一种利用红曲色素组份及其衍生物制备的抗癌制剂的制作方法

本发明属于药物开发领域，其具体涉及一种利用红曲色素组份及其衍生物制备的抗癌制剂。

背景技术：

癌症是长期困扰医学界的疑难病症，又称为恶性肿瘤，是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的体细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的恶性增生物，仅次于心血管病为人类第二高死亡率的疾病，严重威胁着人们的健康与生命。寻找和研发具有抗癌活性的天然化合物及其制剂，已成为抗癌药物研发的重要工作。

药剂学中将纳米粒的粒径界定在1~1000nm，纳米级药物载体是目前研究的热点。通常，纳米级载体能够将药物颗粒缩小到纳米级水平，增加药物与肠胃道液体的有效接触面积，加快药物的溶出率。纳米粒是一类具有开发潜力的新型药物载体，以纳米粒作为载体克服了传统药物的许多缺陷和无法解决的问题。纳米粒作为新型载体，具有无免疫原性、细胞毒性等优势，因此广泛应用于抗肿瘤药物中。纳米药物还具有增加药物穿透能力、增加药物的稳定性、控制体内释放、增强药物靶向性和改善药物口服利用度等优点。

红曲霉是一种多功能的微生物，广泛用于食品和药品中，其发现和应用已有2000多年的历史。本课题组之前申请的发明专利（zl201010145501.0）介绍了红曲色素组份及其衍生物在抗癌中的应用，其证明，红曲色素组份具有较好的抗癌活性作用，与紫杉醇相比，红曲色素组份毒性更小，且来源不受限制，价格便宜，有望开发成为一种新来源的纯天然抗癌药物。但红曲色素组份及其衍生物存在水溶性和光稳定性不佳，其活性成分在可被肠道吸收之前不能溶解的问题，这使其临床应用受到很大限制。

技术实现要素：

本发明针对红曲色素组份及其衍生物的疏水性和光不稳定性，提供了一种利用红曲色素制备的纳米级抗癌制剂，以推动红曲色素组份及其衍生物的临床实践应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用红曲色素组份及其衍生物制备的抗癌制剂，其是将红曲色素组份或其衍生物与药物载体制成所述抗癌制剂；所述药物载体为纳米淀粉、纳米纤维素或纳米糊精。

所述抗癌制剂的粒径为10~350nm，光保存率大于50%。

其中，当采用纳米淀粉为药物载体时，所述抗癌制剂的制备方法包括如下步骤：

1）将0.01~0.1g红曲色素组份或其衍生物于0.2~2.0ml、体积浓度为50-100%的丙酮或乙醇溶液中溶解，然后用蒸馏水稀释至红曲色素组份或其衍生物浓度为0.1~10mmol/l；

2）称取4~40mg纳米淀粉，在搅拌条件下加入步骤1）所得药物溶液10~100ml，充分混合均匀后超声震荡1~10min，再室温震荡0.5~2h，得到红曲色素或其衍生物/淀粉抗癌制剂。

所述纳米淀粉的制备方法为：a）在15-50ml质量分数为1~15%的淀粉溶液中加入0.5~10ml、质量分数为1~30%的naoh溶液，煮沸5~30min后，于100~400w超声波处理0.1~10h，然后冷却至2~50℃；b）按照体积比1:1~20:1将适量花生油加入到100~600ml蒸馏水（含0.1~1vol%司盘80）中，在搅拌条件下于10~85℃的恒温水浴锅中加热至乳化剂完全熔化；c）在震荡条件下，将步骤a）所得淀粉溶液慢慢滴加至步骤b）所得油相中，继续震荡20~60min后加入0.05~0.9gn,n-亚甲基双丙烯酰胺，然后加入0.1~1.0g过硫酸铵和0.1~1.0g亚硫酸氢钠作为引发剂，常温反应0.5~5h，用乙酸乙酯除去油相、无水乙醇洗涤后，干燥得纳米级淀粉微球。

当采用纳米纤维素为药物载体时，所述抗癌制剂的制备方法为：称取0.01~0.1ga-ma-cncs，0.1~1gn-羟基琥珀酰亚胺（nhs），0.1~1.0g1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（edc-hcl），0.01~1g红曲色素组份或其衍生物，加入5~50mln,n-二甲基甲酰胺混合均匀，室温下搅拌反应1.5~15h，离心，去离子水清洗，干燥即得红曲色素或其衍生物/纤维素抗癌制剂干粉。

所述氨基酸修饰的马来酸酐酯化纳米纤维素（a-ma-cncs）的制备方法为：a）将滤纸在纤维标准解离器中于1000~10000r/min疏离5~50min得均匀分散的纸浆，干燥得纸浆粉末，备用；b）称取1.5~15g纸浆粉末和1.5~15g马来酸酐于玛瑙球磨罐中，滴加1~10ml、质量浓度为2~20%的h2so4作为催化剂，球磨交替处理0.5~2h（装球量5~50个，交替运行时间为1~10min）；c）球磨处理后将样品转移至三颈瓶中，30~55℃水浴反应0.5~5h后，10~100℃下超声处理1~10h，离心（1000~10000r/min）、蒸馏水清洗、乙醇洗脱后，干燥得马来酸酐酯化纳米纤维素（ma-cncs）；d）称取0.1~1.0gma-cncs，0.05~0.5g4-二甲氨基酸吡啶（dmap），0.5~2.0gl-亮氨酸，1~5gedc-hcl，加入5~50mln,n-二甲基甲酰胺混合均匀，室温下搅拌反应2~20h，离心（1000~10000rpm）、蒸馏水洗脱、乙醇清洗，干燥得氨基酸修饰的ma-cncs（a-ma-cncs）。

当采用纳米糊精为药物载体时，所述抗癌制剂的制备方法为：

1）称取红曲色素组份或其衍生物0.1~1g，溶于2~20ml、体积浓度为50-100%的丙酮或乙醇溶液中；

2）称取0.3~3g环糊精溶于20~50ml超纯水中，10~80℃水浴加热溶解，制成环糊精饱和溶液；

3）在搅拌条件下，在步骤2）所得环糊精饱和溶液中缓慢加入步骤1）所得药物溶液，加热搅拌反应1~10h，干燥得红曲色素或其衍生物/糊精类抗癌制剂干粉。

所述红曲色素组份为红曲霉菌的发酵产物或发酵产物的提取纯化产物，所述红曲色素组份的衍生物由红曲色素组份经生物转化或化学修饰合成。

所述红曲色素组份具有以下分子结构：

。

所述红曲色素组份的衍生物由红曲色素组份经生物转化或化学修饰合成，主要的生物转化或化学修饰的位置为2-3位（ma2，3）、4位（ma4）或6位（ma6）。

红曲色素组份2-3位的修饰是由内脂结构转为开环结构，其反应式如下：

，

其中，m是铵离子、钾离子、钠离子、镁离子、锌离子或铁离子中的一种。

红曲色素组份4位的修饰为羰基转化为羟基，其反应式如下：

。

红曲色素组份6位的修饰为氧杂环转变为氮杂环化合物，氮来源于氨基酸的氨基；所述的氨基酸为碱性氨基酸、中性氨基酸或酸性氨基酸中的一种，其反应式如下：

。

本发明的显著优点在于：本发明通过将红曲色素组份或其衍生物与药物载体制成抗癌制剂，显著提高了红曲色素组份及其衍生物在水中的分散性和光稳定性，同时其具有较好的药物缓释性能，并对肿瘤细胞生长具有显著的抑制作用。

附图说明

图1为rubropunctatin（a）、β-cd（b）、r/β-cd物理混合物（c）与r-β-cd制剂（d）的扫描电镜对比图；

图2为rubropunctatin（a）、β-cd（b）、r/β-cd物理混合物（c）与r-β-cd制剂（d）的红外光谱对比图；

图3为rubropunctatin（80%乙醇溶解）和r-β-cd制剂在光照条件下保存率随时间变化情况的对比图；

图4为r-β-cd制剂的体外缓释曲线；

图5为rubropunctatin（未加dmso助溶）与r-β-cd制剂对hela细胞的生长抑制情况对比图。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

r-β-cd制剂的制备：称取红斑素（rubropunctatin）0.1012g，溶于2ml丙酮。另外称取0.3244gβ-环糊精溶于20ml超纯水中，60℃水浴加热溶解，制成环糊精饱和溶液。在搅拌条件下，在环糊精饱和溶液中缓慢加入rubropunctatin丙酮溶液，加热搅拌反应6h，冷却后置于-80℃超低温冰箱预冻12h后，再干燥即得r-β-cd固体干粉。

1.r-β-cd分散性测试：称取一定量rubropunctatin和r-β-cd，分别溶于装有4ml超纯水的试管中，静置5min，观察溶液颜色及澄清情况。然后将r-β-cd水溶液稀释20倍后与红斑素水溶液分别用0.22μm的滤膜过滤，使用马尔文激光粒度仪进行测定。

结果显示，r-β-cd的平均粒径为121.87±2.13nm（n=3），pdi值为（0.320±0.017）（n=3）；而rubropunctatin水溶液使用马尔文激光粒度仪测量无响应值。

2.r-β-cd光稳定性测试：取7份100μl、151.475mg/ml的r-β-cd水溶液，分别加入2.9ml蒸馏水，得到相同浓度的r-β-cd溶液，置于卤钨灯（500w，波长597-622nm）下照射，分别在0h、0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h后测溶液在506nm下的吸光值，计算不同时间下r-β-cd的保存率，其计算公式为：

，

其中，ax为处理后样品的吸光值；ao为未经过特定处理的样品吸光值。将同浓度rubropunctatin水溶液按相同操作处理作为对照。

结果显示，与rubropunctatin保存率相比，相同时间下r-β-cd的保存率显著增加，4h时平均保存率为70.56%，表明r-β-cd制剂显著提高了rubropunctatin的光稳定性。

3.r-β-cd体外抗癌活性：取对数生长期的hela细胞培养于96孔板中，待细胞完全贴壁生长后，分别加入不同浓度的r-β-cd样品。培养箱中孵育24h。

mtt实验结果显示，r-β-cd的ic50值为39.37±1.03μmol/l，而rubropunctatin（未添加助溶剂dmso）的ic50＞1000μmol/l。

实施例2

ma2，3/玉米淀粉制剂的制备：

（1）纳米级玉米淀粉的制备：配制30ml质量分数为3.5%的淀粉溶液，加入1.5ml质量分数为28.6%的naoh溶液，煮沸20min后，于400w超声波处理1h，然后冷却至30℃待用。按照体积比7:1取适量花生油加入到300ml蒸馏水（含0.5vol%司盘80）中，在搅拌条件下在50℃的恒温水浴锅中加热至乳化剂完全熔化。在震荡条件下，将淀粉溶液慢慢滴加至制备的油相中，继续震荡45min后加入0.2gn,n-亚甲基双丙烯酰胺，然后加入0.4g过硫酸铵和0.4g亚硫酸氢钠作为引发剂，常温反应3h，用乙酸乙酯除去油相、无水乙醇洗涤后，干燥得纳米级淀粉微球。

（2）将0.0908gma2，3溶于2ml体积浓度为80%的乙醇溶液中，用蒸馏水稀释至浓度为5mmol/l。称取40mg纳米淀粉，在搅拌条件下加入药物溶液100ml，充分混合均匀后，超声震荡10min，再室温震荡1h，得ma2，3/玉米淀粉制剂。

1.ma2，3/玉米淀粉制剂分散性测试：称取一定量ma2，3和ma2，3/玉米淀粉制剂，分别溶于装有4ml超纯水的试管中，静置5min，观察溶液颜色及澄清情况。然后将ma2，3/玉米淀粉制剂溶液稀释适当倍数后，用0.22μm的滤膜过滤，使用马尔文激光粒度仪进行测定。

结果显示，ma2，3/玉米淀粉制剂的平均粒径为279.78±3.20nm（n=3），pdi值为（0.465±0.032）（n=3）；而ma2，3水溶液使用马尔文激光粒度仪测量无响应值。

2.ma2，3/玉米淀粉制剂光稳定性测试：取7份100μl、100mg/ml的ma2，3/玉米淀粉制剂水溶液，分别加入3.0ml蒸馏水，得到相同浓度ma2，3/玉米淀粉制剂溶液，置于卤钨灯（500w，波长597-622nm）下照射，分别在0h、0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h后测溶液在480nm下的吸光值，按照实施例1中给出的保存率计算公式，计算不同时间下ma2，3/玉米淀粉制剂的保存率。

结果显示，4h时，ma2，3/玉米淀粉制剂的平均保存率为60.72%。

3.ma2，3/玉米淀粉制剂体外抗癌活性：取对数生长期的hela细胞培养于96孔板中，待细胞完全贴壁生长后，分别加入不同浓度的ma2，3/玉米淀粉制剂样品。培养箱中孵育24h。

mtt实验结果显示，ma2，3/玉米淀粉制剂的ic50值为79.16±3.41μmol/l，而ma2，3（未添加助溶剂dmso）的ic50＞1000μmol/l。

实施例3

ma4-ma-cncs制剂的制备

（1）ma-cncs的制备：将滤纸在纤维标准解离器中于5000r/min疏离30min得均匀分散的纸浆，干燥得纸浆粉末，备用。称取15g纸浆粉末和7.5g马来酸酐于玛瑙球磨罐中，滴加10ml、质量浓度为20.0%的h2so4催化反应，球磨处理2h（装球量25个，交替运行时间为5min）。球磨处理后将样品转移至三颈瓶中，35℃水浴反应2h后，70℃温度下超声处理8h。离心（10000r/min）、蒸馏水清洗、乙醇洗脱后，干燥得ma-cncs。

（2）氨基酸修饰ma-cncs的制备：称取1.0gma-cncs，0.05gdmap，1.2gl-亮氨酸，1.25gedc-hcl，加入50mln,n-二甲基甲酰胺混合均匀，室温下搅拌反应15h，离心（10000rpm）、蒸馏水洗脱、乙醇清洗，干燥得氨基酸修饰的ma-cncs（a-ma-cncs）。

（3）ma4-ma-cncs制剂的制备：称取0.1ga-ma-cncs样品，0.5gnhs，0.5gedc-hcl，0.01gma4，加入50mln,n-二甲基甲酰胺混合均匀，搅拌下室温反应15h，离心、去离子水清洗，干燥，避光保存。

1.ma4-ma-cncs制剂分散性测试：称取一定量ma4和ma4-ma-cncs制剂，分别溶于装有4ml超纯水的试管中，静置5min，观察溶液颜色及澄清情况。然后将ma4-ma-cncs制剂稀释20倍后与ma4水溶液分别用0.22μm的滤膜过滤，使用马尔文激光粒度仪进行测定。

结果显示，ma4-ma-cncs的平均粒径为199.54±3.65nm（n=3），pdi值为（0.248±0.041）（n=3）；而ma4水溶液使用马尔文激光粒度仪测量无响应值。

2.ma4-ma-cncs制剂光稳定性测试：分别取7份100μl，123.62mg/ml的ma4-ma-cncs制剂，分别加入2.9ml蒸馏水，得到相同浓度的ma4-ma-cncs溶液，置于卤钨灯（500w，波长597-622nm）下照射，分别在0h、0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h后测溶液在495nm下的吸光值，按照实施例1中给出的保存率计算公式，计算不同时间下ma4-ma-cncs制剂的保存率。

结果显示，4h时，ma4-ma-cncs制剂的平均保存率为55.3%。

3.ma4-ma-cncs制剂体外抗癌活性：取对数生长期的hela细胞培养于96孔板中，待细胞完全贴壁生长后，分别加入不同浓度的ma4-ma-cncs样品。培养箱中孵育24h。

mtt实验结果显示，ma4-ma-cncs制剂的ic50值为56.73±4.22μmol/l，而ma4（未添加助溶剂dmso）的ic50＞1000μmol/l。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。