人参皂苷Rg3在制备治疗急性呼吸道炎症药物中的应用的制作方法

本发明属于医药领域，尤其涉及中药单体人参皂苷rg3新的药用用途，具体涉及rg3在制备治疗慢性阻塞性肺疾病急性加重中的应用。

背景技术：

急性呼吸道感染是临床常见的一种呼吸系统感染性疾病，主要临床表现为流涕、咽痛、咳嗽、发热等。重症可能伴随呼吸困难、咳嗽及喘息等症状，诱发肺炎、慢性阻塞性肺疾病急性发作等。主要由呼吸道感染引发，其中呼吸道感染主要包括病毒，细菌等病原微生物。老年人、小儿、慢性呼吸系统疾病患者等均为易感人群。

人参皂苷是从传统中药红参中提取的活性药物成分。目前，已鉴定出100余种人参皂苷。其中，人参皂苷rg3是最重要成分之一，具有多种药理活性，如抗炎，抗肿瘤和抗疲劳活性等。目前，越来越多的关注聚焦在rg3对于肺疾病的缓解和改善作用。有研究表明rg3可以通过调节癌细胞的岩藻糖基化以及mapk和nf-κb信号通路来抑制上皮-间质转化和肺癌的侵袭。rg3能够抑制nf-κb的活性并减少nf-κb介导的促炎性细胞因子的分泌。此外，rg3可通过调节pi3k/akt/mtor通路减轻lps诱发的急性肺损伤。然而，rg3作用于肺组织中性粒细胞炎症的机制尚未明确。

现有研究表明，不可分型的流感嗜血杆菌(nthi)的感染会加剧气道中性粒细胞炎症,长期反复感染会引发内皮细胞的炎症反应，产生一系列的趋化因子(il-1β、il-8等)，募集大量中性粒细胞等炎症细胞浸润气道，过度的中性粒细胞迁移会导致中性粒细胞弹性蛋白酶，金属蛋白酶和氧化反应物质的分泌增加，从而引起局部组织损伤，这个过程伴随着粘液增加且粘液清除力弱，严重的气道中性粒细胞炎症还会导致肺功能下降与气道功能障碍。

目前临床治疗急性呼吸道感染主要应用抗生素，吸入性支气管扩张剂，皮质类固醇及等进行症状控制，但受其不良反应及机体耐药性的限制，不能够有效控制疾病的进展。因此迫切需求安全有效的新型治疗药物和新疗法。已有研究显示，植物源药物具有抗炎作用，且无严重的副作用。

技术实现要素：

本发明提供一种人参皂苷rg3在制备治疗急性呼吸道炎症药物中的应用，以解决目前治疗急性呼吸道感染缺乏相关药物的问题。

本发明采取的技术方案是：

人参皂苷rg3在制备治疗急性呼吸道炎症药物中的应用。

人参皂苷rg3在制备能够改善aecopd模型小鼠体重降低和肺功能损伤药物中的应用。

人参皂苷rg3在制备能够改善小鼠肺组织病理损伤并降低肺组织中性粒细胞炎症药物中的应用。

人参皂苷rg3在制备能够减少中性粒细胞跨beas-2b上皮细胞迁移药物中的应用。

人参皂苷rg3在制备通过下调pi3k通路，减少中性粒细胞的迁移药物中的应用。

本发明的活性研究是基于香烟烟雾及nthi诱导的copd及aecopd模型,探讨了人参皂苷rg3在气道炎症中的药理作用。首先应用鼻部暴露法对小鼠进行12周的烟雾暴露建立copd模型，后进行两周rg3(10、20、40mg/kg)灌胃治疗，最后进行nthi接种激发建立aecopd模型。结果发现rg3可以减少模型小鼠体重的降低，改善小鼠肺功能以及肺组织形态，降低肺泡灌洗液中浸润的炎症细胞数及炎症因子，且其中高剂量组(40mg/kg)rg3的保护作用最为明显。

由于中性粒细胞炎症的增加是气道炎症急性加重的标志性特征之一，针对中性粒细胞的疗法变得至关重要。本发明的分子机制研究是利用人外周血中性粒细胞，rg3对其进行干预，结果发现rg3可以减少中性粒细胞跨上皮细胞的迁移。应用westernblot、elisa、免疫荧光等方法进行分子机制研究，结果发现rg3干扰了中性粒细胞内的pi3k信号通路，阻碍了中性粒细胞伪足的形成，从而减少了中性粒细胞的迁移，本发明提供了一种天然药物用于对抗呼吸道感染中性粒细胞炎症。

附图说明

图1是体内模型建立流程图，cs组中的balb/c小鼠暴露于香烟烟雾14周，rg3组的小鼠每天(从第12周开始)胃内给药rg3(10、20、40mg/kg)，持续两周。nthi组小鼠第14周进行鼻腔滴注给予nthi(10⁸cfu/ml)，24小时后麻醉进行后续实验；

图2(a)是小鼠体重图，第14周的体重比较；n＝16，每组测试重复三次，数据表示为平均值±sd，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001；

图2(b)是小鼠肺功能残气量frc图，各组小鼠frc比较；n＝5–7，每组测试重复三次，数据表示为平均值±sd，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；

图2(c)是小鼠第0.1秒用力呼气量/用力肺活量(fev0.1/fvc)图，各组小鼠fev0.1/fvc比较；n＝5–7，每组测试重复三次，数据表示为平均值±sd，**p<0.01，****p<0.0001；

图2(d)是小鼠气道阻力ri图，各组小鼠ri比较；n＝5–7，每组测试重复三次，数据表示为平均值±sd，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；

图2(e)是小鼠肺动态顺应性cydn图，各组小鼠cydn比较；n＝5–7，每组测试重复三次，数据表示为平均值±sd，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；

图3(a)是nc组小鼠肺组织h&e染色图；

图3(b)是cs组小鼠肺组织h&e染色图；

图3(c)是cs+rg3(20mg/kg)组小鼠肺组织h&e染色图；

图3(d)是cs+nthi组小鼠肺组织h&e染色图；

图3(e)是cs+nthi+rg3(20mg/kg)组小鼠肺组织h&e染色图；

图4(a)是小鼠balf中细胞总数，各组小鼠balf中细胞总数比较，n＝5–7，每组测试重复三次，数据表示为平均值±sd。*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001；

图4(b)是小鼠balf中中性粒细胞数图；各组小鼠balf中中性粒细胞数比较，n＝5–7，每组测试重复三次，数据表示为平均值±sd，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；

图4(c)是小鼠balf中中性粒细胞比例图；各组小鼠balf中中性粒细胞比例的比较，n＝5–7，每组测试重复三次，数据表示为平均值±sd，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；

图4(d)是小鼠balf炎性细胞因子il-6的表达图，n＝5–7，每组测试重复三次，数据表示为平均值±sd，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；

图4(e)是小鼠balf炎性细胞因子kc的表达图；n＝5–7，每组测试重复三次，数据表示为平均值±sd，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；

图5是体外支气管上皮细胞和中性粒细胞共培养以及跨上皮迁移模型建立流程图，图中(a)将beas-2b细胞铺板在transwell小室底层，并在37℃和5％co2下温育4小时直至贴壁；(b)beas-2b细胞孵育直至上皮细胞层完全形成；(c)beas-2b细胞在cs培养基中孵育(纯begm作为对照)；(d)将cs刺激的细胞用nthi感染4小时(纯begm作为对照)；(e)pbs清洗beas-2b细胞层并准备迁移；(f)将中性白细胞加入到小室内；(g)跨上皮细胞迁移2小时后，迁移的中性粒细胞收集在24孔板中；

图6(a)是中性粒细胞跨正常beas-2b细胞迁移图；rg3减少了中性粒细胞通过正常beas-2b细胞层的迁移，每组测试重复三遍，数据表示为平均值±sd，***p<0.001；

图6(b)是中性粒细胞跨cs刺激beas-2b细胞迁移图，rg3减少了中性粒细胞通过cs刺激的beas-2b细胞层的迁移，每组测试重复三遍，数据表示为平均值±sd，***p<0.001；

图6(c)是中性粒细胞跨nthi+cs刺激beas-2b细胞迁移图，rg3减少了中性粒细胞通过nthi+cs刺激的beas-2b细胞层的迁移；每组测试重复三遍，数据表示为平均值±sd，***p<0.001；

图7(a)是中性粒细胞内pip2的表达水平图；数据表示为平均值±sd，*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001；

图7(b)是中性粒细胞内pip3的表达水平，数据表示为平均值±sd，**p<0.01，****p<0.0001；

图7(c)是中性粒细胞pi3k信号通路蛋白表达条带图，中性粒细胞内pi3k，p–akt和akt蛋白的表达条带；

图7(d)是中性粒细胞p–akt蛋白表达水平图，数据表示为平均值±sd，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001；

图7(e)是中性粒细胞内f-actin免疫荧光染色图，中性粒细胞的分叶核染色结果在左侧列显示，f–actin在中间一列显示，右侧列为合并图像，每组测试重复三遍。

具体实施方式

人参皂苷rg3在制备治疗急性呼吸道炎症药物中的应用。

人参皂苷rg3在制备能够改善aecopd模型小鼠体重降低和肺功能损伤药物中的应用。

人参皂苷rg3在制备能够改善小鼠肺组织病理损伤并降低肺组织中性粒细胞炎症药物中的应用。

人参皂苷rg3在制备能够减少中性粒细胞跨beas-2b上皮细胞迁移药物中的应用。

人参皂苷rg3在制备通过下调pi3k通路，减少中性粒细胞的迁移药物中的应用。

下边通过试验例对本发明作进一步说明。

试验例1：人参皂苷rg3能够改善aecopd模型小鼠体重降低和肺功能损伤。

将雌性8周的balb/c小鼠随机分组：正常组(nc),烟雾组(cs),cs+rg3(10mg/kg)组,cs+rg3(20mg/kg)组,cs+rg3(40mg/kg)组，cs+nthi组,cs+nthi+rg3(10mg/kg)组,cs+nthi+rg3(20mg/kg)组,cs+nthi+rg3(40mg/kg)组，每周称重一次。应用鼻部吸入暴露塔对小鼠进行12周的香烟烟雾刺激，每周五日，每日两次，每次持续60分钟。第12-14周对小鼠进行灌胃给予低(10mg/kg)、中(20mg/kg)、高(40mg/kg)计量rg3，第14周末滴鼻方式给予nthi(10⁸cfu/ml)刺激,流程如图1。接种24h后给予腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)进行麻醉。将小鼠固定，进行气道插管，连接小动物肺功能仪进行小鼠肺功能残气量(frc)、第0.1秒用力呼气量/用力肺活量(fev0.1/fvc)、气道阻力(ri)和肺动态顺应性(cydn)的检测。

结果：第14周的体重结果表明(如图2a)，与cs组相比，nthi+cs组小鼠体重明显下降(p<0.01)。高剂量(40mg/kg)rg3可显著提升cs及nthi+cs组小鼠体重，具有统计学差异(p<0.05,p<0.0001)。如图2a-e，与nc组相比，cs组和nthi+cs组小鼠各项肺功能指标显著恶化，差异均具有统计学意义(p<0.01)。低、中、高剂量rg3组均在一定程度上改善了小鼠肺功能，其中高剂量(40mg/kg)rg3显著增强cs和nthi+cs组小鼠第0.1秒用力呼气量/用力肺活量(p<0.01)和肺动态顺应性(p<0.01,p<0.001)，降低肺功能残气量(p<0.01,p<0.0001)和气道阻力(p<0.001,p<0.01)。中剂量(20mg/kg)rg3可显著改善nthi+cs组小鼠各项肺功能指标(p<0.01,p<0.001)，改善cs组的第0.1秒用力呼气量/用力肺活量和肺功能残气量(p<0.01)。

试验例2：人参皂苷rg3能够改善小鼠肺组织病理损伤。

同试验例1方法进行copd及aecopd小鼠模型建立，灌胃给予人参皂苷rg3。小鼠麻醉后，取小鼠肺组织进行固定切片后，将组织切片脱蜡水化，将载玻片依次放入二甲苯i、二甲苯ii、100％乙醇i、100％乙醇ii、95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇、pbs。每个溶液中放置约3-5min。伊红染液染色5-10min，流水冲洗掉多余染液。苏木素染液染色5min，流水冲洗掉多余染液。1％盐酸-乙醇溶液分化1-3s，流水冲洗掉多余酸液。酒精脱水，依次放入70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、95％乙醇、100％乙醇i、100％乙醇ii、二甲苯i、二甲苯ii。每个溶液中放置约3～5min。擦去多余二甲苯，中性树胶封片，避免气泡产生。镜下观察组织病理结构改变。

结果：如图3a,nc组肺组织结构正常完整，cs组(图3b)及nthi+cs组(图3d)小鼠肺组织均发生了明显病理改变，其中nthi+cs组肺组织病理改变最为明显，发生上皮组织脱落，肺泡隔增厚，肺泡局部断裂、融合扩张等变化，如图所示。中剂量rg3组在一定程度上对cs(图3c)及nthi(图3e)造成的病理损伤具有治疗保护作用。

试验例3：人参皂苷rg3能够改善小鼠肺组织中性粒细胞炎症。

同试验例1方法进行copd及aecopd小鼠模型建立，灌胃给予人参皂苷rg3。小鼠麻醉后，固定小鼠，暴露气道及肺组织。在气管环连接处剪一v形切口，插入已剪去针尖的1ml注射器，用1ml预冷的生理盐水反复灌洗3次，离心得上清液及下层细胞团。pbs清洗细胞后，进行细胞计数，并采用apc-ly6g和pe-cd11b的抗体标记中性粒细胞(ly6g+cd11b+)，使用流式细胞仪对各组balf样本中的中性粒细胞数量和比例进行检测。上清液离心去杂质后，应用elisa试剂盒进行炎症因子il-6和kc的检测。

结果：如图4a-b，与nc组相比，cs及nthi+cs组小鼠balf中细胞总数及中性粒细胞数显著增高(p<0.001,p<0.0001)，且nthi+cs组小鼠细胞总数明显高于cs组(p<0.0001)，差异具有统计学意义(p<0.0001)。高剂量(40mg/kg)rg3可以显著降低cs及nthi+cs组balf中细胞总数(p<0.05)。低(10mg/kg)、中(20mg/kg)、高(40mg/kg)剂量rg3均在一定程度上降低了模型小鼠balf性粒细胞数，其中高剂量rg3(40mg/kg)组结果具有显著差异(p<0.05,p<0.01)。采用流式细胞术技术检测小鼠肺泡灌洗液中中性粒细胞的比例。结果与上相似，如图4c，中(20mg/kg)、高(40mg/kg)剂量rg3可显著降低模型组小鼠balf中性粒细胞比例(p<0.05,p<0.01,p<0.001)。elisa检测结果如图d-e，与nc组相比，cs及nthi+cs组balf中il-6和kc表达显著增高。rg3可减少炎症因子的表达且呈剂量依赖关系，其中，中(20mg/kg)、高(40mg/kg)剂量rg3可显著降低cs及nthi+cs组小鼠balf中il-6和kc的表达，差异具有统计学意义(p<0.05,p<0.01,p<0.001,p<0.0001)。

试验例4：人参皂苷rg3能够减少中性粒细胞跨beas-2b上皮细胞迁移。

应用24孔-transwell小室进行中性粒细胞迁移试验。培养人支气管上皮细胞beas-2b于小室底层,待其生长为致密细胞层后，应用10％浓度烟雾进行烟雾刺激12h后，接种nthi(moi＝10)4h进行上皮细胞层炎症模型建立。分离人外周血中性粒细胞，10、20、40μmrg3预处理中性粒细胞2h后，将10^6个中性粒细胞加入每个transwell小室内，培养箱内静置4小时待其迁移,流程如图5。

结果：10、20、40μmrg3作用于中性粒细胞后，能够抑制中性粒细胞跨上皮细胞迁移，且呈剂量依赖性。如图6a，与未加rg3组相比，各浓度rg3组中性粒细胞跨正常beas-2b上皮细胞迁移数显著降低(p<0.001)。图6b-c显示，rg3也可以抑制中性粒细胞跨模型组beas-2b上皮细胞迁移，且呈剂量依赖性，40μmrg3组中性粒细胞迁移数量最低，差异具有统计学意义(p<0.001)。fmlp为中性粒细胞激活剂，作为阳性对照。

试验例5：人参皂苷rg3通过下调pi3k通路，减少中性粒细胞的迁移。

应用fmlp刺激中性粒细胞30分钟后，10、20、40μmrg3及pi3k抑制剂ly294002进行中性粒细胞干预2h，提取中性粒细胞脂质pip2和pip3,利用elisa试剂盒进行各组中性粒细胞pip2和pip3含量的检测。用ripa裂解液对各组中性粒细胞进行蛋白提取，应用westernblot的方法进行pi3k,akt,p-akt蛋白含量的检测。配制sds-page凝胶；加热使蛋白变性后上样；电泳条件：80v恒压电泳30min浓缩胶，120v恒压电泳1-1.5h分离胶；转膜条件：冰浴中恒流100a转膜50-90min；5％的脱脂牛奶封闭液中室温封闭2h；一抗4℃孵育过夜；二抗室温慢速震荡孵育1h；显影液暴膜后，应用imagejversion6.0软件对条带灰度值进行分析。应用细胞免疫荧光技术，使用iflour488鬼笔环肽对f-肌动蛋白(f-actin)进行特异性结合，观察各组f-actin蛋白在中性粒细胞的表达情况。将中性粒细胞收集在多聚赖氨酸预处理的玻片上，4％多聚甲醛固定10分钟，0.1％tritonx–100的pbs破膜10分钟。pbs洗涤后，iflour488鬼笔环肽(5μg/ml)避光染色60分钟，dapi避光染色5分钟。pbs洗涤后，封片，在荧光显微镜下观察及并进行图像合并分析。

结果：如图7a-b，fmlp刺激正常中性粒细胞后，pip2大量转化为pip3,因此与nc组相比，fmlp组pip2表达显著降低，pip3表达显著上升，差异具有统计学意义(p<0.0001)。各浓度rg3干预组均在一定程度上抑制了pip2的减少和pip3的增加，其中40μmrg3组结果具有显著性差异(p<0.05,p<0.01)。pi3k抑制剂ly294002可显著抑制fmlp引起的pip3增多(p<0.001,p<0.0001)。ly294002组与40μmrg3组的结果无显著性差异(p>0.05)。如图7c-d所示，与nc组相比，fmlp组p-akt水平显著增高，差异具有统计学意义(p<0.05)。各浓度rg3干预组均在一定程度上抑制了p-akt的表达，其中40μmrg3组结果具有显著性差异(p<0.01)。pi3k抑制剂ly294002可显著抑制fmlp引起的p-akt水平增高(p<0.0001)。细胞免疫荧光结果如图7e，其中蓝色表示中性粒细胞细胞核，绿色表示中性粒细胞内f-actin的表达。当fmlp刺激中性粒细胞后，f-actin在胞质中出现了极化表达，高表达于细胞边缘，而nc组未受刺激的中性粒细胞中f-actin均匀分布于整个细胞质。rg3干预组可以降低f-actin的极化表达，尤其是40μmrg3组中性粒细胞中f-actin的在胞质的表达较为均匀其结果与pi3k抑制剂ly294002作用相似。

结论：本发明发现了人参皂苷rg3对aecopd中性粒细胞的保护作用。机制研究发现，rg3可以通过下调中性粒细胞内部的pi3k途径来减少中性粒细胞的迁移。这项发明提供了一种潜在的天然药物对抗aecopd中性粒细胞炎症。