一种载VEGF的壳聚糖温控凝胶及其制备方法和应用与流程

本发明属于再生医学技术领域，具体涉及一种载vegf的壳聚糖温控凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

牙髓是牙齿中富含神经、血管的组织，提供牙齿主要的营养和感觉来源。牙本质是牙齿硬组织的主要成分。结构上，牙本质包绕牙髓组织，传导外界刺激和保护牙髓组织。由于牙本质与牙髓组织在胚胎发生及功能上的密切关系，将两者合并称为牙髓牙本质复合体(pulpo-dentinalcomplex)。

牙髓牙本质复合体具有一定的自我修复和再生功能，这源于牙髓组织近牙本质侧一群具有自我增殖和多向分化能力的细胞，即牙髓干细胞。在牙本质组织缺损、牙髓受到刺激时，根据牙本质剩余厚度及外界刺激大小形成一系列的防御和(或)反应性变化。其中首先发生的反应即修复性牙本质(reparativedentin)的形成。其关键原理在于激活牙髓中的牙髓干细胞分化形成成牙本质细胞，分泌并矿化形成的新的牙本质组织。因此，牙髓牙本质复合体的存在是活髓保存的重要组织生理学基础。基于该原理，牙髓切断术是口腔医学中重要的活髓保存治疗方法。

牙髓牙本质复合体中的牙髓干细胞具有潜在的成牙本质向分化能力，为提高修复性牙本质形成能力提供了可行的理论基础。目前已有基于组织工程学的原理，将药物(或生长因子)与各类型载体(或支架材料)结合，组成新型生物材料并运用于骨、牙等硬组织再生。但目前所应用于组织工程的生物材料不能完全满足现代医药的需求，性能还有待进一步提高。

技术实现要素：

本发明的目的在于：提供一种载vegf的壳聚糖温控凝胶及其制备方法和应用，选用血管内皮生长因子(vegf)做为研究对象，vegf/壳聚糖(cs)/β-甘油磷酸(β-gp)缓释系统做为vegf的缓释载体，可以持续释放vegf，发挥促进人牙髓干细胞(dpscs)增殖及成牙本质向分化的作用，为其作为盖髓材料应用于牙髓切断术提供了理论基础。

本发明采用的技术方案如下：

一种载vegf的壳聚糖温控凝胶的制备方法，包括以下步骤：

s1.将壳聚糖粉末加入0.4-0.6vt％稀醋酸溶液中，搅拌至溶解，密封于4℃过夜，制得壳聚糖溶液；

s2.将β-甘油磷酸粉末溶于水，制得β-甘油磷酸水溶液；

s3.将s2步骤制得的β-甘油磷酸水溶液加入s1步骤制得的壳聚糖溶液中，冰浴搅拌均匀后获得凝胶，置于4℃保存；

s4.将vegf加入s3步骤制得的凝胶中，冰浴搅拌均匀，即得。

进一步地，s1步骤制得的每100ml壳聚糖溶液中壳聚糖的质量为2-3g；优选为2g。

进一步地，s2步骤制得的每100mlβ-甘油磷酸水溶液中β-甘油磷酸的质量为55-58g；优选为56g。

进一步地，s3步骤中β-甘油磷酸水溶液与壳聚糖溶液的体积比为1:4-6；优选为1:5。

进一步地，s4步骤制得的载vegf的壳聚糖温控凝胶中vegf的浓度为90-110ng/ml；优选为100ng/ml。

采用上述的制备方法制备得到的载vegf的壳聚糖温控凝胶。

进一步地，在4℃下为溶胶态，具有一定流动性；在37℃下10-15min，由溶胶态转变为凝胶态，不再具有流动性，呈现固体凝胶状态。

上述的载vegf的壳聚糖温控凝胶在促进人牙髓干细胞增殖中的应用。

上述的载vegf的壳聚糖温控凝胶在促进人牙髓干细胞成牙本质向分化中的应用。

上述的载vegf的壳聚糖温控凝胶在制备牙髓切断术用盖髓材料中的应用。

甲壳素是一种天然提取的生物多糖高分子物质,广泛存在于海洋生物的甲壳中，具有良好的生物相容性。壳聚糖做为甲壳素的提取衍生物是一种天然的线性多糖，具有生物相容性、无毒性、低致敏性、抗菌性和可生物降解性等良好的生物学特点。壳聚糖因具有良好的生物相容性、抗菌性及消炎特性而被口腔医学领域的各学科广泛研究。在口腔外科学已有口腔重建/牙种植体相关的骨再生、新的骨替代材料的相关研究；在口腔预防及口腔内科学中，壳聚糖被尝试应用于漱口剂、牙膏、给药系统、根管充填及盖髓材料的研制；另外在口腔修复学、口腔正畸学也有其相关研究。迄今为止的基础研究结果显示，壳聚糖可以被修饰成许多形式，包括转化为纳米粒子、微球、纳米纤维、多孔支架、薄膜及凝胶等多种形式，且目前已有许多将壳聚糖材料结合细胞因子用于成骨方面的研究。这些研究共同证明壳聚糖温控凝胶做为一种载体材料具有良好的生物学特性。

血管内皮生长因子(vegfs)及其受体(vegfrs)可以在不同的组织中表达，参与调节包括代谢、细胞增殖、迁移在内的多种反应。血管内皮生长因子可以通过调节血管形成和血管通透性，参与许多血管生成依赖性疾病的发病及进展，包括癌症、某些炎性疾病以及糖尿病视网膜病变等。vegf除了在血管内皮细胞的血管生成中发挥作用外，还可以直接影响骨祖细胞(osteogeniccell)的迁移和分化，在骨发育、再生和修复的过程中促进成骨细胞生成，增强成骨细胞活性，增加矿化结节形成以及刺激前成骨细胞中骨特异性基因的表达。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、本发明所制得的凝胶在4℃呈现具有流动性的溶胶态，在37℃下呈现固体的凝胶态，为温控型凝胶；

2、本发明制得的凝胶在电镜下呈现疏松多孔的状态，且vegf可以从该缓释载体中释放至周围环境中，释放曲线缓和，释放情况稳定；

3、通过细胞定植、毒性、增殖检测结果显示dpscs可以粘附在本发明制得的凝胶表面，该凝胶对dpscs无细胞毒性，细胞保持良好的活性且细胞的增殖活性增加；

4、通过基因及蛋白表达层面进行相关检测结果显示本发明制得的凝胶可以促进dpscs的成牙本质向分化，为其作为盖髓材料应用于牙髓切断术提供了理论基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1制得的凝胶的显微镜及扫描电镜图；

图2为凝胶载vegf的缓释情况图；

图3为牙髓干细胞(dpscs)表面标志物图；

图4为凝胶表面培养dpscs图；

图5为ao/eb荧光染色检测凝胶的细胞毒性显微镜图；

图6为cck-8检测的dpscs增殖活性的吸光度图；

图7为凝胶促进dpscs成牙本质向分化实验的矿化结节图；

图8为半定量实时荧光pcr技术检测成牙向分化关键基因表达结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本发明较佳实施例提供的一种载vegf的壳聚糖温控凝胶的制备方法，具体步骤如下：

s1.将壳聚糖粉末加入0.5vt％稀醋酸溶液中，搅拌3h，密封于4℃过夜，制得每100ml含有2g壳聚糖的溶液；

s2.将β-甘油磷酸粉末溶于水，制得每100ml含有56gβ-甘油磷酸的溶液，经0.22μm的过滤器过滤后，4℃保存备用；

s3.将s2步骤制得的β-甘油磷酸水溶液缓慢加入s1步骤制得的壳聚糖溶液中，壳聚糖溶液与β-甘油磷酸水溶液的体积比为5:1，冰浴搅拌10min后获得凝胶，置于4℃保存；

s4.将vegf加入s3步骤制得的凝胶中，冰浴搅拌10min，即得；其中，vegf浓度为100ng/ml。

实施例2

本发明较佳实施例提供的一种载vegf的壳聚糖温控凝胶的制备方法，具体步骤如下：

s1.将壳聚糖粉末加入0.4vt％稀醋酸溶液中，搅拌5h，密封于4℃过夜，制得每100ml含有2g的壳聚糖的溶液；

s2.将β-甘油磷酸粉末溶于水，制得每100ml含有55gβ-甘油磷酸的溶液，经0.22μm的过滤器过滤后，4℃保存备用；

s3.将s2步骤制得的β-甘油磷酸水溶液缓慢加入s1步骤制得的壳聚糖溶液中，壳聚糖溶液与β-甘油磷酸水溶液的体积比为4:1，冰浴搅拌10min后获得凝胶，置于4℃保存；

s4.将vegf加入s3步骤制得的凝胶中，冰浴搅拌10min，即得；其中，vegf浓度为90ng/ml。

实施例3

本发明较佳实施例提供的一种载vegf的壳聚糖温控凝胶的制备方法，具体步骤如下：

s1.将壳聚糖粉末加入0.6vt％稀醋酸溶液中，搅拌4h，密封于4℃过夜，制得每100ml含有2g壳聚糖的溶液；

s2.将β-甘油磷酸粉末溶于水，制得每100ml含有57gβ-甘油磷酸的溶液，经0.22μm的过滤器过滤后，4℃保存备用；

s3.将s2步骤制得的β-甘油磷酸水溶液缓慢加入s1步骤制得的壳聚糖溶液中，壳聚糖溶液与β-甘油磷酸水溶液的体积比为6:1，冰浴搅拌12min后获得凝胶，置于4℃保存；

s4.将vegf加入s3步骤制得的凝胶中，冰浴搅拌12min，即得；其中，vegf浓度为110ng/ml。

实验例

一、观察凝胶形态

将实施例1制得的凝胶真空冻干，于体式显微镜下观察，呈现疏松多孔状。

将样本切成薄层片状送样，经表面喷金处理后在扫描电镜下观察凝胶冻干后的形态。扫描电镜视野下凝胶呈现疏松多孔状结构，孔隙直径约在100-200μm。

二、凝胶加载vegf缓释情况

利用elisa技术检测实施例1制得凝胶浸提液中vegf的浓度。

(1)使用前将样本(vegf/cs/β-gp凝胶)、试剂缓慢均衡至室温并混匀，避免产生泡沫；

(2)根据实验孔(空白和标准品)数量，确定所需的板条数目；

(3)加入标准品：参照说明书，使用试剂盒中的dilutionbuffer(1x)稀释溶解干粉，其浓度为2000pg/ml。每个孔内依次加入100μl的标准品稀释液，浓度如下：2000pg/ml，1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.3pg/ml，0pg/ml；

(4)每孔加入100μl样本至样本孔；

(5)盖上封板膜，室温(18-25℃)孵育2小时；

(6)洗板：扣去孔内液体，每孔加入300μlwashingbuffer(1x)工作液，停留1分钟后弃去孔内液体，重复3次，每一次均在滤纸上扣干；

(7)加检测抗体：每孔加入100μlbiotinylatedantibody工作液，盖上封板膜(室温18-25℃)，孵育2小时；

(8)洗板：同步骤6；

(9)每孔加入100μlstreptavidin-hrp，盖上封板膜，室温孵育20分钟；

(10)洗板：同步骤6；

(11)显色每孔加入100μltwb，室温避光孵育5-30分钟，根据孔内颜色的深浅(深蓝色)来判定终止反应；

(12)读板：终止反应后10分钟内使用酶标仪读值(检测波长：450nm)，分析数据。

结果如图2显示，在第1天至第5天内vegf的累计释放量近似线性上升，6天-8天释放曲线缓和，约在第8天vegf的累计释放量达到顶峰，维持在大致稳定的状态。vegf每天的释放量在前5天释放约2％，第6天开始每日释放量下调，可能与vegf总量的下降有关。

三、原代培养人牙髓干细胞

原代培养人牙髓细胞(dpscs)，采用流式细胞术检测牙髓细胞表面标志物。

结果如图3所示，99.9％细胞呈cd90阳性、cd29阳性、cd34阴性、cd45阴性标记，具有间充质干细胞的特性。

四、凝胶表面培养dpscs

(1)nc培养基培养dpscs；

(2)待细胞生长达到一定密度后，吸净培养基，pbs轻柔洗涤3次，加入适量胰酶37℃消化2分钟，nc培养基中和后离心，吸净上层液体，加入新的nc培养基制成单细胞悬液；

(3)细胞计数：取10μl单细胞悬液与10μl台盼蓝试剂混合后于细胞计数仪进行细胞计数；

(4)铺胶：将实施例1制得的凝胶预先铺于6孔板孔底，每孔1ml，待37℃孵育成胶；

(5)铺板：加入适量培养基浸泡凝胶3次，每次10分钟；将dpscs以1×106个/孔的密度接种于6孔板中的凝胶表面；

(6)nc培养基培养24小时后吸去培养基，pbs轻柔洗涤3次，用2.5％的戊二醛室温下固定4小时；

(7)依次于30％、50％、75％、85％、95％、100％的梯度酒精中脱水处理，每个浓度的酒精停留15分钟，最后吸去100％的酒精，过夜干燥；

(8)从6孔板皿底收集样本，切成小块，送样喷金，进行扫描电镜下的观察并采图。

如图4所示，凝胶表面培养dpscs24小时，microct观察dpscs呈梭形结构，细胞突触深入凝胶多孔结构中，具有良好的附着。

五、凝胶对细胞的毒性检测

以无凝胶共培养的dpscs作为对照组，实施例1制得凝胶共培养dpscs作为实验组。

(1)nc培养基培养dpscs；细胞生长达到一定密度后，吸净培养基，pbs轻柔洗涤3次，加入适量胰酶37℃消化2分钟，nc培养基中和后离心，吸净上层液体，加入新的nc培养基制成单细胞悬液；

(2)细胞计数：取10μl单细胞悬液与10μl台盼蓝试剂混合后于细胞计数仪进行细胞计数；

(3)铺胶：将实施例1制得的凝胶预先铺于6孔板孔底，每孔1ml，待37℃孵育成胶，成胶后加入适量培养基浸泡凝胶3次，每次10分钟；

(4)铺板：将dpscs以1×106个/孔的密度接种于6孔板中的凝胶表面，此为实验组；在不包含凝胶的6孔板内直接将细胞铺于皿底，为对照组；

(5)nc培养基培养24小时后吸净培养基，用pbs溶液轻柔洗涤3次；按照ao/eb染色试剂盒说明书配制染色缓冲液；吸去6孔板中的pbs溶液，每孔加入1ml染色缓冲液、10μlao试剂、10μleb试剂，轻轻混匀后避光孵育10-20分钟；

(6)染色完成后，pbs溶液轻柔洗涤3次，荧光显微镜观察并采图。

结果如图5所示，ao/eb双荧光染色检测细胞的形态、分布和活性。有活性的细胞呈绿色或黄绿色，凋亡细胞呈红色或橘色。研究发现两组细胞凋亡水平无明显差异，大部分细胞在凝胶表面具有良好的活性。

六、凝胶促进dpscs增殖

在实施例1制得的凝胶表面培养dpscs，cellcountingkit-8(cck-8)检测。

(1)实验分组：nc组、凝胶组、凝胶浸提液组；

(2)铺板前一天于无菌条件下制作凝胶组，并开始收集凝胶浸提液；

(3)nc培养基培养第3代dpscs；细胞生长达到一定密度后，吸净培养基，pbs轻柔洗涤3次，加入适量胰酶37℃消化2分钟，nc培养基中和后离心，吸净上层液体，加入新的nc培养基制成单细胞悬液；

(4)细胞计数：取10μl单细胞悬液与10μl台盼蓝试剂混合后于细胞计数仪进行细胞计数；

(5)铺胶：将实施例1制得的凝胶预先铺于96孔板孔底，每孔100μl，待37℃孵育成胶，成胶后加入适量培养基浸泡凝胶3次，每次10分钟；

(6)铺板：将dpscs以2000个/孔的密度分别接种于96孔板中的凝胶表面加入nc培养基培养(凝胶组)；不包含凝胶的96孔板内加入凝胶浸提液培养(浸提液组)；不包含凝胶的96孔板皿底，加入nc培养基培养(nc组)；每组设置3个复孔以消除组内误差；分别于培养1天、3天、5天、7天后进行cck-8实验；

(7)吸净孔内培养基，用pbs溶液轻柔洗涤3次；按照cck-8试剂盒说明书进行实验，吸去96孔板中的pbs溶液，每孔加入10μlcck-8检测试剂，轻轻混匀后避光孵育2小时；

(8)用酶标仪测定在450nm处的吸光度，分析数据。

结果如图6所示，相比于没有凝胶共培养的细胞，凝胶中培养的细胞在第5天至第7天时增殖活性增加。提取凝胶浸提液培养dpscs，cck-8检测同样发现dpscs活性增强。

七、凝胶促进dpscs成牙本质向分化

在transwell培养皿中实施例1制得的凝胶与dpscs共培养，且进行矿化诱导(odontogenicmedium,om)。直接加入100ng/mlvegf重组蛋白的dpscs细胞矿化诱导组作为实验对照组。只进行矿化诱导(om组)和不进行矿化诱导(nc组)为阴性对照组。

alp和茜素红染色实验发现，加入vegf促进矿化结节的分泌。然而，vegf加载在cs/β-gp凝胶中，能更好的促进dpscs成牙本质向分化，在第10天和第14天显示出更多的矿化结节的产生(图7)。由此提示vegf/cs/β-gp凝胶系统相比于一次性加入等量vegf能更好的促进dpscs分化。进一步采用半定量实时荧光pcr技术检测成牙向分化关键基因runx2、ocn、osx、alp、dspp的表达，证实vegf/cs/β-gp凝胶系统能最佳的促进dpscs成牙本质向分化基因的表达(图8a-e)。蛋白印迹(westernblot，wb)技术检测发现vegf/cs/β-gp凝胶系统共培养的dpscs分泌更多的osx蛋白，进一步证明了vegf/cs/β-gp凝胶系统促进细胞分化的能力(图8f,g)。

目的基因qrt-pcr引物序列表：

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>四川大学

<120>一种载vegf的壳聚糖温控凝胶及其制备方法和应用

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

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<213>人工序列(artificialsequence)

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