一种新型肿瘤疫苗的制备方法与流程

本发明涉及抗肿瘤技术领域，尤其涉及一种新型肿瘤疫苗的制备方法。

背景技术：

随着肿瘤基因组学和免疫学的快速发展，免疫疗法已成为继放射治疗、化疗、手术治疗后的第四种治疗手段。放化疗的靶向性差，容易损伤正常细胞，产生不良反应。而免疫治疗能够特异性的识别肿瘤细胞表面的抗原，靶向杀伤肿瘤细胞的同时减少副反应的发生。在免疫治疗中，肿瘤疫苗是近年来研究的热点之一。肿瘤疫苗通过表达特异性的、具有免疫原性的肿瘤抗原，如肿瘤细胞裂解液、肿瘤相关蛋白或抗原多肽以及表达肿瘤抗原的相关基因等，在细胞因子、趋化因子等佐剂的辅助下激活机体免疫系统产生特异性抗肿瘤细胞免疫效应，增强机体的抗癌能力，阻止肿瘤的生长、扩散和复发，以达到清除或控制肿瘤的目的。

目前临床上已经获批的肿瘤疫苗包括树突状疫苗(dc疫苗)、宫颈癌疫苗及个体化sipuleucel-t疫苗，但是这些疫苗激活效率低、抗原少，临床疗效欠佳且价格昂贵，在一定程度上限制了其在临床上的大规模使用。次氯酸(hclo)是一种有效的氧化剂，在急性炎症期由中性粒细胞髓过氧化物酶(mpo)催化过氧化氢(h2o2)和氯离子(cl)产生。除了强大的杀伤作用外，有研究显示，hclo能够显著增加蛋白抗原的免疫原性。经hclo氧化后的蛋白更容易被抗原提呈细胞(apc)吞噬并提呈给t细胞，促进t细胞的活化和增殖，增强机体的免疫杀伤作用。因此，如何有效利用hclo氧化肿瘤细胞后的强大免疫激活效应，增强机体的抗肿瘤能力，仍需要进一步去探索。免疫佐剂主要用来辅助抗原诱导机体产生免疫反应，它可以为t细胞的活化提供第二信号，是疫苗开发的一部分。人工合成的含有非甲基化cpg基序的寡聚核苷酸链(cpg-odn)是一种水性佐剂，自身无免疫原性，能提高蛋白抗原的免疫原性，直接激活单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞并刺激这些细胞分泌il-12、tnf-α、ifn-γ等细胞因子，诱导th1型免疫应答。同时它还协同激活t细胞。因此，cpgodn可作为多种抗原的免疫佐剂而发挥独特的免疫增强作用。因此，开发一种免疫激活能力强、抗原谱广泛、制备工艺简单的疫苗，成为亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种新型肿瘤疫苗的制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

设计一种新型肿瘤疫苗的制备方法，由次氯酸(hclo)处理后的肿瘤细胞裂解液和免疫激活剂混合而成。

优选的，所述免疫激活剂具体为cpg。

优选的，所述的次氯酸(hclo)处理后的肿瘤细胞裂解液的制备方法，具体步骤如下：

1)：获得新鲜肿瘤组织后进行原代肿瘤细胞培养，并获得原代肿瘤细胞；

2)：用次氯酸(hclo)处理原代肿瘤细胞，收集次氯酸(hclo)处理细胞后得到的上清液，获得所需裂解液和凋亡的肿瘤细胞碎片混合物；

3)：将所述步骤2)得到的裂解液进行离心，并反复浓缩和纯化，即得到含有肿瘤细胞裂解液的浓缩液；

4)：将所述步骤3)中得到的纯化浓缩后的肿瘤细胞裂解液进行放疗灭活，即得到所述的肿瘤细胞裂解液。

优选的，在步骤1)中的肿瘤组织为自体离体肿瘤组织。

优选的，在步骤2)中的次氯酸(hclo)处理前，需要用hbss平衡盐溶液清洗肿瘤细胞2-3遍，次氯酸(hclo)处理时的浓度为60-80μm，所述上清液收集时间为次氯酸(hclo)处理后2小时。

优选的，在步骤3)中对裂解液进行离心时，所使用的离心机转速为1000r，且离心时间为5min，离心后弃掉离心管底部的细胞碎片。

优选的，在步骤4)中对裂解液进行纯化浓缩时，将离心后的上清液转移至超滤管内管，采用定角转子离心机，转速为6000*g，离心时间为20min，离心后用200μl枪头轻轻吹打浓缩液，向浓缩管内管加入3-5ml超纯水，再次离心6000*g，且时间为20min，最终得到的浓缩液体积约为300ul，即为含有肿瘤细胞裂解液的浓缩液。

优选的，还需采用放疗技术对纯化浓缩后的肿瘤细胞裂解液进行放疗灭活，且放疗剂量为20gy，放疗灭活后即得到所述的肿瘤细胞裂解液。

优选的，将肿瘤细胞裂解液和cpg水溶液混合，cpg水溶液的终浓度为1-2mg/ml，cpg水溶液的溶剂为去离子水。

优选的，所述的肿瘤细胞裂解液的浓度约为20-80μg/ml。

本发明提出的一种新型肿瘤疫苗的制备方法，有益效果在于：

1、自体来源的微颗粒制得的药剂具有较好的生物安全性和生物相容性。

2、本发明采用放疗技术灭活，在保证肿瘤细胞免疫原性的情况下，使肿瘤细胞丧失活性，避免使用过程中诱导肿瘤的发生。

3、制备工艺简单，便于规模化生产。

4、本发明可用于解决普通肿瘤抗原疫苗免疫原性低，不精确，免疫反应激活效率低下的问题。

附图说明

图1为对dc细胞的激活能力评估结果的示意图。

图2为预防治疗抗肿瘤能力评估的示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

本发明提供了一种新型肿瘤疫苗的制备方法，由次氯酸(hclo)处理后的肿瘤细胞裂解液和免疫激活剂混合而成，且所述免疫激活剂具体为cpg。

所述的次氯酸(hclo)处理后的肿瘤细胞裂解液的制备方法，具体步骤如下：

1)：获得新鲜肿瘤组织后进行原代肿瘤细胞培养，并获得原代肿瘤细胞，且肿瘤组织为自体离体肿瘤组织；

2)：用次氯酸(hclo)处理原代肿瘤细胞，在次氯酸(hclo)处理前，需要用hbss平衡盐溶液清洗肿瘤细胞2-3遍，次氯酸(hclo)处理时的浓度为60-80μm，所述上清液收集时间为次氯酸(hclo)处理后2小时，收集次氯酸(hclo)处理细胞后得到的上清液，获得所需裂解液和凋亡的肿瘤细胞碎片混合物；

3)：将所述步骤2)得到的裂解液进行离心，在对裂解液进行离心时，所使用的离心机转速为1000r，且离心时间为5min，离心后弃掉离心管底部的细胞碎片，并反复浓缩和纯化，即得到含有肿瘤细胞裂解液的浓缩液；

4)：将所述步骤3)中得到的纯化浓缩后的肿瘤细胞裂解液进行放疗灭活，在对裂解液进行纯化浓缩时，将离心后的上清液转移至超滤管内管，采用定角转子离心机，转速为6000*g，离心时间为20min，离心后用200μl枪头轻轻吹打浓缩液，向浓缩管内管加入3-5ml超纯水，再次离心6000*g，且时间为20min，最终得到的浓缩液体积约为300ul，即为含有肿瘤细胞裂解液的浓缩液。

还需采用放疗技术对纯化浓缩后的肿瘤细胞裂解液进行放疗灭活，且放疗剂量为20gy，放疗灭活后即得到所述的肿瘤细胞裂解液。

将肿瘤细胞裂解液和cpg水溶液混合，cpg水溶液的终浓度为1-2mg/ml，cpg水溶液的溶剂为去离子水。

所述的肿瘤细胞裂解液的浓度约为20-80μg/ml。

实施例2：

参照图1-2，评估新型肿瘤对dc细胞的激活：

从6-8周龄雄性c57小鼠股骨及胫骨获取骨髓干细胞，用含有m-csf的1640培养基培育5天获得未成熟的dc细胞后种植在24孔板中，分为pbs组、celllysate组(反复冻融法获得)、hclo-lysate组，各组取40μl对应的溶液与未成熟的dc细胞共孵育，刺激dc细胞成熟，24小时后利用流式细胞术检测cd11c、cd80、cd86细胞激活情况(如图1所示)，实验结果表明，具有新型肿瘤疫苗可以促进dc细胞的成熟。

实施例3：新型肿瘤疫苗预防治疗抗肿瘤效果研究

将c57小鼠随机分成3组，第一组小鼠尾根部+足垫注射50μlpbs、第二组尾根部+足垫注射50μlcelllysate、第三组尾根部+足垫注射50μlhclo-lysate，此时记录为第1天，隔天给药1次，共给药3次，第7天皮下种植恶性黑色素瘤细胞b16(2*10⁵/100μl/只)，定期监测存活情况，实验显示，新型肿瘤疫苗可以显著抑制肿瘤生长。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。