柠檬皮酚类提取物在制备预防或治疗紫外线对皮肤损伤药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种柠檬皮酚类提取物的用途，具体涉及一种柠檬皮酚类提取物在制备预防或治疗紫外线对皮肤损伤药物中的应用。

背景技术：

柠檬是常见的常绿乔木，属芸香科柑橘属。柠檬作为高产作物，被作为水果广泛应用，同时也被加工成果汁、果酱等加工品。柠檬的果皮比较厚且粗糙，在传统加工应用中应用较少。中国的柠檬资源非常丰富，目前尤力克柠檬是我国柠檬种植的主要品种，主要分布在广西、广东、四川、云南等地区，其中四川栽培的柠檬产量最大。柠檬果实不仅具有丰富性的营养，还包括膳食纤维、多种维生素、酚类化合物(类酚类)、酚类衍生物、柠檬苦素及矿物等活性成分。柠檬果实中的有效成分使柠檬果实具有降血糖血脂胆固醇、防止血管增生、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗骨质疏松等成效。柠檬皮在加工过程中多被废弃，仅在中药领域作为一味中药进行使用，具有开胃健脾的作用。柠檬中的酚类物质(lemonpeelphenolics,lpp)有较好的去除过氧化氢及超氧负离子等游离基的能力。在柠檬中不同部位的类酚类含量是不相同的，并且存在的种类也不相同。据相关研究发现，柠檬果实主要的酚类物质是芦丁、橙皮苷、圣草枸橼苷等，几乎囊括了柠檬果实90％以上的总酚类；另外，柠檬皮中也含有较多酚类物质。

在现实应用中，按照波长的长度对紫外线辐射进行区分，具体可表示为分为短波紫外线uvc(200nm-280nm)、中波紫外线uvb(280nm-320nm)、长波紫外线uva(320nm-400nm)。然而波长范围在100nm-200nm的紫外辐射可能不会在空气中传播，因此波长范围在200nm-400nm的紫外线可能会对人体的健康造成影响。其中uvc短波紫外线的穿透能力最弱，无法穿透大部分的透明玻璃及塑料，日光中含有的短波紫外线几乎被臭氧层完全吸收。人体表面最大器官是皮肤，它能有效帮助机体抵御外界伤害，近几十年来，全球o3出现明显的下降趋势，导致大气臭氧层逐渐变薄，使得地面紫外辐射增强，特别是uvb波段的增加。uvb之所以造成皮肤损伤，是因为uvb辐射对生物产生强烈的破坏力并且相同剂量的uvb对皮肤的损伤程度比uva强约800-1000倍。紫外线可造成真皮细胞的损伤，急性损伤易转变为慢性损伤，引发长久性难以治愈的日晒斑，皱纹，干燥面黄，失去弹性，皮肤下垂，提前衰老等。因此为寻求对皮肤安全有效的防晒措施，研发天然抗氧化剂，对于预防以及治疗紫外线导致的皮肤损伤有至关重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种柠檬皮酚类提取物的用途，特别是一种柠檬皮酚类提取物在制备预防或治疗紫外线对皮肤损伤药物中的应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

柠檬皮酚类提取物在制备预防或治疗紫外线对皮肤损伤药物中的应用，所述提取物活性成分由如下组分组成：绿原酸，咖啡酸，橙皮苷，芸香柚皮苷和芦丁。

提取物活性成分优选的由下述重量配比组成：绿原酸40-50重量份，咖啡酸35-45重量份，橙皮苷1-3重量份，芸香柚皮苷2-8重量份，芦丁5-10重量份。

更优选的，所述提取物活性成分由下述组分重量配比组成：绿原酸44重量份，咖啡酸42重量份，橙皮苷2重量份，芸香柚皮苷4重量份，芦丁8重量份。

所述柠檬皮提取物与药品上可接受的载体或赋形剂组成药物制剂。还可与保健食品或化妆品上可接受的载体组成保健食品或化妆品。

进一步，所述紫外线为中波紫外线。

本发明还提供了一种优化的柠檬皮提取物的制备方法，具体步骤如下：

1)将柠檬表面清洁干净，采用jbt柑桔榨汁机得到切碎的柠檬果皮，再用0.1-0.3％(v/v)dsmrapidase酶制剂处理，制得果皮酶解悬液；其中dsmrapidase酶制剂按照其使用说明书使用即可。

2)将果皮酶解悬液匀浆后，按照1:3-5的料液比加入浓度为60％-100％的乙醇形成混合物，采用微波辅助设备处理该混合物以促进柠檬皮酚类物质从原料匀浆中转移至乙醇溶液中，形成酚类提取液；

3)将步骤2)的酚类提取液抽滤并收集滤液，将滤液减压蒸馏得到浓缩液，将所得浓缩液冷冻干燥3-8h，最终制得干粉即为柠檬皮酚类提取物。

优选的，微波辅助设备采用隧道式微波处理器，隧道式微波处理器设定处理参数为：微波功率8kw、萃取温度60℃、工作时间324s、物料处理速率3200g/min。

柠檬皮酚类物质(lemonpeelphenolics,lpp)分析发现其主要成分为绿原酸、咖啡酸、橙皮苷、芸香柚皮苷和芦丁等物质。通过建立有效的uvb辐射小鼠皮肤损伤模型，研究了柠檬皮酚类lpp对于皮肤损伤的干预效果。紫外线照射小鼠模拟uvb皮肤损伤，建立动物模型。通过试剂盒测定小鼠血清，采用h&e和masson染色制作皮肤病例切片，利用qpcr方法检测皮肤组织相关mrna表达。实验结果显示lpp能够提高uvb诱导皮肤损伤小鼠血清的cat、sod氧化酶活力和降低mda、il-1β、il-6、il-10、tnf-α水平。病理学观察也发现lpp能够减轻uvb导致的皮肤组织病变。lpp能够上调皮肤损伤小鼠皮肤组织中的sod1、sod2、cat、nrf2、ho-1、iκb-αmrna表达和下调nf-κb、p38mapk、cox-2表达。同时，相同涂抹浓度下lpp对皮肤的保护作用优于vc，且lpp的作用呈浓度正相关。由此可见，lpp是一类具有皮肤保护作用的酚类化合物，具有良好的应用价值。

附图说明

说明书各附图所表达的内容及图中的标记作出简要的说明：

图1为实施例lpp所含主要物质hplc色谱图；

图2为实施例小鼠皮肤组织的苏木精-伊红(h&e)染色切片对比图；

图3为实施例小鼠皮肤组织的masson染色病理学观察对比图；

图4为实施例小鼠皮肤组织中sod1,sod2,cat,nrf2和ho-1的mrna表达情况对比图；

图5为实施例小鼠皮肤组织中nf-κb、iκb-α、p38mapk和cox-2的mrna表达情况对比图。

具体实施方式

下面结合附图给出一个非限定的实施例对本发明作进一步的阐述。但是应该理解，这些描述只是示例的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

实施例

一、实验方法：

1、柠檬皮酚类提取工艺的开发及优化

将新鲜柠檬表面清洁干净，采用jbt柑桔榨汁机压榨果皮，得到5-10mmx3-5mm(长x宽)尺寸的切碎果皮，再用0.1-0.3％(v/v)dsmrapidase酶制剂处理，所得果皮酶解悬液匀浆后，按照1:3的料液比加入浓度为70％乙醇，采用隧道式微波处理器处理该混合物。微波辅助提取优化方法和过程见下文。提取结束后抽滤并收集滤液，减压蒸馏并回收乙醇，将所得的浓缩液冷冻干燥4h，最终制得的干粉即为柠檬皮总酚提取物。

1.1微波处理单因素设计：

分别考查微波功率(3、6、9kw)、萃取温度(40、50、60、70、80℃)、工作时间(200，250，300，350，400s)、物料处理速率(1500，2500，3500，4500，5500g/min)等因素对柠檬皮总酚提取效果的影响。

1.2微波处理工艺的响应面实验优化：

根据box-behnken试验设计原理，综合单因素试验结果，以微波功率、处理时间和物料处理速率3个因素为自变量，以单位重量鲜果总酚提取量为响应值，设计试验。试验因素与水平设计见表1

表1响应面试验因素水平表

2、柠檬皮酚类提取物主要成分的高效液相色谱分析

采用高效液相色谱串联二极管阵列检测器分析lpp的主要酚类物质。色谱条件：accucore-c18(2.6μm,4.6毫米×150毫米)色谱柱，流动相a：0.5％乙酸水溶液,流动相b:100％乙腈。色谱柱温度：30℃，流速：0.5毫升/分钟，检测波长：285nm。进样体积：10μl。色谱运行时间：40分钟。流动相梯度洗脱条件如表2所示：

表2流动相洗脱条件

a:0.5％乙酸水溶液，b:100％乙腈。

3、uvb辐射小鼠皮肤损伤模型的构建与分组给药

在实验前，用剪刀减去小鼠背部的长毛，把小鼠背部绒毛用脱毛刀轻轻刮掉后，再用专用脱毛液对小鼠背部皮肤做脱毛处理，脱毛范围(2cm×2cm)，每隔一天进行脱毛。使用313nmuvb灯管4只制作成紫外灯箱，调整照射高度为20cm。将7周龄雄性昆明小鼠随机分为5组：正常组(normal)、模型组(model)、vc涂抹组(vc)、柠檬皮酚类低浓度涂抹组(lppl)、柠檬皮酚类高浓度涂抹组(lpph)。每天给予小鼠自由饮水饮食，正常组不做任何处理；模型组每天只接受2h紫外照射；vc组每天涂抹5％的vc于脱毛处，0.5h后置于紫外光源下照射2h；lppl和lpph组每天分别涂抹2.5％和5％的lpp于脱毛处，0.5h后置于紫外光源下照射2h；该过程持续4周。实验结束后采用眼球取血；然后处死小鼠后取小鼠脱毛区皮肤备用。

4、血清氧化指标测定

将小鼠血液用冷冻离心机快速离心，参数设置为4000r/min、10min，取上清液制备成血清，根据相应的mda、cat和sod检测试剂盒说明书处理血清样本，并测定其水平。

5、血清炎症elisa指标测定

用测定血清氧化指标的方法制备血清，然后根据相应的il-1β、il-6、il-10和tnf-α检测试剂盒说明书处理血清样本，并测定其水平。

6、皮肤病理学观察

将皮肤剪成大小为0.5cm²左右方块状，固定于10％福尔马林溶液中，进行h&e和masson染色处理，然后用显微镜观察和拍照。

7、qpcr

取小鼠皮肤组织100mg于匀浆管中，加入1mltrizol和5粒钢珠，在组织匀浆机中匀浆，将组织匀浆液加入至离心管中，加入三氯甲烷，然后通过冷冻离心获取上层rna清液，再加入异丙醇溶液冷冻离心后去除上层清液可获得黄白色rna沉淀，在rna沉淀中加入由rnse-freewater配制而成的75％乙醇溶液，上下摇晃进行清洗，再次冷冻离心。在所得rna沉淀中加入由depc水过滤后配制成的75％浓度的乙醇溶液，上下摇匀清洗后，在冷冻离心机中离心后弃去上层管中，加入三氯甲烷，然后通过冷冻离心获取上层rna清液，再加入异丙醇溶液冷冻离心后去除上层清液可获得黄白色rna沉淀，在rna沉淀中加入由rnse-freewater配制而成的75％乙醇溶液，上下摇晃进行清洗，再次冷冻离心。取1μl的rna于pe管中，加入49μl的depc水，混匀后，在微量分光光度计中测定出rna的浓度，将rna配置成1μg/μl溶液.取1μlrna稀释后的提取液，依次加入1μl的oligodt和10μl的无菌超纯水，混合后，在pcr仪中以65℃的温度加热5min进行平衡，加入4μl的5×reactionbuffer、1μl的ribolockrnaseinhibitor(20u/ml)、2μl的100mmdntpmix、混合均与后，加入各样品7ml，revertaidm-mu/nrt各1μl，在42℃，60min和70℃，5min的条件下将rna逆转录成cdna。以gapdh为内参，通过rt-qpcr仪检测肝脏中表达的mrna表达水平，见表3。

表3.小鼠皮肤组织基因引物序列

gapdh:甘油醛-3-磷酸脱氢酶.

8、数据处理与分析

用spss18.0软件做数据分析处理，以平均值±标准偏差的形式显示结果。通过单因素方差分析法对各组数据进行比较，观察各组数据在p＜0.05水平上是否显著性差异。

二、实验结果

1、lpp提取方法的优化结果

通过单因素分析和响应面法建立柠檬皮总酚lpp提取效能的二次多项式数学模型，得到微波辅助提取lpp的优化工艺参数为，微波功率8kw、萃取温度60℃、工作时间324s、物料处理速率3200g/min。所得lpp由如下组分组成：绿原酸44重量份，咖啡酸42重量份，橙皮苷2重量份，芸香柚皮苷4重量份，芦丁8重量份。

2、lpp主要成分的分析结果

lpp主要含绿原酸、咖啡酸、橙皮苷、芸香柚皮苷和芦丁等物质。见图1，图1中1为绿原酸，2为咖啡酸，3为芦丁，4为芸香柚皮苷5为橙皮苷。

3、lpp对uvb照射小鼠血清mda、cat和sod水平的影响

如表4所示，相比于正常组，模型组小鼠血清的mda含量在数据中显示为显著性升高(p＜0.05)，sod和cat含量在数据中显示为显著性下降(p＜0.05)，证明建立皮肤损伤模型成功。相比于模型组，酚类涂抹组与vc涂抹组小鼠血清中mda含量在数据中显示为均有显著性下降(p＜0.05)，而sod和cat含量则在数据中显示均有显著性升高(p＜0.05)，并且lpph作用小鼠的血清mda、cat和sod水平相比其他各组更接近于正常组。

表4.小鼠血清中sod,no,cat,mda及gsh-px水平

“±”表示标准偏差(n＝10只/组)；^a-e采用tukey’shonestly显著差异测试,相同字母标注差异不显著(p>0.05)，不同字母表示差异显著(p<0.05)。normal:正常未照射uvb小鼠；model:uvb诱导皮肤损伤的小鼠；vc:小鼠皮肤涂抹5％维生素c；lppl:小鼠皮肤涂抹2.5％柠檬皮酚类提取物；lpph:小鼠皮肤涂抹5％柠檬皮酚类提取物。

4、lpp对uvb照射小鼠血清炎症因子水平的影响

如表5所示，相比于正常组，模型组小鼠血清的il-1β、il-6、il-i0和tnf-α的水平从数据分析可见均有显著性升高(p＜0.05)。相比于模型组，酚类与vc涂抹组小鼠血清的il-1β、il-6、il-i0和tnf-α的水平从数据分析可见均有显著性下降(p＜0.05)。且相同涂抹浓度下lpph下调血清il-1β、il-6、il-i0和tnf-α水平的作用强于vc。

表5.小鼠血清中il-6,il-10,tnf-α及il-1β水平.

“±”表示标准偏差(n＝10只/组)；^a-e采用tukey’shonestly显著差异测试,相同字母标注差异不显著(p>0.05)，不同字母表示差异显著(p<0.05)。normal:正常未照射uvb小鼠；model:uvb诱导皮肤损伤的小鼠；vc:小鼠皮肤涂抹5％维生素c；lppl:

小鼠皮肤涂抹2.5％柠檬皮酚类提取物；lpph:小鼠皮肤涂抹5％柠檬皮酚类提取物。

5、小鼠皮肤组织病理学观察

如图2所示，为放大倍数100倍的小鼠皮肤组织的苏木精-伊红(h&e)染色切片。病理切片h&e染色显示，正常组小鼠皮肤组织的细胞构成清晰，表皮层完整，真皮层薄且覆盖于上面的纤维分布整齐。模型组暴露在紫外线下后，小鼠皮肤组织的表皮结构不完整，表皮层厚度明显增加，真皮层出现排列混乱的组织和变形的纤维，还有大量的炎症细胞浸润，说明成功建立了皮肤损伤模型。vc涂抹组小鼠皮肤组织的表皮结构较完整，真皮层组织排列较为整齐，且真皮层的炎症细胞明显减少。lppl涂抹组小鼠皮肤组织的表皮增厚程度相比模型组有减轻，真皮层组织排列混乱也有所改善。lpph涂抹组小鼠皮肤组织的形态变化与模型组比较有明显改善，基本接近正常组的皮肤组织，表皮结构完整，真皮层排列整齐。

如图3所示，为放大倍数100倍小鼠皮肤组织的masson染色病理学观察图。病理切片masson染色显示，正常组小鼠皮肤组织中出现有染色较深的胶原纤维，排列有序、分布均匀。模型组小鼠皮肤组织中有少量染色较浅的胶原纤维，其中真皮浅层的胶原纤维变化最明显，发生断裂、数量减少、粗细不等的、排列混乱的现象。相同浓度下，vc涂抹组的小鼠皮肤组织中真皮层胶原纤维的损坏程度相比模型组有所改善，胶原纤维染色较浅、数量减少；lpp涂抹组小鼠皮肤组织中的胶原纤维的变化较模型组有明显改善，胶原纤维破坏程度减小，排列较整齐。

6、lpp对小鼠皮肤中sod1、sod2、cat、nrf2和ho-1的mrna表达的影响

如图4所示，为小鼠皮肤组织中sod1,sod2,cat,nrf2和ho-1的mrna表达情况对比图。a-d采用tukey’shonestly显著差异测试,相同字母标注差异不显著(p>0.05)，不同字母表示差异显著(p<0.05)。实验结果显示，正常组小鼠皮肤中的sod1、sod2、cat、nrf2和ho-1表达最强，而模型组小鼠皮肤中的以上表达最弱。vc、lppl和lpph涂抹均能显著(p＜0.05)上调uvb诱导皮肤损伤小鼠皮肤中的sod1、sod2、cat、nrf2和ho-1表达，且lpph上调的能力最强。

7、lpp对小鼠皮肤中nf-κb、iκb-α、p38mapk和cox-2的mrna表达的影响

由图5可见，为小鼠皮肤组织中nf-κb、iκb-α、p38mapk和cox-2的mrna表达情况对比图。a-d采用tukey’shonestly显著差异测试,相同字母标注差异不显著(p>0.05)，不同字母表示差异显著(p<0.05)。相对于正常组小鼠，uvb诱导皮肤损伤后，小鼠皮肤的nf-κb、p38mapk和cox-2表达增强，而iκb-α表达降低。vc和lpp涂抹均可以降低皮肤损伤小鼠皮肤的nf-κb、p38mapk、cox-2表达和增强iκb-α表达，且lpph的作用强于vc和lppl。

以上图表中normal表示正常组、model表示模型组、vc表示vc涂抹组、lppl表示柠檬皮酚类低浓度涂抹组、lpph表示柠檬皮酚类高浓度涂抹组。

三、实验结果分析：

过度暴露于紫外线下会导致皮肤急性炎症的发生，表现为暴露部位的皮肤出现红斑、水肿、增生，有灼烧刺痛感，严重时可能导致水疱、糜烂等，之后可能伴有脱皮和炎症后色素沉着等现象发生。由于uvb主要作用于表皮内的色基，急性炎症的组织病理表现为明显的角质形成细胞凋亡、水肿，严重者可影响表皮全层，且伴有中性粒细胞向表皮聚集、真皮毛细血管扩张和血管周围淋巴组织细胞浸润。在实验过程中用uvb对小鼠进行连续4周的辐射，很好的展示了uvb对皮肤的持续损伤过程，客观具体的模拟出了生活中uvb对皮肤的损害效果。成功建立小鼠受损皮肤模型后，用h&e和masson染色处理小鼠背部的脱毛区皮肤，进行观察。通过观察得知，uvb辐射可引起皮肤表皮结构的破损、胶原纤维的破裂、并伴有炎症细胞浸润等的改变。表皮角质形成细胞经uvb辐射之后，会释放大量炎性介质以及趋化因子，如il-1、il-6、il-10、tnf-α等，炎症后期还会出现炎症细胞增生现象。研究显示涂抹酚类化合物都可以有效减少uvb诱导的皮肤炎症的发生。本发明通过涂抹lpp能起到减轻uvb诱导皮肤损伤小鼠的炎症状态。

皮肤自身的抗氧化系统可清除ros，使其维持在一个较低的水平，然而过度暴露于uvb条件下会导致ros大量产生，从而造成氧化应激。过量的ros会对dna、蛋白质、脂质等造成一系列的损伤，最终可能会导致细胞凋亡甚至产生皮肤癌。sod是一种能保护对生命体有益自由基的活性物质，起到维持生命体的自由基均衡，阻挡氧化应激损伤的作用。因此sod活性成为抗氧化的重要指标。本实验中lpp给药组sod活性出现显著升高，表明lpp可提高小鼠体内的sod活性。cat酶作为一种内源性氧清除剂，能有效避免细胞产生过度氧化，帮助减缓细胞氧化损伤。本实施例中lpp给药组cat活性显著升高，说明lpp通过提高cat活性，有效减少紫外线对小鼠皮肤的伤害。mda可以有效反映机体内脂质受活性氧作用程度，间接体现细胞损伤情况。本实施例中模型组mda的含量比正常组mda的含量有显著提高，而lpp给药组mda的含量比模型组mda的含量有显著降低，表明lpp能起到一定程度的抗氧化作用。

nrf2是细胞防御氧化应激的关键因子，nrf2是诱导ⅱ相酶基因表达的必需调节因子。ⅱ相酶中的ho-1对细胞具有保护作用，它可催化血红素产生胆绿素、一氧化碳和铁，胆绿素可形成胆红素，nrf2和ho-1在体内是强有力的自由基清除剂。酚类物质涂抹到无毛小鼠皮肤上，可以增加nrf2mrna表达，转移至核上的nrf2和抗氧化反应元件结合，从而诱导ho-1mrna表达，发挥抗氧化作用。同时，用酚类物质处理受uvb辐照后的hacat细胞，发现其可以通过促进nrf2转移至细胞核内增加细胞内抗氧化剂ho-1和nq-o1的表达，从而显示出优异的抗氧化活性。本实施例中lpp可以通过吸收紫外线、清除自由基、恢复抗氧化酶活性以及通过调节nrf2/ho-1/nq-o1来达到抗紫外线诱导的氧化应激的作用。

cox-2、p38、nf-κb和i-κb都是炎症相关的重要因子。酚类物质作用于人角质形成细胞hacat都可以通过抑制p38mapk信号通路来抑制uvb诱导的cox-2的产生。通过给skh-1无毛小鼠背部涂抹酚类，发现其可以通过抑制phosphatidylinositol3-kinase(pi3k)/proteinkinaseb(akt)/nf-κb通路来抑制炎症细胞因子tnf-α、il-1β和il-6的水平，并减少cox-2的表达，从而降低pge2，进而抑制uvb诱导的炎症。酚类物质还能对受到紫外线辐射的成纤维细胞hs68进行干预，酚类物质可以通过抑制mapk的活化来增加nf-κb抑制剂(inhibitorκb，i-κb)的表达，从而抑制nf-κb易位进入细胞核，协同降低pi3k/akt/camp反应原件结合蛋白(campresponseelement-bindingprotein，creb)途径中的p-crebser-133的水平，减少nf-κb的激活，来达到抑制cox-2的作用，进而降低pge2的水平，从而减少紫外线诱导的炎症反应。通过使用酚类物质对hacat细胞进行干预，发现其可以通过减少ros的生成来干扰或者直接抑制p38mapk途径来抑制uvb诱导的促炎介质如il-6、tnf-α、pge2以及cox-2的释放。本实施例lpp可以调节uvb损伤小鼠皮肤的cox-2、p38mapk、nf-κb和iκb-α的表达趋于正常，从而起到干预uvb引发皮肤损伤的作用。

本实施例通过建立uvb诱导动物皮肤损伤模型验证了lpp具有保护皮肤的功效。lpp能够干预uvb造成的小鼠皮肤氧化应激和炎症反应，从而减轻皮肤的氧化损伤和炎症。分子生物学实验和hplc检测结果证实lpp能够通过主要5种酚类化合物起到提升抗氧化酶、调控nrf2/ho-1通过提高抗氧化能力和调控p38mapk信号通路控制炎症等作用发挥保护皮肤的生物活性作用。

以上实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明的记载的内容之后，技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。