一种海松烷型二萜在制备抗氧化应激药物中的应用的制作方法

本公开属于抗氧化应激药物领域，涉及一种海松烷型二萜sphaeropsidina、包含该化合物的组合物在制备抗氧化应激药物及保健品中的应用。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

糖尿病、神经退行性疾病、癌症、心血管疾病、慢性阻塞性肺病等疾病严重威胁人类健康，导致人类死亡率升高。这些疾病病理进程有一共性，氧化应激是上述疾病重要诱发因素，并伴随其整个病理进程。氧化应激是由活性氧、活性氮或反应性亲电子体等活性物质和抗氧化应激防御系统的不平衡引起的过氧化状态。氧化应激导致的活性氧增加，能够破坏细胞结构中的脂质、蛋白质和核酸，引起细胞损伤，诱发糖尿病、神经退行性疾病、癌症、心血管疾病等一系列疾病。核因子红细胞2相关因子2(nrf2)通路在调控细胞氧化还原中发挥重要作用，并且激活nrf2通路是抵抗氧化应激的主要防御机制之一。在稳态条件下，nrf2在胞浆中和keap1结合，泛素化后被蛋白酶体降解维持在低水平；机体受到外界毒物侵袭诱发氧化应激，可导致nrf2与keap1解离，转位入核，与位于细胞保护基因启动子区域的抗氧化反应元件(are)结合，启动抗氧化蛋白或ii相解毒酶的转录，清除有害污染物，降低活性物质水平。激活nrf2调控防御反应，能够促进细胞恢复氧化还原平衡，可以预防和治疗糖尿病、神经退行性疾病、癌症、心血管疾病、慢性阻塞性肺病。

因此，外源性小分子nrf2激动剂是预防或治疗氧化应激诱发疾病药物的重要来源。小分子nrf2激动剂可以上调抗氧化蛋白或ii相解毒酶表达，降低细胞内活性氧水平，增加内源性抗氧化剂gsh的含量，抑制对细胞结构中蛋白质，脂质和核酸大分子的损伤，从而预防和治疗糖尿病、神经退行性疾病、癌症、心血管疾病、慢性阻塞性肺病等慢性病，降低上述疾病的发病率。

天然产物对药物发现有着显著地贡献，相比化学合成的抗氧化剂，天然产物具有低毒的优点从而具有不可替代的作用。萜类化合物具有多样的生物活性，有研究报道了一些萜类化合物在nrf2/are通路中的作用，例如穿心莲内酯通过增强细胞核中nrf2的积累和促进are调节的基因靶标的表达来保护肺免受香烟引起的损伤，齐墩果酸激活nrf2来抑制动脉粥样硬化。

技术实现要素：

sphaeropsidina作为一种真菌代谢物目前已被发现具有一定的体外抗黑色素瘤活性，为了进一步开发具有预防或治疗氧化应激疾病活性的海松烷型化合物，发明人针对sphaeropsidina的抗氧化活性进行了研究。本公开针对海松烷型二萜sphaeropsidina的抗氧化活性进行研究，研究表明该化合物为强nrf2激动剂，具有上调抗氧化蛋白的表达、降低细胞内活性氧水平的作用，有望应用于糖尿病、神经退行性疾病、癌症、心血管疾病、慢性阻塞性肺病等慢性病的预防和治疗。

为了实现上述技术效果，本公开提供以下技术方案：

本公开中提供的海松烷型二萜化合物，具有如下式ⅰ所示的化学结构，名称为sphaeropsidina。

本公开第一方面，提供海松烷型二萜化合物sphaeropsidina在制备抗氧化应激药物中的应用，其特征在于，所述化合物的结构如下式所示：

本公开第二方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包括海松烷型二萜化合物sphaeropsidina和/或其药学上可接受的盐。

优选的，所述药学上可接受的盐为硫酸盐、磷酸盐、盐酸盐或为复合物的形式。

本公开第三方面，提供一种药物，所述药物包括第二方面所述的药物组合物及药学上可接受的辅料。

优选的，所述药物的剂型为片剂、合剂，颗粒剂，酊剂，胶囊剂，注射剂，酒剂、丸剂或口服液。

优选的，所述片剂的辅料包括淀粉、糊精、羧甲基纤维素钠及硬脂酸镁。

本公开第四方面，提供第二方面所述药物组合物或第三方面所述药物在制备抗氧化应激药物或保健品中的应用。

优选的，所述抗氧化应激药物为预防或治疗糖尿病、神经退行性疾病、癌症、心血管疾病、慢性阻塞性肺病、慢性肾病或呼吸道炎症的药物或保健品。

优选的，所述抗氧化应激药物为nrf2或nqo1和γgcs激动剂、或内源性抗氧化剂gsh激动剂、或t-sod活力激动剂。

与现有技术相比，本公开的有益效果是：

本公开研究提供了sphaeropsidina的抗氧化活性，并且具体提供了该化合物的抗氧化应激机制，为该化合物制备成为相应的药物提供了宝贵的依据；化合物sphaeropsidina作为一种强nrf2激动剂，相比类似结构的海松烷型化合物更好的抗氧化活性，应用于抗氧化应激药物的制备具有良好的应用前景。

附图说明

构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1为实施例1中sphaeropsidina的nqo1诱导活性试验柱状图；

图中sphaeropsidina所用浓度范围为0.78～25μm,阳性对照萝卜硫素所用浓度为2.0μm；结果表明sphaeropsidina能够上调hepa1c1c7细胞中ii相解毒酶nqo1的表达；

图2为实施例1中sphaeropsidina剂量依赖性研究实验的免疫印迹分析图；

图中sphaeropsidina所用浓度范围为0～6μm；结果表明sphaeropsidina能够剂量依赖性地上调nrf2及其下游基因nqo1和γgcs蛋白水平；

图3为实施例1中sphaeropsidina蛋白半衰期的免疫印迹分析图；

图中的sphaeropsidina所用浓度为0.75μm；结果表明sphaeropsidina能够延长nrf2半衰期；

图4为免疫荧光显微图；

图中sphaeropsidina所用浓度为0.75μm，阳性对照萝卜硫素所用浓度为5.0μm；结果表明sphaeropsidina促进nrf2转位入核；

图5为不同浓度实施例1中sphaeropsidina对细胞内gsh含量影响的柱状图；

图中sphaeropsidina所用浓度范围为0.375～3μm，阳性对照萝卜硫素所用浓度为5.0μm；结果表明sphaeropsidina能够剂量依赖性地增加人支气管上皮beas-2b细胞中内源性抗氧化剂gsh的含量；

图6为实施例1中sphaeropsidina对砷诱导的细胞死亡的保护作用的细胞存活量柱状图；

其中，图6a为不同浓度sphaeropsidina(0.095～3μm)对10μm砷引发细胞毒性的保护作用；图6b为0.75μmsphaeropsidina对不同浓度砷引发细胞毒性的保护作用；结果表明sphaeropsidina能改善砷诱导的细胞毒性。

图7为ao/eb双染色法荧光显微照片；

图中sphaeropsidina所用浓度为0.75μm，砷的浓度为5.0μm；结果表明sphaeropsidina能够抑制砷诱导的细胞凋亡。

图8为不同浓度sphaeropsidina对斑马鱼体内抗氧化相关因子gsh含量影响的柱状图；

图中sphaeropsidina所用浓度范围为0.5～1.5μm，lps所用浓度为20μg/ml；结果表明sphaeropsidina能够剂量依赖性地改善lps诱导的gsh含量降低。

图9为不同浓度sphaeropsidina对斑马鱼体内抗氧化相关因子t-sod活力影响的柱状图；

图中sphaeropsidina所用浓度范围为0.5～1.5μm，lps所用浓度为20μg/ml；结果表明1.5μmsphaeropsidina能够改善lps诱导的t-sod含量降低。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术对sphaeropsidina抗氧化活性研究不足，为了解决如上的技术问题，本申请提出海松烷型二萜sphaeropsidina在制备预防或治疗氧化应激诱发疾病药物、保健品中的应用。

本公开的一种典型实施方式，提供了海松烷型二萜sphaeropsidina在制备预防或治疗氧化应激诱发疾病的药物或保健品中的应用，所述海松烷型二萜的化学式如下：

本公开通过研究发现sphaeropsidina能够增加nrf2及其下游基因γgcs，nqo1的蛋白表达，其机制是通过增加nrf2的稳定性，抑制泛素化实现的；使用as(iii)诱导的人支气管上皮beas-2b细胞氧化损伤模型评价sphaeropsidina的细胞保护作用，结果显示该化合物能够上调细胞内gsh的含量，抑制as(iii)诱导的beas-2b细胞损伤和凋亡；sphaeropsidina能够抑制斑马鱼体内氧化应激反应，具有预防或治疗糖尿病、神经退行性疾病、癌症、心血管疾病、慢性阻塞性肺病、慢性肾病、呼吸道炎症的作用。

优选的，针对上述应用，sphaeropsidina的浓度范围为0.095～0.75μm。进一步优选的，sphaeropsidina的浓度为0.75μm。该浓度下对细胞发挥最佳保护作用。

优选的，上述氧化应激诱发疾病为糖尿病、神经退行性疾病、癌症、心血管疾病、慢性阻塞性肺病、慢性肾病、呼吸道炎症。

优选的，上述海松烷型二萜的分离制备方法为：将内生真菌botrysphaerialaricina的察氏培养基过滤，滤液用乙酸乙酯萃取。减压浓缩后用硅胶柱进行分离，采用石油醚-乙酸乙酯(100:1→1:1)进行梯度洗脱，得到的10个组分分别记为fr.1-fr.10。

将fr.5用硅胶柱进一步分离，以石油醚-乙酸乙酯(70:1→1:1)进行梯度洗脱，得到8个组分(fr.5.1-fr.5.8)。

fr.5.3依次用凝胶sephadexlh-20柱(二氯甲烷-甲醇1:1)，十八烷基键合硅胶柱(50％→100％甲醇)分离得到4个组分(fr.5.3.1-fr.5.3.4)。

再将fr.5.3.4用硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯(50:1→1:1)为流动相洗脱，得到无色针状结晶，即sphaeropsidina。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。

实施例1：sa的分离制备和结构确证

将内生真菌botrysphaerialaricina的察氏培养基过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，共提取4次，每次20l。将所得提取液减压浓缩得到200.2g红色油状物。后用硅胶柱粗分离，采用石油醚-乙酸乙酯(100:1→1:1)进行梯度洗脱，其中，石油醚-乙酸乙酯比例依次为100:1，50:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，每个比例的洗脱剂用量为9l，得到的10个组分分别记为fr.1-fr.10。用硅胶柱进一步分离fr.5(22.5g)，以石油醚-乙酸乙酯(70:1→1:1)为流动相进行梯度洗脱，其中，石油醚-乙酸乙酯比例依次为70:1，30:1，10:1，5:1，2:1，1:1，每个比例的洗脱剂用量为2l，，得到8个组分(fr.5.1-fr.5.8)。fr.5.3依次用凝胶柱lh-20(二氯甲烷-甲醇1:1)，十八烷基键合硅胶柱(50％→100％甲醇)分离得到4个组分(fr.5.3.1-fr.5.3.4)。再将fr.5.3.4用硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯(50:1→1:1)为流动相，得到无色针状结晶，即sphaeropsidina。

采用核磁共振波谱法对所得化合物进行结构鉴定：从¹h-nmr谱上观察到3个甲基单峰信号(δh1.10,3h,s；1.19,3h,s和1.22,3h,s)；1组末端双键的质子信号(δh5.78,1h,dd,j＝17.6,10.7hz；5.07,1h,dd,j＝10.7,0.5hz和5.04,1h,dd,j＝17.6,0.5hz)；1个共轭双键的质子信号(δh6.83,1h,s)。从¹³c-nmr谱观察到3个甲基信号(δc24.4,22.7和33.2)；6个亚甲基信号(包括sp²杂化的碳原子δc113.5)；3个次甲基信号(包括sp²杂化的碳原子δc145.0和153.4)；6个季碳信号(包括一个连氧碳原子δc71.7和1个连双氧碳原子δc104.4)；2个羰基信号(包括一个酮羰基碳原子δc192.6和一个酯羰基碳原子δc176.1)。综上所述，该化合物为海松烷型二萜，查阅文献鉴定该化合物为sphaeropsidina。

sphaeropsidina的核磁共振数据为：¹h-nmr信号为δh:2.22(1h,brd,j＝8.1hz,h-1α)；1.56(1h,m,h-1β)；1.55(1h,m,h-2α)；1.54(1h,m,h-2β)；1.85(1h,m,h-3α)；1.80(1h,m,h-3β)；2.70(1h,s,h-5)；1.83(1h,m,h-11α)；1.65(1h,m,h-11β)；1.33(1h,m,h-12α)；1.23(1h,m,h-12β)；6.83(1h,s,h-14)；5.78(1h,dd,j＝17.6,10.7hz,h-15)；5.04(1h,dd,j＝17.6,0.5hz,h-16α)；5.07(1h,dd,j＝10.7,0.5hz,h-16β)；1.10(3h,s,h-17)；1.19(3h,s,h-18)；1.22(3h,s,h-19)。¹³c-nmr信号为δc：23.3(c-1)；18.1(c-2)；27.0(c-3)；32.3(c-4)；52.2(c-5)；104.4(c-6)；192.6(c-7)；133.2(c-8)；71.7(c-9)；58.5(c-10)；41.2(c-11)；30.7(c-12)；38.4(c-13)；153.4(c-14)；145.0(c-15)；113.5(c-16)；24.4(c-17)；33.2(c-18)；22.7(c-19)；176.1(c-20)。

实施例2：sphaeropsidina的nqo1诱导活性评价

(1)小鼠肝癌细胞hepa1c1c7的培养

小鼠肝癌细胞hepa1c1c7购买自美国模式培养物集存库(atcc)，采用含10％胎牛血清(fbs)的dmem培养基，置于37℃，5％co2培养箱中培养。

(2)nqo1诱导活性试验

将hepa1c1c7细胞接种到96孔板上，待细胞贴壁后加入不同浓度的sphaeropsidina(实施例1确证)孵育24h，用0.8％洋地黄皂苷溶液裂解细胞，加入检测液[1.0ml0.5m三羟甲基氨基甲烷-盐酸(tris-hcl),15mg牛血清白蛋白,6mgmtt,150μl吐温-20,150μl150mmd-葡萄糖-6-磷酸，15μl7.5mm黄素腺嘌呤二核苷酸，27μl50mm烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，20μl50mm甲萘醌，放置3分钟，于630nm测定发光强度。

结果：如图1所示，sphaeropsidina能够激活hepa1c1c7细胞中nqo1活性，其最大诱导活性为对照组的1.89倍(3.12μm)，阳性对照药萝卜硫素(2.0μm)是空白对照组的1.5倍左右。上述结果表明，sphaeropsidina能激活ii相脱毒酶nqo1，对人体细胞具有保护作用。

实施例3：sphaeropsidina能够剂量依赖性地上调nrf2及其下游基因γgcs和nqo1的蛋白水平。

(1)人肺支气管上皮beas-2b细胞的培养

人肺支气管上皮beas-2b细胞购自美国模式培养物集存库(atcc)，采用含10％胎牛血清(fbs)的1640培养基，置于37℃，5％co2培养箱中培养。

(2)免疫印迹分析

将beas-2b细胞接种于d35培养皿中，待密度达到70％-80％后，加入不同浓度的待测化合物处理18h，pbs洗涤2次，加入细胞裂解液(0.5mm苯甲基磺酰氟,50μg/ml抑肽酶,10mm氟化钠,1mm正钒酸钠,10mmβ-磷酸甘油)，收集蛋白，分别取适量样品蛋白上样，sds-page分离蛋白组分，电转移至硝酸纤维素薄膜上。薄膜经含有5％脱脂奶粉的pbst溶液室温封闭1h后，分别与待测抗体4℃孵育过夜。经pbst洗涤后加入辣根过氧化物酶偶联的二抗室温孵育1h后，用增强型ecl化学发光进行蛋白分析。

结果：如图2所示，细胞经肺支气管上皮处理18h后，nrf2及其下游基因nqo1和γgcs蛋白水平剂量依赖性增加，最大有效剂量为3μm。keap1蛋白水平剂量依赖性降低，证实该化合物能在蛋白水平上激活nrf2信号通路。

实施例4：肺支气管上皮延长nrf2半衰期

方法：将beas-2b细胞接种于d35培养皿中，待密度达到70％-80％后，加入sphaeropsidina预孵育8h(空白组不加)，然后加入50μm放线菌酮，分别在0、10、20、30、40min收集蛋白，进行免疫印迹分析检测，采用imagej软件进行量化。

结果：如图3所示，加药处理后beas-2b细胞nrf2蛋白半衰期由15.81分钟延长至30.11分钟，表明sphaeropsidina能够延长nrf2蛋白半衰期,增加蛋白稳定性。

实施例5：sphaeropsidina能够促进nrf2蛋白转位入核

方法：将细胞爬片放置于d35培养皿中，接种beas-2b细胞，待细胞贴壁后加入sphaeropsidina处理8h，4度预冷的pbs洗涤2次，加入甲醇-丙酮(1:1)固定10分钟，pbs洗涤2次，加入nrf2抗体4度孵育过夜，pbs洗涤3次，加入荧光二抗室温孵育1h，用dapi染色10分钟，采用荧光显微镜观察并拍照。

结果：如图4所示，未处理组nrf2蛋白主要位于细胞质中，加入sphaeropsidina(0.75μm)和阳性对照萝卜硫素(5.0μm)处理8h后，nrf2主要集中在细胞核内。结果表明sphaeropsidina能够诱导nrf2转位入核。

实施例6：sphaeropsidina能够上调beas-2b细胞内谷胱甘肽水平

方法：将beas-2b细胞接种于d60培养皿中，待密度达到70％-80％后，加入不同浓度的sphaeropsidina(实施例1确证)处理24h，pbs洗涤2次，收集细胞，离心，向细胞沉淀物中加入0.5ml50mm磷酸钠和1mmedta缓冲液裂解细胞，超声1min，细胞悬液和试剂一1:1混匀，3500转/分，离心10min，取上清液，按照谷胱甘肽测定试剂盒说明书操作，405nm测定吸光度，计算谷胱甘肽含量。

结果：如图5所示，sphaeropsidina能够显著增加细胞内谷胱甘肽水平，增强细胞抗氧化能力。

实施例7：sphaeropsidina能够提高beas-2b细胞在砷损伤条件下的生存率

方法：将beas-2b细胞接种于96孔板中，待到达适宜的密度后，采用指定浓度的sphaeropsidina预处理细胞8h，加入不同浓度的砷和指定浓度的sphaeropsidina(实施例1确证)处理24h，加入mtt3h后，570nm测定吸光度，计算细胞生存率。

结果：如图6a所示，sphaeropsidina预处理细胞8h能够显著地抑制10μm砷诱发的细胞毒性，提高细胞生存率，其中0.75μm的sphaeropsidina保护作用最佳。如图6b所示，采用0.75μmsphaeropsidina预孵育8h，显著抑制5、10、20μm的砷诱发的细胞毒性，提高细胞生存率。结果表明，sphaeropsidina能够抑制致癌物砷诱导的毒性。

实施例8：sphaeropsidina能够抑制砷诱导的细胞调亡

方法：将beas-2b细胞接种于d35培养皿中，待细胞贴壁后加入0.75μmsphaeropsidina和5μm砷共处理12h，分别加入吖啶橙(ao)/溴乙锭(eb)进行染色，并采用荧光显微镜观察细胞状态。

结果：如图7所示，砷和sphaeropsidina共处理12h能够显著抑制砷诱导的细胞凋亡。

实施例9：sphaeropsidina能够上调斑马鱼在lps存在条件下的谷胱甘肽水平

(1)斑马鱼胚胎获取

雌雄斑马鱼分开喂养，照明14h/黑暗10h交替进行，定时喂以人工颗粒状饵料和刚孵出的卤虫无节幼体。采卵时取健康性成熟的斑马鱼按雌雄1:1的比例放入交配缸内，次日9-10时获得受精卵。对受精卵进行消毒和洗涤后移入斑马鱼胚胎培养用水(含5.0mm氯化钠，0.17mm氯化钾，0.4mm氯化钙，0.16mm硫酸镁)中，28℃下控光培养。

(2)斑马鱼体内gsh含量检测

收集各处理组幼鱼，用蒸馏水洗三次，洗去处理药液，然后吸净水分。向每组幼鱼样品加入1.5ml生理盐水，加入10粒磁珠，6档，2分钟，匀浆，重复2次，充分匀浆。2500转/分，离心10分钟，取上清液，按照谷胱甘肽测定试剂盒说明书操作。以255ul双蒸水调零，420nm处测定吸光值，同时用bca蛋白浓度测定法检测上清中蛋白浓度。计算上清样品中gsh含量。

结果：如图8所示，sphaeropsidina能够剂量依赖性地上调斑马鱼在lps存在条件下的谷胱甘肽水平，增强抗氧化能力。

实施例10：sphaeropsidina能够上调斑马鱼在lps存在条件下的t-sod活力

方法：收集各处理组幼鱼，用蒸馏水洗三次，洗去处理药液，然后吸净水分，匀浆。2500转/分，离心10分钟，取上清。按照总超氧化物歧化酶测试盒说明书操作。检测时取每组上清，在1.5ml离心管内按比例配液，然后用旋涡混匀器充分混匀，置37℃恒温水浴40min，然后加入显色剂，混匀，室温放置10min，于波长550nm处，蒸馏水调零，测定吸光值，同时用bca蛋白浓度测定法检测上清中蛋白浓度。计算上清样品中总sod活力。

结果：如图9所示，1.5μmsphaeropsidina能够上调斑马鱼体内t-sod活力，增强抗氧化能力。

实施例11：片剂的制备

sphaeropsidina(实施例1确证)1g，淀粉1g、糊精2g，均匀混合后过筛，加入羧甲基纤维素钠适量制粒。再加入硬脂酸镁适量，混匀，压片，即得。

以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。