鞭毛蛋白衍生多肽CBLB502在防治急性肺损伤的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，特别涉及鞭毛蛋白衍生多肽cblb502在防治急性肺损伤的应用。

背景技术：

社会工业化进程带来严重环境污染，尤其是雾霾现象已成为重要的公共卫生问题。肺与外界环境直接相通，在没有物理防护的情况下，是雾霾损伤的主要器官。事实表明，雾霾可造成呼吸系统疾病产生和加重，发病率和死亡率升高。雾霾致肺损伤包括物理性肺损伤(无机不降解颗粒物造成的肺损伤)，化学性肺损伤(可溶性成分和有机物造成的肺损伤，如二氧化硫形成酸雾致酸性肺损伤)，以及生物性肺损伤(雾霾颗粒携带的病原体导致的肺感染损伤)。雾霾的组成成分复杂，包括气体、液体和固体成分。北京市环境保护监测中心的空气质量观测结果表明，北京雾霾pm2.5的化学组成主要为二次无机盐(硫酸盐、硝酸盐和铵盐)、有机物等和未知组分，其中二次无机盐所占比例最高为42％，是导致酸性肺损伤的重要因素。此外，酸性胃内容物误吸也可以导致酸性急性肺损伤(ali)，是临床上围手术期和麻醉期常见的并发症，严重的ali最终可发展成为急性呼吸窘迫综合征(ards)，死亡率高达40％以上，成为临床中常见的呼吸系统危重急症。目前，针对ali/ards的主要治疗手段有机械通气辅助治疗、糖皮质激素激素药物治疗等，但治疗效果均不理想，病死率高居不下。

目前国内外普遍采用盐酸(hcl)吸入性ali动物模型模拟雾霾酸性物质吸入以及临床上酸性胃内容物吸入性急性肺损伤。cblb502是美国人于2008年首先发现，其来自于沙门氏菌鞭毛蛋白，经过结构改造，与鞭毛蛋白相比，极大降低了免疫原性，我们的研究表明cblb502具有非常好的辐射防护作用(王磊等，toll样受体5激动剂cblb502蛋白的辐射防护作用，国际药学研究杂志，2012，39(3)：225)。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种鞭毛蛋白衍生多肽cblb502在防治急性肺损伤的应用。

第一方面，本发明要求保护cblb502蛋白或其相关生物材料在制备用于预防和/或治疗急性肺损伤的产品中的应用。

所述相关生物材料为能够表达所述cblb502蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

所述cblb502蛋白为如下任一所示蛋白质：

(a1)氨基酸序列为seqidno.1的蛋白质；

(a2)将seqidno.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(a3)与(a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。

上述蛋白质中，所述标签是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。

第二方面，本发明要求保护cblb502蛋白或其相关生物材料在制备产品中的应用；所述产品具有如下用途中的全部或部分：

(b1)减轻急性肺损伤导致的肺组织损伤程度；

(b2)抑制急性肺损伤导致的肺水肿；

(b3)降低急性肺损伤导致的肺泡上皮屏障损伤程度和/或降低急性肺损伤导致的肺泡上皮通透性增强程度；

(b4)改善急性肺损伤导致的肺组织抗氧化能力降低的情况。

所述相关生物材料为能够表达所述cblb502蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。所述cblb502蛋白为前文(a1)-(a4)任一所示蛋白质。

在所述(b3)中，所述肺泡上皮通透性可体现为肺泡上皮对细胞和/或蛋白的通透性。

在第二方面中，所述产品的所述用途可为预防性用途，也可为治疗性用途。在本发明的具体实施方式中，具体为预防性用途。

第三方面，本发明要求保护cblb502蛋白或其相关生物材料在制备产品中的应用；所述产品具有如下用途中的全部或部分：

(c1)降低急性肺损伤导致的肺湿干比升高程度；

(c2)降低急性肺损伤导致的肺泡灌洗液中总细胞数升高程度；

(c3)降低急性肺损伤导致的肺泡灌洗液中总蛋白含量升高程度；

(c4)提高急性肺损伤导致的肺组织中超氧化物歧化酶含量降低程度；

(c5)降低急性肺损伤导致的肺组织中髓过氧化物酶含量升高程度。

所述相关生物材料为能够表达所述cblb502蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。所述cblb502蛋白为前文(a1)-(a4)任一所示蛋白质。

在第三方面中，所述产品的所述用途可为预防性用途，也可为治疗性用途。在本发明的具体实施方式中，具体为预防性用途。

在第一至第三方面中，所述急性肺损伤可为酸性急性肺损伤(即酸性物质吸入性急性肺损伤)。

进一步地，所述酸性肺损伤可为雾霾所致酸性急性肺损伤或者酸性胃内容物误吸所致酸性急性肺损伤。

在本发明的具体实施方式中，所述酸性肺损伤具体为盐酸吸入性急性肺损伤。

在前文各方面中，所述“能够表达所述cblb502蛋白的核酸分子”可为如下任一所述的dna分子：

(d1)seqidno.2所示的dna分子；

(d2)在严格条件下与(d1)限定的dna分子杂交且编码所述cblb502蛋白的dna分子；

(d3)与(d1)或(d2)限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述cblb502蛋白的dna分子。

上述核酸分子中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5mna3po4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，2×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mna3po4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mna3po4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mna3po4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mna3po4和1mmedta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；也可为：在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。

在前文各方面中，所述产品均具体可为药物。

在前文各方面中，所述急性肺损伤为哺乳动物的急性肺损伤。所述哺乳动物具体如人或鼠。

在前文各方面中，所述cblb502蛋白可在发生前文所述急性肺损伤前0.5h经腹腔注射，注射用量可为0.2mg/kg体重。

本发明研究发现，cblb502可以显著抑制酸性物质吸入性急性肺损伤综合征的症状。本发明采用雾化给药系统对小鼠给予盐酸喷雾，建立模拟雾霾酸性肺损伤及胃内容物吸入急性肺损伤小鼠模型，研究cblb502对盐酸吸入性肺损伤的防治作用。发现cblb502可以显著减轻盐酸吸入性肺损伤的组织损伤程度，降低肺湿干比、肺泡灌洗液中的总细胞数、分泌蛋白量，以及肺组织的超氧化物歧化酶sod和髓过氧化物酶mpo的水平，结果差异均具有统计学意义。上述结果提示cblb502可以作为生物技术药物用于预防和治疗酸性物质吸入性急性肺损伤，为雾霾致化学性肺损伤等的治疗提供新的思路和药物。

附图说明

图1为cblb502对盐酸吸入性肺损伤组织病理的影响(he病理切片)。

图2为cblb502对急性肺损伤小鼠的肺干湿比的影响。

图3为cblb502对急性肺损伤小鼠的肺泡灌洗液细胞总数的影响。

图4为cblb502对急性肺损伤小鼠的肺泡灌洗液总蛋白的影响。

图5为cblb502对急性肺损伤小鼠的肺组织中sod表达的影响。

图6为cblb502对急性肺损伤小鼠的肺组织中mpo表达的影响。

各图中，*表示p<0.05；**表示p<0.01。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的鞭毛蛋白衍生多肽cblb502，由军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所制备。其可以按照现有技术已知的方法制备，其具体的制备方法可参见申请号为201110257680.1的“一种重组细菌鞭毛蛋白衍生多肽的制备和活性鉴定方法”的专利申请，或来自于文献：王磊等，toll样受体5激动剂cblb502蛋白的辐射防护作用，国际药学研究杂志，2012，39(3)：225。cblb502蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示，其对应的编码基因序列如seqidno.2所示。

实施例1、cblb502对盐酸吸入性肺损伤组织病理的影响

6-8周c57bl/6小鼠，共15只，随机分为如下3组：对照组、模型组、模型给药组。每组5只。

模型组(hcl)：经雾化喷剂给药系统给予小鼠气管喷入ph1.5盐酸水溶液造成小鼠急性肺损伤，按体重2ml/kg给药。

模型给药组(hcl+cblb502)：腹腔注射0.2mg/kg体重的cblb502蛋白，0.5h后经雾化喷剂给药系统给予小鼠气管喷入ph1.5盐酸水溶液造成小鼠急性肺损伤，按体重2ml/kg给药。

对照组(con)：经雾化喷剂给药系统给予小鼠气管喷入水溶液，按体重2ml/kg给药。

在处理或给药后24h，处死各组小鼠，收集肺组织，进行he病理切片分析。

结果如图1所示。显示：对照组肺组织结构清晰，未见病变。hcl处理组局部肺组织间质弥漫性淋巴细胞浸润，局部炎症明显部位肺泡间隔轻度增厚。hcl+cblb502处理组肺组织间质弥漫性炎细胞浸润，炎细胞以淋巴细胞为主，局部可见少量中性粒细胞。以上结果表明模型组hcl处理造成急性肺损伤，而模型给药组可以显著减轻肺损伤。

实施例2、cblb502对急性肺损伤小鼠的肺干湿比的影响

6-8周c57bl/6小鼠，共20只，随机分为如下2组：模型组、模型给药组。每组10只。

模型组(hcl)：经雾化喷剂给药系统给予小鼠气管喷入ph1.5盐酸水溶液造成小鼠急性肺损伤，按体重2ml/kg给药。

模型给药组(hcl+cblb502)：腹腔注射0.2mg/kg体重的cblb502蛋白，0.5h后经雾化喷剂给药系统给予小鼠气管喷入ph1.5盐酸水溶液造成小鼠急性肺损伤，按体重2ml/kg给药。

模型组处理或模型给药组给药后，分别于0h和24h，处死各组小鼠，每个时间点5只/组，收集肺组织，称量肺组织湿重，将肺组织置于60℃烘箱内烘干72h至重量恒重，称量肺干重，计算肺湿重/干重的比值，评估各组肺组织水肿程度。

结果如图2所示。由图可见，hcl+cblb502处理组湿重干重比显著低于hcl组，说明cblb502处理抑制肺组织水肿程度。

实施例3、cblb502对急性肺损伤小鼠的肺泡灌洗液细胞总数的影响

6-8周c57bl/6小鼠，共20只，随机分为如下2组：模型组、模型给药组。每组10只。

模型组(hcl)：经雾化喷剂给药系统给予小鼠气管喷入ph1.5盐酸水溶液造成小鼠急性肺损伤，按体重2ml/kg给药。

模型给药组(hcl+cblb502)：腹腔注射0.2mg/kg体重的cblb502蛋白，0.5h后经雾化喷剂给药系统给予小鼠气管喷入ph1.5盐酸水溶液造成小鼠急性肺损伤，按体重2ml/kg给药。

模型组处理或模型给药组给药后，分别于6h和24h处死小鼠，每个时间点5只/组，用剪刀暴露气管，通过气管将500μl预冷的pbs冲入肺中并计时1min，然后回收，连续冲洗3次。将回收的肺泡灌洗液于4℃，1500rpm离心10min，然后重悬细胞进行总细胞计数。

结果如图3所示。由图可见，hcl+cblb502处理组肺泡灌洗液中的细胞总数显著低于hcl组，说明cblb502处理可以显著抑制小鼠肺泡上皮屏障的损伤程度，降低肺泡上皮对细胞的渗透程度。

实施例4、cblb502对急性肺损伤小鼠的肺泡灌洗液总蛋白的影响

6-8周c57bl/6小鼠，共15只，随机分为如下3组：对照组、模型组、模型给药组。每组5只。

模型组(hcl)：经雾化喷剂给药系统给予小鼠气管喷入ph1.5盐酸水溶液造成小鼠急性肺损伤，按体重2ml/kg给药。

模型给药组(hcl+cblb502)：腹腔注射0.2mg/kg体重的cblb502蛋白，0.5h后经雾化喷剂给药系统给予小鼠气管喷入ph1.5盐酸水溶液造成小鼠急性肺损伤，按体重2ml/kg给药。

对照组(con)：经雾化喷剂给药系统给予小鼠气管喷入水溶液，按体重2ml/kg给药。

对照组、模型组和模型给药组在24h处死小鼠，用剪刀暴露气管，通过气管将500μl预冷的pbs冲入肺中并计时1min，然后回收，连续冲洗3次。将回收的肺泡灌洗液于4℃，1500rpm离心10min，吸取50μl测定肺泡灌洗液的总蛋白浓度。

结果如图4所示。由图可见，hcl+cblb502处理组肺泡灌洗液中的总蛋白含量显著低于hcl组，说明cblb502处理可以显著抑制肺泡上皮对蛋白的渗透程度。

实施例5、cblb502对急性肺损伤小鼠的肺组织中sod表达的影响

6-8周c57bl/6小鼠，共20只，随机分为如下2组：模型组、模型给药组。每组10只。

模型组(hcl)：经雾化喷剂给药系统给予小鼠气管喷入ph1.5盐酸水溶液造成小鼠急性肺损伤，按体重2ml/kg给药。

模型给药组(hcl+cblb502)：腹腔注射0.2mg/kg体重的cblb502蛋白，0.5h后经雾化喷剂给药系统给予小鼠气管喷入ph1.5盐酸水溶液造成小鼠急性肺损伤，按体重2ml/kg给药。

模型组处理或模型给药组给药后，分别于0h和24h，处死各组小鼠，每个时间点5只/组，收集肺组织，精确称取肺组织重量，匀浆，按照sod检测测试盒(北京碧云天生物科技公司)说明书操作，在紫外分光度计450nm处测量吸光度值。

sod检测过程：

(1)样品准备

取适量的肺脏组织样品，加入4℃预冷的pbs进行匀浆。随后匀浆液4℃离心，取上清作为待测样品。

(2)wst-8/酶工作液配制

按照每个反应160μl配制适量wst-8/酶工作液。均匀混合151μlsod检测缓冲液、8μlwst-8和1μl酶溶液，即可配制成160μlwst-8/酶工作液。根据待检测样品(包括标准品)数量，配制适量wst-8/酶工作液。

(3)反应启动工作液配制

把试剂盒中的反应启动液(40x)融解后混匀，按照每1μl反应启动液(40x)加入39μlsod检测缓冲液的比例进行稀释，混匀后即为反应启动工作液。根据待检测样品(包括标准品)数量，配制适量的反应启动工作液。

(4)sod标准品配制

用稀释液将sod标准品稀释至如下系列浓度：200u/ml、100u/ml、50u/ml、20u/ml、10u/ml、5u/ml和2u/ml。在随后的检测中可以各取20μl，参考样品进行检测。

(5)样品测定

参考表1使用96孔板设置样品孔和各种空白对照孔。并按表1依次加入待测样品和其它各种溶液。加入反应启动工作液后充分混匀，37℃孵育30min，在450nm测定吸光度(a)。

表1试剂添加程序

(6)样品中总sod活力的计算

抑制百分率＝[(a空白对照1-a空白对照2)-(a样品-a空白对照3)]/(a空白对照1-a空白对照2)×100％。

sod酶活力单位的定义：在上述反应中抑制百分率为50％时，反应体系中sod酶活力定义为一个酶活力单位(unit)。

结果如图5所示。由图可见，hcl+cblb502处理组肺组织中的sod活性显著高于hcl组，接近正常水平，说明cblb502处理可以显著提高肺组织的抗氧化能力。

实施例6、cblb502对急性肺损伤小鼠的肺组织中mpo表达的影响

髓过氧化物酶(mpo)的水平和活性直接反映中性粒细胞的功能和活化状态，是评价炎症严重程度的一个重要指标。

6-8周c57bl/6小鼠，共20只，随机分为如下2组：模型组、模型给药组。每组10只。

模型组(hcl)：经雾化喷剂给药系统给予小鼠气管喷入ph1.5盐酸水溶液造成小鼠急性肺损伤，按体重2ml/kg给药。

模型给药组(hcl+cblb502)：腹腔注射0.2mg/kg体重的cblb502蛋白，0.5h后经雾化喷剂给药系统给予小鼠气管喷入ph1.5盐酸水溶液造成小鼠急性肺损伤，按体重2ml/kg给药。

模型组处理或模型给药组给药后，分别于0h和24h，处死各组小鼠，每个时间点5只/组，收集肺组织，精确称取肺组织重量，匀浆，按照mpo测试盒(南京建成生物医药工程研究所)说明书操作，在紫外分光度计460nm处，测量吸光度值。

mpo酶活力单位定义：每克肺组织湿片37℃的反应体系中过氧化氢被分解1μmol为1个酶活力单位。

结果如图6所示。由图可见，hcl+cblb502处理组肺组织中的mpo活性显著低于hcl组，接近正常水平，说明cblb502处理可以显著抑制盐酸诱导的中性粒细胞活化，降低炎症反应程度。

<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120>鞭毛蛋白衍生多肽cblb502在防治急性肺损伤的应用

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