一种从薯莨中提取抗氧化成分的方法与流程

本发明涉及植物提取技术领域，特别涉及一种从薯莨中提取抗氧化成分的方法。

背景技术：

近年来，心脑血管疾病的发病率和病死率均呈上升趋势，研究发现：心肌缺血/再灌注损伤、心肌病、动脉粥样硬化等心血管疾病与活性氧簇关系密切，并且研究表明：抑制氧化应激诱导的心肌细胞损伤是减轻心肌缺血再灌注损伤的有效途径，因此，研究薯莨中抗氧化成分抑制氧化应激的影响是至关重要。

薯莨为薯蓣科植物薯莨的干燥块茎，又名鸡血莲、血娃、红药子、长寿果、山猪薯、染布薯，为贵州省少数民族用药。薯莨块茎含鞣质、酚类、甙类、多糖、蛋白质、淀粉、维生素c、氨基酸类、生物碱类、黄酮类、矿质元素、不饱和脂肪酸、挥发性组分等多种成分，具有止血、抗菌和清热化瘀等功效。

目前，关于薯莨的化学成分研究基本局限于对其色素、单宁的提取工艺研究，如专利号cn201610399699.2、cn201611012982.1等均公开了薯莨中单宁的提取方法，但是对于薯莨中抗氧化成分的提取以及其活性研究较少。

众所周知维生素c、单宁、黄酮类物质、生物碱类物质是常用的抗氧化剂，而从《酶法提取女贞子多糖及其抗氧化性研究》(周旋等人)中表明女贞子多糖具有显著的抗氧化活性,对dpph自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基作用明显,是一种良好的天然抗氧化剂，以及文献《多糖体外抗氧化活性研究进展》指出多糖是一类重要的天然产物资源,广泛研究显示活性多糖具有多种生物活性,包括抗氧化、抗炎症、降血糖、降血脂等；由此可推导薯莨多糖也可能具有抗氧化作用，除此外一些有机酸、多肽等活性物质也具有抗氧化性，这使得薯莨中抗氧化成分复杂，且活性难控制。由于一种植物中可能含有多种抗氧化成分，每一类活性成分又包含多种不同的结构，因此，使得抗氧化成分的提取工艺研究更为复杂、繁琐。

技术实现要素：

本发明为了解决上述技术问题，提供了一种从薯莨中提取抗氧化成分的方法。

具体是通过以下技术方案来实现的：

一种从薯莨中提取抗氧化成分的方法，包括如下步骤：

1)取薯莨块茎，研磨过筛，加入薯莨粉质量6-10倍的超纯水，加热提取1～4次，每次1～3h，合并提取液，浓缩至原体积1/4，得薯莨总提物；

2)用大孔树脂对薯莨总提物进行梯度洗脱，收集各洗脱液并干燥。

所述研磨过程中加入薯莨块茎质量0.3-0.5倍的冰块进行研磨至薯莨粉温度为常温。

所述过筛的粒度为24-80目。

所述加热提取采取升温、降温、保温的三段提取方式。

所述升温是在30-35min内升温至料温为80-92℃。

所述降温是在20-25min内下降10-15℃。

所述浓缩是先向提取液中加入提取液质量0.1-0.3％的活性炭，再置于温度为75-105℃条件下浓缩。

所述活性炭的粒度为60-100目。

所述大孔树脂为ab-8大孔树脂。

所述梯度洗脱是依次采用水、55％-60％乙醇、90％-95％乙醇进行洗脱。

有益效果：

采用本发明方法具有提取率、纯度以及抗氧化活性高的特点；本发明在研磨过程中加入冰块，提高了薯莨的细胞壁破损率和破损度，进而有利于薯莨中各种成分的溶出，同时利用冰块温度缓解摩擦热作用，进而有助于保证天然成分的活性。

本发明采用升温、降温、保温的组合方法，有助于细胞膜的溶胀，提高了有效成分的溶出率和保留率，并且使得有效成分相互反应，进而有助于提高抗氧化活性。再结合在浓缩过程中加入活性炭，有助于保留抗氧化成分的活性以及减少挥发性抗氧化成分的损失率,并且利用活性炭的特性，不仅提高了浓缩物的稳定性，还加快了浓缩速度。

本发明利用梯度洗脱，得到不同部位的薯莨提取物，进而有助于提高抗心肌细胞氧化损伤的作用。

本发明通过紫外分光度法测定原花青素类化学成分含量，高效液相色谱法测定表儿茶素和儿茶素的含量，经过活性炭和大孔树脂处理后的样品，与未处理的样品相比较，该类成分含量均增高，结果如表1所示：

表1.大孔树脂和活性炭处理前后薯莨中抗氧化成分含量

附图说明

图1：不同浓度h2o2对h9c2心肌细胞存活率的影响；

图2：不同浓度的薯莨总提物和薯莨洗脱物对正常h9c2细胞存活率的影响；其中，a：薯莨总提物；b：水洗脱物；c：60％乙醇洗脱物；d：95％乙醇洗脱物；

图3：薯莨总提物和薯莨洗脱物预处理对氧化损伤后h9c2细胞存活率的影响；其中，a：薯莨总提物；b：水洗脱物；c：60％乙醇洗脱物；d：95％乙醇洗脱物；

图4：薯莨水洗脱物对缺氧损伤后h9c2细胞凋亡影响的统计图；

注：与空白组比，^###p<0.001；与模型组比，**p<0.01，***p<0.001。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。

实施例1

一种从薯莨中提取抗氧化成分的方法，包括如下步骤：

1)取薯莨块茎，研磨过筛，加入薯莨粉质量10倍的超纯水，加热提取4次，每次3h，合并提取液，浓缩至原体积1/4，得薯莨总提物；

2)用大孔树脂对薯莨总提物进行梯度洗脱，收集各洗脱液并干燥；

所述研磨过程中加入薯莨块茎质量0.5倍的冰块进行研磨至薯莨粉温度为常温；

所述过筛的粒度为80目；

所述加热提取采取升温、降温、保温的三段提取方式；

所述升温是在35min内升温至料温为92℃；

所述降温是在25min内下降15℃；

所述浓缩是先向提取液中加入提取液质量0.3％的活性炭，再置于温度为105℃条件下浓缩；

所述活性炭的粒度为100目；

所述大孔树脂为ab-8大孔树脂；

所述梯度洗脱是依次采用水、60％乙醇、95％乙醇进行洗脱。

实施例2

一种从薯莨中提取抗氧化成分的方法，包括如下步骤：

1)取薯莨块茎，研磨过筛，加入薯莨粉质量6倍的超纯水，加热提取1次，每次1h，合并提取液，浓缩至原体积1/4，得薯莨总提物；

2)用大孔树脂对薯莨总提物进行梯度洗脱，收集各洗脱液并干燥；

所述研磨过程中加入薯莨块茎质量0.3倍的冰块进行研磨至薯莨粉温度为常温；

所述过筛的粒度为24目；

所述加热提取采取升温、降温、保温的三段提取方式；

所述升温是在30min内升温至料温为80℃；

所述降温是在20min内下降10℃；

所述浓缩是先向提取液中加入提取液质量0.1％的活性炭，再置于温度为75℃条件下浓缩；

所述活性炭的粒度为60目；

所述大孔树脂为ab-8大孔树脂；

所述梯度洗脱是依次采用水、55％乙醇、90％乙醇进行洗脱。

实施例3

一种从薯莨中提取抗氧化成分的方法，包括如下步骤：

1)取薯莨块茎，研磨过筛，加入薯莨粉质量8倍的超纯水，加热提取2次，每次2h，合并提取液，浓缩至原体积1/4，得薯莨总提物；

2)用大孔树脂对薯莨总提物进行梯度洗脱，收集各洗脱液并干燥；

所述研磨过程中加入薯莨块茎质量0.4倍的冰块进行研磨至薯莨粉温度为常温；

所述过筛的粒度为50目；

所述加热提取采取升温、降温、保温的三段提取方式；

所述升温是在32min内升温至料温为85℃；

所述降温是在23min内下降12℃；

所述浓缩是先向提取液中加入提取液质量0.2％的活性炭，再置于温度为100℃条件下浓缩；

所述活性炭的粒度为80目；

所述大孔树脂为ab-8大孔树脂；

所述梯度洗脱是依次采用水、58％乙醇、92％乙醇进行洗脱。

实施例4

一种从薯莨中提取抗氧化成分的方法，包括如下步骤：

1)取薯莨块茎，研磨过筛，加入薯莨粉质量9倍的超纯水，加热提取3次，每次1.5h，合并提取液，浓缩至原体积1/4，得薯莨总提物；

2)用大孔树脂对薯莨总提物进行梯度洗脱，收集各洗脱液并干燥；

所述研磨过程中加入薯莨块茎质量0.4倍的冰块进行研磨至薯莨粉温度为常温；

所述过筛的粒度为70目；

所述加热提取采取升温、降温、保温的三段提取方式；

所述升温是在30min内升温至料温为90℃；

所述降温是在20min内下降12℃；

所述浓缩是先向提取液中加入提取液质量0.2％的活性炭，再置于温度为90℃条件下浓缩；

所述活性炭的粒度为70目；

所述大孔树脂为ab-8大孔树脂；

所述梯度洗脱是依次采用水、55％乙醇、95％乙醇进行洗脱。

实施例5

一种从薯莨中提取抗氧化成分的方法，包括如下步骤：

1)取薯莨块茎，研磨过筛，加入薯莨粉质量9倍的超纯水，加热提取2次，每次2.5h，合并提取液，浓缩至原体积1/4，得薯莨总提物；

2)用大孔树脂对薯莨总提物进行梯度洗脱，收集各洗脱液并干燥；

所述研磨过程中加入薯莨块茎质量0.4倍的冰块进行研磨至薯莨粉温度为常温；

所述过筛的粒度为40目；

所述加热提取采取升温、降温、保温的三段提取方式；

所述升温是在35min内升温至料温为82℃；

所述降温是在20min内下降15℃；

所述浓缩是先向提取液中加入提取液质量0.15％的活性炭，再置于温度为80℃条件下浓缩；

所述活性炭的粒度为90目；

所述大孔树脂为ab-8大孔树脂；

所述梯度洗脱是依次采用水、60％乙醇、90％乙醇进行洗脱。

对比例1

一种从薯莨中提取抗氧化成分的方法，包括如下步骤：

1)取薯莨块茎，研磨过筛，加入薯莨粉质量8倍的超纯水，加热提取2次，每次2h，合并提取液，浓缩至原体积1/4，得薯莨总提物；

2)用大孔树脂对薯莨总提物进行梯度洗脱，收集各洗脱液并干燥；

所述过筛的粒度为80目；

所述加热提取采取升温、降温、保温的三段提取方式；

所述升温是在32min内升温至料温为85℃；

所述降温是在23min内下降12℃；

所述浓缩是先向提取液中加入提取液质量0.2％的活性炭，再置于温度为105℃条件下浓缩；

所述活性炭的粒度为80目；

所述大孔树脂为ab-8大孔树脂；

所述梯度洗脱是依次采用水、58％乙醇、92％乙醇进行洗脱。

对比例2

一种从薯莨中提取抗氧化成分的方法，包括如下步骤：

1)取薯莨块茎，研磨过筛，加入薯莨粉质量8倍的超纯水，加热提取2次，每次2h，合并提取液，浓缩至原体积1/4，得薯莨总提物；

2)用大孔树脂对薯莨总提物进行梯度洗脱，收集各洗脱液并干燥；

所述研磨过程中加入薯莨块茎质量0.4倍的冰块进行研磨至薯莨粉温度为常温；

所述过筛的粒度为80目；

所述加热提取采取升温、降温、保温的三段提取方式；

所述升温是在32min内升温至料温为85℃；

所述降温是在23min内下降12℃；

所述大孔树脂为ab-8大孔树脂；

所述梯度洗脱是依次采用水、58％乙醇、92％乙醇进行洗脱。

对比例3

一种从薯莨中提取抗氧化成分的方法，包括如下步骤：

1)取薯莨块茎，研磨过筛，加入薯莨粉质量8倍的超纯水，于80℃条件下加热提取2次，每次2h，合并提取液，浓缩至原体积1/4，得薯莨总提物；

2)用大孔树脂对薯莨总提物进行梯度洗脱，收集各洗脱液并干燥；

所述研磨过程中加入薯莨块茎质量0.4倍的冰块进行研磨至薯莨粉温度为常温；

所述过筛的粒度为80目；

所述浓缩是先向提取液中加入提取液质量0.2％的活性炭，再置于温度为90℃条件下浓缩；

所述活性炭的粒度为80目；

所述大孔树脂为ab-8大孔树脂；

所述梯度洗脱是依次采用水、58％乙醇、92％乙醇进行洗脱。

试验例1薯莨提取物保护h2o2诱导的h9c2细胞损伤作用

1、实验材料

细胞：h9c2大鼠心肌细胞株(中科院上海细胞库提供)；

试剂：h2o2购自国药集团化学试剂有限公司；dmem高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均购自gibco公司；青霉素-链霉素、ripa细胞裂解液(含pmsf蛋白酶抑制剂)、磷酸盐缓冲液(pbs粉末，自配)、bca蛋白浓度测定试剂盒均购自solarbio公司；乳酸脱氢酶(ldh)试剂盒、丙二醛(mda)测定试剂盒、过氧化氢酶(cat)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；超氧化物歧化酶(sod)测定试剂盒、活性氧(ros)检测试剂盒、annexinv-fitc/pi细胞凋亡检测试剂盒、线粒体膜电位(jc-1)测定试剂盒均购自于beyotime公司；mts购自普洛麦格生物技术有限公司；

仪器：co2细胞培养箱(thermoscientific公司)；ts100倒置显微镜(nikon公司)；数显立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司公司医疗仪器厂)；双人超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；allegra64r冷冻高速离心机(美国beckman)；model680酶标仪；el204型电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；液氮生物容器(成都金凤液氮容器有限公司)；

2、实验方法

2.1h9c2细胞的培养

取冻存于液氮中的h9c2细胞，置37℃水浴中迅速解冻；将细胞转移至离心管，加入4ml含10％fbs的dmem培养基，充分混合，1000r·min^-1，离心3min。沉淀用5ml含10％fbs的dmem培养基重悬于37℃、5％co2的条件下静置培养，观察细胞生长状态及时换液。待细胞融合至80％时，用0.25％胰蛋白酶消化，传代；

2.2建立h9c2心肌细胞氧化损伤模型

取对数生长期的细胞，用含10％fbs的dmem培养基调整细胞密度至8×10⁴个·ml-1，以每孔100μl接种于96孔培养板中，于37℃、5％co2培养箱中培养。24h后，设对照组：加入空白dmem培养基；不同浓度h2o2模型组：分别加入终浓度为50，100，200，400，600，800，1600μmol/l的h2o2；h2o2作用h9c2心肌细胞0.5h后，每孔加入5μlmts溶液孵育2h，然后用酶标仪检测490nm波长处吸光值，并依据下式计算细胞存活率。每组复孔5个，实验重复3次，按如下公式计算细胞存活率：

细胞存活率＝样品组od值的平均值/对照组od值的平均值

2.3薯莨总提物和薯莨不同洗脱物对正常h9c2细胞安全浓度的考察

h9c2细胞按2.2项方法接种细胞，培养24h后；实验分组为空白对照组组和给药组。空白对照组每孔加入100μldmem培养液，给药组：将薯莨各部位分别用dmem培养液稀释至不同浓度：100，200，400，600，800，1000mg/l每孔加入100μl，作用h9c2细胞24h后用mts法检测。每个浓度平行5孔，实验重复3次，计算细胞存活率；

2.4薯莨总提物和薯莨不同洗脱物对h2o2诱导h9c2细胞氧化损伤的活力影响

h9c2细胞按2.2项下方法接种于96孔板，培养24h后，空白对照组每孔加入100μldmem培养液，模型组每孔加入100μldmem培养液，24h加入600μmol/lh2o2100μl作用0.5h，给药组：将薯莨各部位分别用dmem培养液稀释成浓度分别为100，200，400mg/l，每孔加入100μl，与h9c2细胞共孵育24h后，加入600μmol/lh2o2100μl作用0.5h，用mts法检测。每个浓度平行5孔，实验重复3次，计算细胞存活率；

2.5薯莨水洗脱物洗脱物预处理对h2o2诱导缺氧复氧损伤h9c2细胞中ldh、mda、sod、cat和ros的影响

细胞按照上述2.4方法处理，分别收集各组细胞上清液，并按检测试剂盒说明书步骤，检测细胞上清液中ldh释放量。将各组细胞用0.25％胰酶消化收集，pbs洗涤2次，超声粉碎得到细胞匀浆液。分别按检测试剂盒说明书步骤，检测细胞匀浆液中mda含量和ros水平，sod和cat活力；

2.6薯莨水洗脱物洗脱物预处理对h2o2诱导缺氧复氧损伤h9c2细胞线粒体膜电位和细胞凋亡的影响

细胞按照上述2.4方法处理，用jc-1法检测细胞线粒体膜电位，按照试剂盒说明步骤，利用荧光强度计算结果；按照annexinv-fitc/pi试剂盒说明，利用流式细胞仪检测细胞凋亡；

2.7统计学分析

所有数据采用graphpadprism5软件进行统计，实验数据以mean±sd表示，对于两组间的比较用students't检验，当三组或三组以上比较时用单因素方差分析，后检验采用dunnett'stestp＜0.05认为有统计学意义；

3、实验结果

3.1不同浓度h2o2对h9c2细胞的影响

实验结果表明，50,100,200,400,600,800,1600μmol/lh2o2作用于h9c2细胞0.5h后，大于400μmol/l时细胞活力明显降低，在600μmol/l时可使其存活率下降至50％(p<0.001)左右，且降低程度适中，重复性好，因此选择600μmol/l的h2o2建立氧化应激损伤模型(如图1)；

3.2薯莨总提物和薯莨不同洗脱物对h9c2细胞安全浓度的考察

结果表明，薯莨总提物和薯莨不同洗脱物在100,200,400,800,1000mg/l情况下无细胞毒性，如图2；因此选择100,200,400mg/l三个浓度做后续实验；

3.3薯莨总提物和薯莨不同洗脱物对h2o2诱导h9c2细胞氧化损伤的影响

结果表明，与空白组比，模型组存活率均显著降低(p<0.01)，与模型组比，薯莨总提物和水洗脱物对h2o2诱导的h9c2细胞具有明显的保护作用，说明水洗脱部位的是薯莨中主要保护h2o2诱导的h9c2细胞的有效部位(p<0.01)，如见图3；因此后续选择该部位进行进一步抗氧化作用研究；

3.4薯莨水洗脱物预处理对h2o2诱导缺氧复氧损伤h9c2细胞中sod、mda、ldh、cat、ros水平的影响

结果表明，与空白组比较，模型组sod、cat活性降低(p<0.05)，mda、ldh和ros水平增加(p<0.05)，与模型组比较，低、中、高浓度的薯莨水提取物预处理后，sod、cat活性增加(p<0.05)，mda、ldh和ros含量降低(p<0.05)(表2)；

表2薯莨水洗脱物预处理对h2o2诱导缺氧复氧损伤h9c2细胞中ldh、sod、mda、cat和ros水平的影响±sd,n＝3)

注：与空白组比较：^#p<0.05,^##p<0.01,^###p<0.001.与模型组比较：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001

3.5薯莨水洗脱物对氧化损伤后h9c2细胞凋亡的影响

流式结果显示，与空白组相比，模型组的细胞凋亡显著增加，凋亡率为44.91±3.62(p<0.001)，与模型组相比，低、中、高浓度的薯莨水组分的细胞凋亡显著降低，凋亡率分别为35.38±2.61，26.65±1.12，24.9±1.13(p<0.01，p<0.001)，见图4。

以上实验结果表明，薯莨水洗脱物是其抗氧化损伤的主要活性部位，三个剂量都能显著保护h2o2对心肌细胞的损伤，提高细胞活力和降低ldh的泄漏，此外，能显著提高h2o2诱导的心肌细胞损伤模型中sod和cat的酶活力，降低mda和ros的水平；提示薯莨提取物的水洗脱物是其抗氧化应激的主要活性部位。

试验例2薯莨提取物的抗氧化实验

1、清除dpph试验

精确吸取0.50ml样品溶液(1.0mg/ml)于10ml比色管，加入3.5ml2×10^-4mol/l的dpph溶液混合，摇匀后避光放置30min，以无水乙醇为参比，在517nm处测吸光度值(ax)；并测定0.50ml样品溶液与3.50ml乙醇的混合液的吸光值(ax0)和3.5ml0.2mmol/ldpph溶液与0.05ml乙醇的吸光值(a0)，计算清除率sr％＝100％×[1-(ax-ax0)/a0]

2、对亚油酸过氧化的抑制试验

在10ml具比色管中分别加入1.5ml2.5％亚油酸，4.5ml40mmol/l磷酸盐缓冲液(ph7.0),0.75ml无水乙醇，0.75ml蒸馏水，0.5ml实施例产物(1.0mg/ml)，混合均匀，密封后于37℃恒温避光氧化，得样品混合反应液；空白混合反应液以无水乙醇溶液代替实施例产物，在484nm测定吸光度，分别记为a0样品和a0空白；每间隔24h，在10具比色管中加入0.1ml样品混合反应液、7.0ml75％乙醇、0.2ml30％硫氰酸胺、0.2ml氯化亚铁溶液(20mmol/l，以3.5％盐酸为溶剂)，反应3min后，以蒸馏水为空白，在484nm测定吸光度at样品，在相同条件下用空白混合反应液代替样品混合反应液，测定吸光值at空白，计算抑制率＝100％×[1-(at样品-a0样品)/(at空白-a0空白)]

3、试验结果

表3薯莨提取物对dpph的清除率

表4薯莨提取物对亚油酸过氧化的抑制率