的姜黄素类成分的中药提取物在制备治疗或预防雄激素合成和壮阳药物中的应用，其使用过程是：

1、实验动物

雌、雄昆明小鼠，体重18-22g，雌、雄sd大鼠，体重180-220g，购于湖北省实验动物研究中心。

2、阳虚小鼠交配能力的影响

雄性昆明小鼠，随机分成9组，每组动物10只，分别为正常组(模型组、阳性对照组(金匮肾气丸，1.3g/kg)、水溶性姜黄素和姜黄提取物低、中、高剂量组。空白组和模型组灌胃生理盐水，阳性组和给药组连续灌胃给药30天。从给药第四天开始，除正常组外，其余组皮下注射氢化可的松25mg/kg，每日1次，连续7天，造模同时给药。雌鼠与交配前48h、4h灌胃戊酸雌二醇(0.4mg/kg)，使之发情时间同步。灌胃1h后观察30min内小鼠交配能力(捕捉潜伏期、捕捉次数、交配潜伏期、交配次数)。

3、实验结果

如表2所示，相对于模型组，姜黄素及姜黄提取物可缩短小鼠捕捉潜伏期和交配潜伏期，提高捕捉次数和交配次数，并且促进睾酮分泌(附图3)。

说明本发明姜黄素类成分和相关中药提取物如姜黄提取物可以明显促进阳虚小鼠性腺脏器系数，提高血清睾酮的含量，同时促进其交配能力即具有壮阳的作用。

表2姜黄素和姜黄提取物对肾阳虚小鼠交配能力的影响

注：**与空白组比较p<0.01；*与空白组比较p<0.05。