欧前胡素或含有欧前胡素的组合物在缓解砒霜或其他砷剂毒性中的应用的制作方法

本发明属于中药技术领域，尤其涉及欧前胡素或含有欧前胡素的组合物在缓解砒霜或其他砷剂毒性中的应用。

背景技术：

《本草纲目》记载砒霜“性辛，大热，有大毒”。现代研究表明三氧化二砷的吸收途径相当广泛，极易被呼吸系统、消化系统和皮肤吸收，既可致急性中毒，也可致慢性中毒，通过摄食发生急性砷中毒主要表现为胃肠症状和神经系统症状，入腹后1～2h(快者15～30min)即可出现症状，初见咽喉有烧灼感，流涎呕吐，继而出现阵发性或持续性腹痛，泻下粘液血便，或米汤样粪便，甚至血水样便，严重者可引起脱水、酸中毒及休克。中枢神经系统症状有头晕、头痛、烦躁不安、惊厥、昏迷、或胸闷气急、腹式呼吸消失等膈神经麻痹症状。死亡原因多为呼吸和循环衰竭。慢性砷中毒在消化系统的表现主要为胃肠功能障碍，胃镜可见胃黏膜充血、水肿和胃黏膜糜烂；如出现中毒性肝炎，其表现为急性黄疸、肝硬化和腹水等；中枢神经系统表现为脑电图异常、精神失常、语言不清、四肢抽搐等；呼吸系统表现为呼吸急促、胸闷、咳嗽等哮喘症状；循环系统出现心脏杂音、心脏肥大、心律不齐等；泌尿系统出现血尿；其它症状还有牙龈出血、口腔溃疡、血小板减少及全血细胞下降等。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供欧前胡素或含有欧前胡素的组合物在缓解砒霜或其他砷剂毒性中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了欧前胡素或其药学上可接受的盐在缓解砒霜或其他砷剂毒性中的应用。

本发明提供了含有欧前胡素或其药学上可接受的盐的药物组合物在缓解砒霜或其他砷剂毒性中的应用。

优选的，所述缓解砒霜或其他砷剂毒性包括砒霜或其他砷剂的慢性中毒，急性中毒的治疗和预防，以及与砷剂联合应用用于缓解砷剂毒性。

优选的，所述药物组合物含有一种或多种药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体包括稀释剂、粘合剂、吸收剂、崩解剂、分散剂、湿润剂、助溶剂、缓冲剂或表面活性剂。

优选的，所述药物组合物为固体形式、液体形式或气体形式，所述固体形式选自粉末剂、片剂、颗粒剂、丸剂、硬胶囊、软胶囊、乳膏剂、软膏剂、硬膏剂、凝胶剂、糊剂、散剂或贴剂；所述液体形式选自溶液剂、混悬剂、注射剂、糖浆剂、搽剂、乳剂、酊剂或酏剂；所述气体形式选自气雾剂、喷雾剂。

本发明提供了一种用于缓解砒霜或其他砷剂毒性的药物组合物，所述药物组合物含有欧前胡素作为活性成分以及一种或多种药学上可接受的载体。

优选的，所述药学上可接受的载体包括稀释剂、粘合剂、吸收剂、崩解剂、分散剂、湿润剂、助溶剂、缓冲剂和表面活性剂中的一种或多种。

优选的，所述药物组合物为固体形式、液体形式或气体形式，所述固体形式选自粉末剂、片剂、颗粒剂、丸剂、硬胶囊、软胶囊、乳膏剂、软膏剂、硬膏剂、凝胶剂、糊剂、散剂或贴剂；所述液体形式选自溶液剂、混悬剂、注射剂、糖浆剂、搽剂、乳剂、酊剂或酏剂；所述气体形式选自气雾剂、喷雾剂。

附图说明

图1为显示本发明欧前胡素对三氧化二砷引起的大鼠心肌细胞h9c2凋亡的保护作用。

具体实施方式

本发明提供的欧前胡素可进一步与药学上可接受的、可广泛使用本领域公知的各种载体组合使用。本发明的组合物可以利用本领域任何已知方法制成，以使病人用药后能提供快速、持久或缓慢释放的活性成分。

本领域技术人员能够理解，本发明的药物组合物可以根据具体的施用方式被配制成各种本领域熟知的制剂形式，例如口服剂型(粉剂、片剂、胶囊、软胶囊、口服溶液、糖浆、酏丸、散剂、囊剂、颗粒剂等)，或局部施用制剂(霜剂、乳膏、软膏、洗剂、凝胶、香脂、膏药、糊剂、喷雾剂、气雾剂等)，或注射制剂(溶液、悬浮剂、乳剂)。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明提供的欧前胡素可以通过各种途径施用至个体动物如哺乳动物(大鼠、小鼠、驯化动物或人类)，例如，给药可以是口服、直肠给药或经静脉、肌肉内、皮下、皮内、鞘膜内、硬膜外或脑室内注射。可通过注射、喷射、滴鼻、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其它物质混合或包裹后导入机体。

本发明进一步提供一种用于缓解砒霜或其他砷剂毒性的药物组合物，其含有欧前胡素作为活性成分以及一种或多种药学上可接受的载体，所述的载体可以包括稀释剂、粘合剂、吸收剂、崩解剂、分散剂、湿润剂、助溶剂、缓冲剂、和表面活性剂中的一种或多种。本发明的药物组合物可以为固体、液体或气体形式，其中所述固体形式可以为粉末剂、片剂、颗粒剂、丸剂、硬胶囊或软胶囊、乳膏剂、软膏剂、硬膏剂、凝胶剂、糊剂、散剂或贴剂；所述液体形式可以为溶液剂、混悬剂、注射剂、糖浆剂、搽剂、乳剂、酊剂或酏剂；所述气体形式可以为气雾剂、喷雾剂。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1,化合物的来源：

(1)as2o3，白色霜状粉末，购自国药集团化学试剂有限公司，批号20050908。课题组严格按照《危险化学品安全管理条例》的相关规定进行管理，单独存放、双人双发、双人保管。as2o3微溶于水，易溶于酸碱。取as2o330mg加入30mldmem中，加入少量naoh震荡至as2o3溶解后用hcl调整ph＝7.0。经0.22μm滤膜滤过除菌，成1000μg/ml母液，4℃保存备用。

(2)欧前胡素(imperatorin，c16h14o4)，无色针状结晶，购自中国食品药品检定研究院，批号110826-201214，国家药品标准物质(供含量测定用)。

2,细胞株的来源：大鼠胚胎心肌细胞，h9c2(2-1)，成肌细胞样，贴壁生长。购自北京协和医学院国家实验细胞资源共享平台。

实施例1

本发明欧前胡素保护as2o3引起的大鼠心肌细胞h9c2细胞的活力降低

实验材料：mtt购自美国amresco公司，批号20130808420。

实验过程：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐

(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-h-tetrazoliumbromide,

mtt)还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲臜沉积在细胞中，而死细胞无此功能。dmso能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在490nm处测定其od值，在一定细胞数范围内，mtt结晶量与活细胞数成正比。根据od值判断活细胞数量，od值越大，细胞活性越强。

步骤：

(1)取对数生长期的细胞，将细胞接种于96孔板内，5％co2，37℃孵育。

(2)细胞贴壁生长，待覆盖率约为80％-90％时，弃去原培养液，每孔加入100μl含2％胎牛血清的dmem培养液。

(3)分组给药：

仅三氧化二砷实验分组：对照组、as2o30.2μg/ml、as2o30.4μg/ml、as2o3

0.8μg/ml、as2o31.6μg/ml、as2o33.1μg/ml、as2o36.3μg/ml、as2o3

12.5μg/ml、as2o325μg/ml、as2o350μg/ml、as2o3100μg/ml；

三氧化二砷联合欧前胡素实验分组：对照组、as2o32μg/ml、欧前胡素10μg/ml1h+as2o32μg/ml24h、欧前胡素20μg/ml1h+as2o32μg/ml24h、欧前胡素30μg/ml1h+as2o32μg/ml24h、欧前胡素40μg/ml1h+as2o32μg/ml24h、欧前胡素50μg/ml1h+as2o32μg/ml24h、欧前胡素60μg/ml1h+as2o32μg/ml24h、欧前胡素70μg/ml1h+as2o32μg/ml24h、欧前胡素80μg/ml1h+as2o32μg/ml24h、欧前胡素90μg/ml1h+as2o32μg/ml24h、欧前胡素100μg/ml1h+as2o32μg/ml24h。

每组设8个复孔。5％co2，37℃孵育20小时，倒置显微镜(重庆重光，xds-1b型)下观察。

(3)每孔加入5mg/mlmtt溶液20μl，继续培养4h。

(4)终止培养，小心弃去孔内培养液，每孔加入150μldmso，振荡使结晶充分溶解，在酶标仪(rt-6000型，深圳雷杜生命科学股份有限公司生产)od490nm处测量各孔吸光度值。本实验重复3次。

(5)用spss进行单因素方差分析，p<0.05具有统计学意义。计算细胞增殖抑

制率：抑制率(％)＝(1─给药组平均od值/对照组平均od值)×100％，用spss计算ic50值。

实验结果：

1)仅三氧化二砷实验结果：as2o3剂量依赖性减弱细胞活力。as2o3对h9c2细胞的半数抑制浓度ic50＝3.081μg/ml。实验结果见表1。

3)三氧化二砷联合欧前胡素实验结果：欧前胡素浓度为20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/ml时，p≤0.05，与as2o3组有明显差异，其中欧前胡素50、60、70、80μg/ml组差异具有极显著意义(p≤0.01)。实验结果见表2。

表1mtt法测定as2o3对h9c2细胞细胞活力的影响(n＝8)

*与对照组比较p<0.05

表2mtt法测定欧前胡素对as2o3作用h9c2细胞的细胞活力的影响(n＝8)

*与as2o3组比较p<0.05；**与as2o3组比较p<0.01

实施例2

本发明欧前胡素保护as2o3引起的大鼠心肌细胞h9c2细胞的乳酸脱氢酶(ldh)的释放

实验材料：ldh测定试剂盒：购自南京建成生物工程研究所，批号20150104。

实验过程：乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,ldh)存在于活细胞胞浆内，正常生理情况下不能透过细胞膜，当细胞凋亡或坏死导致细胞膜通透性发生改变或细胞完全裂解的时候，ldh可释放至介质中。释放出来的ldh可催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸与2,4-二硝基苯肼在碱性条件下可生成红棕色的丙酮酸二硝基苯腙，在450nm处有一高吸收峰，利用读取的od值，经过计算可得ldh活性，考察细胞活力。

步骤：

(1)取对数生长期的细胞，将细胞接种于96孔板内，5％co2，37℃孵育。

(2)细胞贴壁生长，待覆盖率约为80％-90％时，弃去原培养液，每孔加入100μl含2％胎牛血清的dmem培养液。

(3)分组给药：①对照组、②as2o32μg/ml、③欧前胡素50μg/ml1h+as2o32μg/ml24h、④欧前胡素60μg/ml1h+as2o32μg/ml24h、⑤欧前胡素70μg/ml1h+as2o32μg/ml24h、⑥欧前胡素80μg/ml1h+as2o32μg/ml24h、⑦欧前胡素90μg/ml1h+as2o32μg/ml24h、⑧欧前胡素100μg/ml1h+as2o32μg/ml24h，每组设8个复孔，倒置显微镜下观察。(4)吸取细胞培养上清液，严格按照试剂盒说明书操作处理，在酶标仪(rt-6000型，深圳雷杜生命科学股份有限公司生产)od450nm处测定吸光度值。本实验重复3次。

(5)计算ldh活性：ldh活性(u/l)＝(测定孔od平均值─对照孔od平均值)/(标准孔od平均值─空白孔od平均值)×标准品浓度(0.2mmol/l)×1000

(6)用spss进行单因素方差分析，p<0.05具有统计学意义。

欧前胡素浓度为50、60、80、90、100μg/ml时，与as2o3组比较有统计学意义(p<0.05)，实验结果见表3。

表3微量酶标法测定欧前胡素对h9c2细胞乳酸脱氢酶(ldh)活性的影响(n＝8)

*与as2o3组比较p<0.05；**与as2o3组比较p<0.01

实施例3

本发明欧前胡素保护as2o3引起的大鼠心肌细胞h9c2细胞的凋亡

实验材料：ao/eb双染试剂盒：购自北京索莱宝科技有限公司，批号20150113。

实验过程：吖啶橙(acridineorange,ao)能透过胞膜完整的细胞，与dna结合后发出绿色荧光；溴化乙锭(ethidiumbromide,eb)仅能透过胞膜受损的细胞，与dna结合后发出橘红色荧光。凋亡的细胞呈现为染色增强，荧光更为明亮，呈均匀一致的圆珠状或固缩状、团块状结构；非凋亡细胞呈现荧光深浅不一的结构样特征，二者很容易判别。在荧光显微镜下观察，可见四种细胞形态：活细胞，核染色质着绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞，核染色质着绿色并呈圆珠状或固缩状；晚期凋亡细胞，核染色质为橘红色并呈圆珠状或固缩状；非凋亡的死亡细胞，核染色质着橘红色并呈正常结构。

步骤：

(1)取对数生长期的细胞，将细胞接种于6孔板专用细胞爬片上，5％co2，37℃孵育。

(2)细胞贴壁生长，待覆盖率约为80％-90％时，弃去原培养液，每孔加入100μl含2％胎牛血清的dmem培养液。

(3)分组给药：①对照组、②as2o32μg/ml、③欧前胡素100μg/ml1h+as2o32μg/ml24h；倒置显微镜下观察。

(3)将ao溶液和eb溶液按1:1混合成工作液，现用现配。

(4)弃去培养液，将细胞爬片用pbs洗两遍，以清除残余培养液和未贴壁细胞，加入新的pbs。每毫升pbs中加入20μl工作液，室温放置2～5min。

(5)取出细胞爬片，倒扣在载玻片上，于荧光显微镜(dmi3000b型，德国徕卡显微系统公司生产)下观察拍照，选择蓝光，激发波长450～490nm，发射波长515nm。本实验重复3次。

实验结果：ao/eb染色结果显示，as2o3显著增加h9c2细胞凋亡，细胞形态发生改变，胞体缩小，细胞核固缩或碎裂。欧前胡素、亥茅酚苷均显著减少细胞凋亡，细胞形态发生改变，胞体缩小、变圆，染色增强、荧光更为明亮，细胞核固缩或碎裂。实验结果见图1。

实施例4

本发明欧前胡素保护as2o3引起的大鼠心肌细胞h9c2细胞的caspase-3活性

实验材料：caspase-3活性检测试剂盒：购自南京建成生物工程研究所，批号20150406。

实验过程：caspase家族在as2o3诱导的细胞凋亡过程中发挥着重要作用，caspase-3是凋亡过程中的一个关键酶，在正常状态下以酶原的形式存在于胞浆中，没有活性；但在凋亡发生阶段被激活，裂解相应的底物最终导致细胞凋亡。将caspase-3特异性多肽与黄色基团耦联，当该底物被caspase-3剪切后，黄色基团游离，在405nm处有一高吸收峰，利用读取的od值，考察caspase-3的活化程度。

步骤：

(1)取对数生长期的细胞，将细胞接种于96孔板内，5％co2，37℃孵育。

(2)细胞贴壁生长，待覆盖率约为80％-90％时，弃去原培养液，每孔加入100μl含2％胎牛血清的dmem培养液。

(3)分组给药：①对照组、②as2o32μg/ml、③欧前胡素50μg/ml1h+as2o32μg/ml24h、④欧前胡素60μg/ml1h+as2o32μg/ml24h、⑤欧前胡素70μg/ml1h+as2o32μg/ml24h、⑥欧前胡素80μg/ml1h+as2o32μg/ml24h、⑦欧前胡素90μg/ml1h+as2o32μg/ml24h、⑧欧前胡素100μg/ml1h+as2o32μg/ml24h，每组设8个复孔，倒置显微镜下观察。

(4)弃去培养液，用pbs洗两遍以清除残余培养液和未贴壁细胞，用胰酶消化细胞，每孔加入50μl裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解30min。

(5)4℃离心，12000rpm，15min。小心吸取上清液，严格按照试剂盒说明书操作处理，在酶标仪od405nm处测定吸光度值。本实验重复3次。

(6)用spss进行单因素方差分析，p<0.05具有统计学意义。

实验结果：欧前胡素各组均p>0.05，与as2o3组无明显差异。实验结果见表4。

表4微量酶标法测定欧前胡素对h9c2细胞caspase-3活性的影响(n＝8)

实施例5

本发明欧前胡素保护as2o3引起的大鼠心肌细胞h9c2细胞的活性氧蓄积

实验材料：ros测定试剂盒：购自南京建成生物工程研究所，批号20150327。

实验过程：ros参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程，as2o3能通过多种渠道促进细胞内ros蓄积，对细胞产生氧化损伤，进而导致细胞凋亡或死亡。dcfh-da是迄今最常用、最灵敏的细胞内ros检测探针，灵敏度高，重复性好。dcfh-da没有荧光，进入细胞后被酯酶水解为dcfh，在活性氧存在时dcfh被氧化为不能透过细胞膜的强绿色荧光物质dcf，荧光在激发波长502nm，发射波长530nm附近有最大吸收，强度与细胞内ros水平成正比。

步骤：

(1)取对数生长期的细胞，将细胞接种于96孔板内，5％co2，37℃孵育。

(2)细胞贴壁生长，待覆盖率约为80％-90％时，弃去原培养液，每孔加入100μl含2％胎牛血清的dmem维持液。

(3)分组给药：①对照组、②as2o32μg/ml、③欧前胡素50μg/ml1h+as2o32μg/ml24h、④欧前胡素60μg/ml1h+as2o32μg/ml24h、⑤欧前胡素70μg/ml1h+as2o32μg/ml24h、⑥欧前胡素80μg/ml1h+as2o32μg/ml24h、⑦欧前胡素90μg/ml1h+as2o32μg/ml24h、⑧欧前胡素100μg/ml1h+as2o32μg/ml24h，每组设8个复孔，倒置显微镜下观察。

(4)弃去培养液，用pbs洗两遍以清除残余培养液和未贴壁细胞。每孔加入10mdcfh-da100μl，5％co2，37℃孵育30-45min。

(5)弃去上清液，用pbs洗两遍以清除细胞外未负载的残余荧光染料。用胰酶消化细胞，加入pbs终止消化，制成细胞悬液，在荧光酶标仪激发波长500nm，发射波长525nm处测定吸光度值。本实验重复3次。

(6)用spss进行单因素方差分析，p<0.05具有统计学意义。

实验结果：亥茅酚苷各组均p＞0.05，与as2o3组无明显差异。欧前胡素50、60μg/ml组p＜0.05，与as2o3组有明显差异。实验结果见表5。

表5化学荧光法测定欧前胡素对h9c2细胞活性氧(ros)含量的影响(n＝8)

*与as2o3组比较p<0.05

下文将列出本发明组合物的构成方法和辅料的种类，但本发明不限于它们。代表性的制备实施例叙述如下。

注射剂的制备

欧前胡素1000微克

偏亚硫酸氢钠3.0毫克

对羟基苯甲酸甲酯0.8毫克

对羟基苯甲酸丙酯0.1毫克

注射用蒸馏水适量

注射剂的制备如下：溶解活性组分，控制ph值至约7.5，然后将所有组分填充至2毫升安瓿中，并用常规的注射剂制备方法灭菌。

粉末剂的制备

欧前胡素200微克

玉米淀粉100毫克

乳糖100毫克

滑石粉10毫克

粉末剂制备方法如下：将上述组分混合，装入密封包装中。

片剂的制备

欧前胡素100微克

玉米淀粉100毫克

乳糖100毫克

硬脂酸镁适量

片剂是通过将上述组分混合和压片制得。

胶囊剂的制备

欧前胡素50微克

乳糖50毫克

玉米淀粉50毫克

滑石粉2毫克

硬脂酸镁适量

胶囊剂制备是通过将上述组分混合装入按照常规的明胶制备方法制备的明胶胶囊中制得。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。