无机-有机复合的活细胞支架及其制备方法和应用与流程

[0001]
本发明涉及一种无机-有机复合的活细胞支架及其制备方法和应用，具体涉及一种多细胞分层分布的无机-有机复合生物墨水基的活细胞支架及其制备方法和应用，属于生物技术领域。


背景技术：

[0002]
在日常生活中烧伤、撕裂伤以及糖尿病性溃疡等都可能造成深层难愈合皮肤损伤，这种损伤往往伴随着皮肤血管的严重破坏，导致人体难以自愈。目前临床上的最佳治疗手段是自体移植或异体移植，但自体移植常常存在供体来源不足和产生二次伤口的局限性；异体移植则存在免疫排斥反应。基于以上，使用人工方法制备可用于移植的活体皮肤组织替代物已经成为迫切需求。
[0003]
近年来新兴起的生物3d打印技术能够同时打印材料和细胞，精确控制细胞在三维空间上的分布，实现人工制备三维组织构建体并用于器官再造。因此，生物3d打印技术具有体外直接构建仿皮肤真皮的活体组织的应用潜力。


技术实现要素：

[0004]
针对上述问题，本发明提供一种无机-有机复合的活细胞支架及其制备方法和应用。所述无机-有机复合的活细胞支架能够模拟含有血管的人体皮肤真皮层的生理结构，促进血管再生以及真皮结构重建进而加快皮肤再生，对皮肤全层损伤和难愈合创面的治疗具有潜在应用价值。
[0005]
第一方面，本发明提供一种无机-有机复合的活细胞支架。所述活细胞支架包括无机-有机复合生物墨水构建形成的支架整体框架以及在所述支架整体框架的三维空间中呈现层状分布的的多种细胞；所述活细胞支架的上半部分为(a-c)*y的逐层交替排布方式，a为生物墨水，c为支架上层细胞；下半部分为(a-b)*x的逐层交替排布方式，a为生物墨水，b为支架下层细胞；x、y代表交替排布的循环周期，且均为正整数。
[0006]
不同于将细胞包裹在水凝胶中进行打印的方式，本发明中采用支架与细胞逐层交替排布方式，在保证细胞逐层紧密粘附于支架的基础上，使细胞尽可能暴露在水凝胶外部而不是被水凝胶包裹起来，极大地增强了细胞与外界氧气养料的接触和代谢废物的及时排出，并且两种细胞的相互作用也能够被显著加强。因此，在支架内部的细胞显示出良好的增殖情况，同时成纤维细胞和血管内皮细胞之间的直接作用为实现支架的成血管性能提供了基础。此外，细胞在支架内三维空间中的迁移活动也更加自由。
[0007]
较佳地，所述支架上层细胞为成纤维细胞。
[0008]
较佳地，所述支架下层细胞为血管内皮细胞。
[0009]
该活细胞支架的特点在于两种细胞在支架内的三维空间中呈现层状分布，能够模拟人体皮肤真皮层的细胞分布和生理结构。成纤维细胞分布在支架的上半部分，代表真皮层的主要细胞构成；血管内皮细胞分布在支架的下半部分，呼应真皮层底部密集的血管网
络。本发明中所采用的两种细胞上下层分布目的在于模拟天然真皮层的生理结构。在皮肤真皮中存在着丰富的血管网络。真皮浅层中血管细小且少，随着深度增加，血管愈发粗且密集。本发明的重点之一在于制造出一种仿生真皮替代物，因而在结构上必须模拟天然真皮中的上层成纤维细胞下层血管内皮细胞的分布情况，因此采用此设置方式。当其被应用于皮肤损伤修复时，这种仿生的替代物因为具有周围组织保持类似的组织结构，故能够更好地发挥作用。而采用相反的细胞分布方式、即支架上层细胞为血管内皮细胞、支架下层细胞为成纤维细胞，则无法实现上述效果。本发明所述支架是具有功能性的多细胞共培养支架，对于皮肤全层损伤和难愈合创面的治疗具有广阔的应用前景。
[0010]
较佳地，x：y＝3：7-7：3。例如，x：y＝3：7、4：6、5：5、6：4、7：3。更优选地，优选地x：y＝1：1。一些实施方式中，x为3到10之间的整数。一些实施方式中，y为3到10之间的整数。
[0011]
本发明活细胞支架的x，y奇偶设置不会对接触界面产生实质的影响。由于支架上下部分的循环都以水凝胶层作为起始(a-b、a-c中的a层)，细胞层(b、c)分布于其上。从下至上开始打印时，当下层a-b-a-b
…-
a-b循环结束时，紧接着开始-a-b-a-c-a-c
…
上层循环。这就能够保证两种细胞之间一定会有一层水凝胶a作为分隔，不会造成两种细胞同时分布于一层的情况。在制备过程中应尽量避免两种细胞在同一层上共存。由于成纤维细胞具有相对更强的增殖力，可能会对同层上的血管内皮细胞的生存和增殖空间造成影响，因此本发明中所采用的打印方式能够避免此种情况的发生。同时，两种细胞之间只存在一层水凝胶，在不直接混合分布的基础上又不会相隔太远，能够保证细胞间的紧密相互作用的实现。
[0012]
较佳地，所述无机-有机复合生物墨水包含生物活性无机材料和具有强度和韧性的水凝胶基质；所述生物活性无机材料为在生理环境下释放出人体必需微量元素的微米或纳米颗粒；优选地，所述人体必需微量元素包括sr、cu、co、si中的一种或几种；更优选地，所述人体必需微量元素包括si和/或sr。
[0013]
较佳地，所述生物活性无机材料为srsio3无机微粒。此时支架整体框架由包含sr、si元素的无机微粒和水凝胶基质复合而成的生物墨水构建。在培养过程中复合生物墨水释放出生物活性sr、si离子，对支架内的两种细胞产生作用，提高成血管相关基因和蛋白表达，达到促进血管再生进而加速创伤修复的目的。
[0014]
较佳地，所述水凝胶基质为结冷胶、透明质酸、海藻酸钠、甲基纤维素、胶原中的一种；或者所述水凝胶基质为结冷胶、透明质酸、海藻酸钠、甲基纤维素、胶原中的多种通过物理结合形成的均匀混合物。
[0015]
较佳地，所述生物活性无机材料占水凝胶基质的质量比为0.7％-4％。生物活性无机材料占水凝胶基质的质量比在此范围内，生物活性材料释放出的无机离子能够保持在适宜的浓度，不会产生明显的细胞毒性，同时，能够在一定程度上刺激细胞，提高细胞中某些基因和蛋白的表达。此外，也不会对活细胞支架的机械性能和成型性能产生负面影响。即使无机材料以最高含量加入水凝胶基质，对其机械性能也不会产生明显的负面影响。
[0016]
较佳地，所述生物活性无机材料的粒径在20μm以下。该生物活性无机材料形貌规整均一，具有良好的降解性以释放生物活性离子，并且无机材料的加入不会对水凝胶基质的性质产生不利影响。
[0017]
第二方面，本发明提供上述任一项所述的无机-有机复合的活细胞支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)制备无机-有机复合生物墨水；步骤(2)将支架下层细胞和支架上层细胞分别溶于细胞相容性液体中制成细胞悬液1和细胞悬液2；步骤(3)使用无机-有机复合生物墨水和细胞悬液1利用挤出式生物3d打印方法制备逐层交替排布的活细胞支架的下半部分为(a-b)*x；同样，使用无机-有机复合生物墨水和细胞悬液2利用挤出式生物3d打印方法制备逐层交替排布的活细胞支架的上半部分为(a-c)*y；步骤(4)将打印完毕后的支架交联固化以获得无机-有机复合的活细胞支架。
[0018]
本发明首次使用上述方法进行无机-有机复合的活细胞支架的制备，实现了对活细胞在三维空间中分布的精确控制，同时保证了细胞在支架上的粘附以及快速增殖。通过该制备方法在体外构建出了兼具皮肤真皮层结构模拟和功能性组织再生能力的含活细胞的组织工程构建体。
[0019]
第三方面，本发明提供上述任一项所述的无机-有机复合的活细胞支架在皮肤组织再生领域的应用，尤其是在在体外培养皮肤组织工程构建体中的应用。
附图说明
[0020]
图1为本发明中制备的srsio3微米颗粒的扫描电镜照片(a,b)以及x射线衍射分析(c)；图2为本发明中制备的ss-gam生物墨水表征，包括(a)gam水凝胶以及其组成成分的红外光谱：(a)中的gam、ag、mc、gg分别指的是海藻酸钠/甲基纤维素/结冷胶复合水凝胶、海藻酸钠、甲基纤维素、结冷胶；(b)不同srsio3微米颗粒含量(0％、2％、5％、10％)的ss-gam复合生物墨水的流变学；(c)不同srsio3微米颗粒含量(0％、2％、5％、10％)的ss-gam复合生物墨水的打印性测试；图3为本发明中制备的不同srsio3微米颗粒含量(0％、2％、5％、10％)的无机-有机复合的活细胞支架表征：包括支架的(a)光学照片；(b)表面扫描电镜照片；(c)sr元素分布；(d)si元素分布；(e)o元素分布；(b)(c)(d)(e)中的标尺相同；(f)形变测试；(g)sr离子释放曲线；(h)si离子释放曲线；图4为本发明中制备的无机-有机复合的活细胞支架内部的细胞分布荧光显微照片：包括(a)第1天的支架截面；(b)第5天的支架截面；(c)第5天的支架正面；图5为不同srsio3微米颗粒含量(0％、2％、5％、10％)的无机-有机复合的活细胞支架的增殖活性和成血管基因表达：包括(a)10天内的细胞增殖，每组条形框从左至右依次为第1天、第4天、第7天和第10天；(b)第一行为第1天的活/死细胞染色显微照片(i,ii,iii,iv)，第二行为第10天(v,vi,vii,viii)的活/死细胞染色显微照片，每行从左到右依次是co-gam，co-2ss-gam，co-5ss-gam，co-10ss-gam；(c)vegf基因表达；(d)hif-1α基因表达；(e)ve-cad基因表达；(f)enos-1基因表达；图6为含有0％、2％srsio3微米颗粒的无机-有机复合的活细胞支架与接种细胞支架在(a)增殖活性、(b)基因表达和(c)细胞粘附方面的对比；(a)中每组条形框从左至右依次为打印gam、接种gam、打印2ss-gam、接种2ss-gam；(b)中每组条形框从左至右依次为打印2ss-gam、接种2ss-gam；图7为本发明中制备的无机-有机复合的活细胞支架的裸鼠皮下移植实验结果：包括
(a)he染色；(b)cd31免疫组化染色；(c)人源特异性cd31免疫组化染色；图8为本发明中制备的无机-有机复合的活细胞支架的裸鼠创伤修复实验结果：包括(a)创伤处移植了支架的裸鼠照片；(b)第0、7、10、13、15天裸鼠的伤口愈合情况照片；(c)创伤面积分数统计，每组条形框从左至右依次为空白、gam、2ss-gam、gam+cells、2ss-gam+cells；(d)第7、15天的伤口部位皮肤he染色；(e)伤口部位血管cd31免疫组化染色；图9为本发明中制备的无机-有机复合的活细胞支架的糖尿病小鼠创伤修复实验中，(a)创伤处移植支架的糖尿病小黑鼠照片；(b)第0、7、9、11、13、15天小黑鼠的伤口愈合情况照片；(b)中每组条形框从左至右依次为空白、gam、2ss-gam、gam+cells、2ss-gam+cells，条形框右侧为星号，该星号不会对条形框表示的数值产生实质影响；(c)创伤面积分数统计；(d)第15天的伤口部位皮肤he染色；(e)第15天的伤口部位皮肤masson三色染色；图10为本发明中制备的无机-有机复合的活细胞支架的糖尿病小鼠创伤修复实验中胶原纤维面积百分比统计，从左至右依次为空白、gam、2ss-gam、gam+cells、2ss-gam+cells。
具体实施方式
[0021]
通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
[0022]
本发明公开一种无机-有机复合的活细胞支架，能够模拟含有血管的人体皮肤真皮层的生理结构，帮助血管重建进而加快皮肤再生。该支架的特点在于两种细胞在支架内的三维空间中呈现层状分布，能够模拟人体皮肤真皮层的细胞分布和生理结构。成纤维细胞分布在支架的上半部分，代表真皮层的主要细胞构成；血管内皮细胞分布在支架的下半部分，呼应真皮层底部密集的血管网络。
[0023]
本发明公开了更加精细的仿生真皮层结构，能够同时模拟真皮层的生理结构、细胞种类和微环境。针对人体皮肤真皮层上部分为胶原纤维网络，下部分为密集血管网络的生理结构，本发明中通过生物3d打印技术制备出了具有规整网状结构的支架，成纤维细胞和血管内皮细胞在结构中呈现上下层状的密集排布。在竖直方向上，这种层状分布仿照了天然真皮层的多细胞分布情况；而在水平方向上，细胞的网络状排布仿照了真皮中的胶原和血管网络结构。本发明的重点在于仿生真皮层结构中血管网络的建立，是在细胞尺度上对真皮生理结构更为精确的模拟，这与将血管内皮细胞和成纤维细胞直接混合作为血管化真皮结构不同。此外，本发明中的支架可以被认为是一种天然真皮替代物，其具有与天然组织高度相似的仿生结构，是对人体组织的细胞、结构和微环境的全方位模拟，再加上其具有的宏观大孔结构能够保证内部细胞与氧气养料的充分接触。更重要的是，本发明的结构中除了水凝胶之外，还加入了功能性硅酸盐微粒，以长期诱导血管和组织再生。
[0024]
作为示例，支架整体框架由包含sr、si元素的无机生物活性材料和水凝胶复合而成的生物墨水构建而成。在培养过程中复合生物墨水释放出生物活性sr、si离子，对支架内的两种细胞产生作用，促进成血管从而加速创伤修复。
[0025]
上述无机-有机复合的活细胞支架中的水凝胶为结冷胶、透明质酸、海藻酸钠、甲基纤维素、胶原中的一种或多种以一定比例混合溶解后形成的水溶液，具有一定的成型性，可以在一定条件下发生交联固化。优选为结冷胶、海藻酸钠和甲基纤维素三者以一定比例混合而成的gam水凝胶材料。一些实施方式中，gam水凝胶中结冷胶、海藻酸钠和甲基纤维素
三者的质量分数为1-10％。
[0026]
所述结冷胶的浓度为1-4％。结冷胶性脆，交联后硬度高但韧性差，因此浓度应保持在适宜范围内。优选结冷胶浓度为2.8％。
[0027]
所述海藻酸钠的浓度为1-3％。海藻酸钠交联后柔软，可以中和结冷胶韧性差的缺点，但由于大量钠离子的存在，浓度过高易对细胞产生不利影响。优选海藻酸钠浓度为1.6％。
[0028]
所述甲基纤维素的浓度为1-3％。甲基纤维素水溶液能够大大提高生物墨水的粘度，提高其成型性能。优选甲基纤维素浓度为2.8％。
[0029]
上述无机-有机复合的活细胞支架中含sr、si元素的无机生物活性材料优选为srsio3微米颗粒。可采用水热法制备上述srsio3微粒。将sr源和si源溶于溶剂，将sr源溶液缓慢滴加入si源溶液，二者经充分混合、加醇搅拌、水热、洗涤、干燥后，得到srsio3微米颗粒。所述sr源为含sr的酸类，优选为sr(no3)2、srcl2的至少一种；所述si源为含si的酸类，优选为na2sio3；所述溶剂为去离子水、纯水、超纯水中的至少一种；所述醇类优选为无水乙醇。在本发明提供的一优选实施方式中，采用sr(no3)2和na2sio3·
9h2o作为sr源和si源，通过水热法制备。具体方法如下：分别称取一定量的sr(no3)2晶体和na2sio3·
9h2o，加入等量去离子水使二者完全溶解。将sr(no3)2溶液缓慢滴加入na2sio3溶液中，边滴加边搅拌直至二者完全混合。再向其中加入一定量的无水乙醇，继续搅拌30min以上。之后将混合溶液倒入50ml聚四氟乙烯水热反应釜中，160℃水热反应8小时。待溶液冷却后倒掉上清液，收集下层白色沉淀，经去离子水洗、醇洗、烘干后得到srsio3微米颗粒。上述称取的sr(no3)2和na2sio3·
9h2o晶体的摩尔比为1:1，sr(no3)2溶液和na2sio3溶液的浓度都为0.2mol/l，sr(no3)2溶液和na2sio3溶液和无水乙醇的体积比为1:1:1.5。
[0030]
本发明首次通过上述方法制备srsio3微米颗粒，得到了形貌规整的近六棱柱状srsio3微米颗粒，其具有高纯度和高结晶度。同时对其生物活性进行了探究，并发现所制备的srsio3微米颗粒具有促进共培养细胞成血管基因表达的作用。本发明中的srsio3微粒作为生长因子的替代来产生细胞诱导作用。常用的血管化诱导方法是在其中加入生长因子，但此种方法成本高，且生长因子难以保持长时间的活性。基于这种情况，本发明选择srsio3微粒作为能够稳定持续发挥细胞诱导作用的生物活性因子来替代传统的蛋白质生长因子，来制备具有长期血管化能力的皮肤替代物支架。
[0031]
sr元素和si元素被证实具有促进血管生成的能力，sr能够显著提高细胞中成血管生长因子vegf的表达。此外，si元素还能够在伤口愈合过程中加速胶原沉积和创伤修复。本发明考虑将这两种元素引入到支架当中，通过降解逐步释放sr、si离子，对打印的产生持续性刺激作用，从而提高支架的成血管活性，促进皮肤再生。
[0032]
值得说明的是，在组织工程领域极少对sr-si生物材料在皮肤创伤修复中的应用进行探索，多数关于sr元素的研究集中在骨修复领域。本发明创新性地选用srsio3材料应用于皮肤组织再生，并优化出制备方法，得到一种形貌特殊的六棱柱状srsio3微粒。将其应用到皮肤替代物支架中后得到了很好的结果反馈。
[0033]
本发明还提供了上述无机-有机复合生物墨水的制备方法。结冷胶粉体在90℃下溶于溶剂，充分搅拌后获得结冷胶溶液，加入srsio3微粒、海藻酸钠、甲基纤维素粉体，经搅拌、降温后，得到ss-gam无机—有机复合生物墨水。所述溶剂为去离子水、纯水、超纯水中的
至少一种。
[0034]
本发明首次使用上述方法制备ss-gam无机—有机复合生物墨水，得到了srsio3微米颗粒在水凝胶中均匀分布的复合材料，这种生物墨水具有良好的打印性和成型性，并且能够缓释出生物活性离子从而对细胞活动产生积极作用。
[0035]
上述无机-有机复合的活细胞支架的复合生物墨水中，srsio3微米颗粒的含量为水凝胶中结冷胶粉体质量的0-10％。过高的srsio3微米颗粒含量会影响生物墨水的打印性，并且释放较高浓度的sr、si离子，可能对细胞产生不利影响。
[0036]
上述无机-有机复合的活细胞支架中两种细胞悬液的体积比为1:1，两种细胞的浓度比为1:1，浓度范围为3000-30000个/μl。细胞悬液的浓度过高，会造成支架上的细胞密度过大，影响细胞的粘附和增殖；细胞悬液的浓度过低，会使细胞密度太小从而影响细胞的活性。优选细胞悬液的浓度为10000个/μl。
[0037]
上述无机-有机复合的活细胞支架采用挤出式生物3d打印方法进行逐层制备。所述支架的下半部分为(a-b)*x的逐层交替排布方式，其中a为无机—有机复合生物墨水材料，b为支架下层细胞，具体为血管内皮细胞。支架的上半部分为(a-c)*y的逐层交替排布方式，其中c为支架上层细胞，具体为成纤维细胞。x、y代表循环周期，为正整数，两者的比例为x:y＝1:1。
[0038]
以下出示本发明一实施方式中多细胞生物复合支架的具体制备方法：
[0039]
取一定量的结冷胶粉体溶于去离子水中，在高温下(>90℃)搅拌30min以上至粉体全部溶解。关闭加热开关，使其自然冷却降温。待结冷胶温度降至低于84℃时，称取一定量的高粘度海藻酸钠、甲基纤维素和srsio3微米颗粒加入其中，连续搅拌使其充分混合。待混合完全的高粘度流体温度降至室温时，会形成近似固态的柔软浆料，即为以上所述ss-gam无机-有机复合生物墨水。所述结冷胶的浓度为1-4％，优选浓度为2.8％。所述海藻酸钠的浓度为1-3％，优选浓度为1.6％。所述甲基纤维素的浓度为1-3％，优选浓度为2.8％。srsio3微米颗粒的含量为水凝胶中结冷胶粉体质量的0-10％。注意在本发明中所述的所有srsio3微米颗粒在ss-gam无机—有机复合生物墨水的含量均指其相对于结冷胶粉体质量的百分比。
[0040]
细胞悬液准备：准备血管内皮细胞，将其分散在细胞相容性液体中制成细胞悬液1；准备成纤维细胞，将其分散在细胞相容性液体中制成细胞悬液2。所述细胞相容性液体为内皮细胞培养基ecm、高糖dmem培养基中的至少一种。由于两种细胞相比血管内皮细胞对于培养环境的要求更高，因此优选内皮细胞培养基ecm。细胞悬液中的细胞浓度范围为3000-30000个/μl，优选为10000个/μl。
[0041]
生物3d打印过程：打印机开启以及打印程序设置。本制备过程涉及两个打印模块，包括气压推动挤出式针头和微型压电点样针头，分别作为复合生物墨水和细胞悬液的打印挤出通道。通过气压推动挤出式针头挤出复合生物墨水a，再使用微型压电点样针头吸取细胞悬液1，喷涂在下层生物墨水上，如此循环，得到了呈现(a-b)*x的逐层交替排布方式的下半部分支架，b为血管内皮细胞；接着，再通过气压推动挤出式针头挤出复合生物墨水，使用微型压电点样针头吸取细胞悬液2，喷涂在下层生物墨水上，如此循环，得到了呈现(a-c)*y的逐层交替排布方式的上半部分支架，c为成纤维细胞。打印完毕后的支架使用含有一定量ca
2+
离子的ecm培养基进行交联固化。打印过程中挤出速率等参数控制并非本发明的创新所
在，试验过程中根据需求进行调整即可。例如打印过程中生物墨水a的挤出压力范围为230-280kpa，点样针头喷涂细胞悬液1、2时的频率为110hz。
[0042]
将交联固化后的支架置于六孔板中。每个支架需加入2ml的ecm培养基，将孔板放置在37℃恒温培养箱中进行体外培养，隔天换液。
[0043]
在本公开中所制备的无机—有机复合的活细胞支架，两种细胞在支架内呈现三维空间中层状分布，能够模拟含有血管的人体皮肤真皮层的生理结构，可以促进血管再生以及真皮结构重建。
[0044]
一些实施方式中，本发明的支架具有多孔结构。该多孔结构主要是指支架在宏观上具有的三角形大孔结构。首先，与目前大多数连续片状或块状的人造组织不同，本发明中公开的这种呈现网状大孔结构的支架能够尽可能增加移植后支架的透气性，保证支架内部的细胞充分接触氧气和养料，为细胞活动提供广阔的空间。其次，在移植后，多孔结构对周围组织和血管的长入具有非常显著的促进作用，能够极大增强支架和宿主的结合能力，包括血管的有效连接以及组织整合。最后，这种宏观大孔结构能够保证支架的弹性和柔软度，在被拉伸和折叠的时候孔发生变形，支架并不会产生结构破坏。
[0045]
下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
[0046]
实施例1
[0047]
srsio3微米颗粒的制备：
[0048]
称取2.116g sr(no3)2和2.842g na2sio3·
9h2o于两个烧杯中，分别量取50ml去离子水加入两个烧杯，搅拌至晶体完全溶解；使用滴管将sr(no3)2溶液缓慢滴加入na2sio3溶液中，边滴加边搅拌直至二者完全混合；量取约50ml无水乙醇倒入其中，封住杯口，搅拌30min以上；将混合物倒入50ml聚四氟乙烯水热反应釜，放入烘箱，160℃水热反应8小时；水热结束，待溶液冷却后倒掉上清液，收集下层白色沉淀，去离子水洗3次，每次超声10min，无水乙醇洗3次，每次超声10min；将粉体放入60℃烘箱，烘干后磨碎，得到srsio3微米颗粒。
[0049]
图1为按照上述方法制备出的srsio3微米颗粒的扫描电镜照片和x射线衍射分析结果，证明制备出了规整的形貌近似六棱柱状的纯相srsio3微米颗粒。
[0050]
实施例2
[0051]
ss-gam无机-有机复合生物墨水的制备
[0052]
称取0.7g结冷胶粉体于广口瓶中，加入25ml灭菌后的去离子水，置于水浴锅中在90℃下搅拌30min以上至粉体全部溶解；关闭加热开关，使溶液自然冷却降温；待溶液温度降至低于84℃时，称取0.4g高粘度海藻酸钠、0.7g甲基纤维素和一定量(0g，0.014g，0.035g，0.07g四种含量)srsio3微米颗粒加入其中，连续搅拌使其充分混合；待混合完全的高粘度流体温度降至室温，在紫外光下照射约1h，即得到无菌的gam，2ss-gam，5ss-gam，10ss-gam四种梯度srsio3含量的无机-有机复合生物墨水。
[0053]
图2表明gam水凝胶为结冷胶、海藻酸钠和甲基纤维素物理结合的产物(参见图2中的a)，复合了srsio3微米颗粒后的生物墨水具有打印所需的剪切变稀性能(参见图2中的
b)，良好的成型性能(参见图2中的c)，能够广泛适用于不同形状支架的制备。
[0054]
实施例3
[0055]
ss-gam无机-有机复合的活细胞支架的制备
[0056]
步骤一：梯度ss-gam无机-有机复合生物墨水的制备
[0057]
称取0.7g结冷胶粉体于广口瓶中，加入25ml去离子水，置于水浴锅中在90℃下搅拌30min以上至粉体全部溶解；关闭加热开关，使溶液自然冷却降温；待溶液温度降至低于84℃时，称取0.4g高粘度海藻酸钠、0.7g甲基纤维素和一定量(0g，0.014g，0.035g，0.07g四种梯度含量)的srsio3微米颗粒加入其中，连续搅拌使其充分混合；待混合完全的高粘度流体温度降至室温，在紫外光下照射约1h，即得到无菌的gam，2ss-gam，5ss-gam，10ss-gam四种梯度srsio3含量的无机-有机复合生物墨水。
[0058]
步骤二：细胞悬液1、2的制备
[0059]
将培养中的血管内皮细胞均匀分散于内皮细胞培养基ecm，细胞密度为10000个/μl，得到细胞悬液1；将培养中的成纤维细胞均匀分散于内皮细胞培养基ecm，细胞密度为10000个/μl，得到细胞悬液2。
[0060]
步骤三：打印ss-gam无机—有机复合的活细胞支架
[0061]
a.设置打印程序。打印支架为正六边形的多孔结构，孔形状为三角形。支架的半径8mm，厚度约1.5mm。
[0062]
b.微型压电点样针头使用无菌水清洗若干次后擦干备用，将制备好的ss-gam无机—有机复合生物墨水填入料筒，装入气压推动挤出式打印模块；将制备好的细胞悬液1、2分别加入96孔板的孔1、2备用。
[0063]
c.通过气压推动挤出式针头挤出复合生物墨水，再使用微型压电点样针头吸取细胞悬液1，喷涂在下层生物墨水上，如此循环，得到了呈现(a-b)*x的逐层交替排布方式的下半部分支架，b为血管内皮细胞；接着，再通过气压推动挤出式针头挤出复合生物墨水，使用微型压电点样针头吸取细胞悬液2，喷涂在上层生物墨水上，如此循环，得到了呈现(a-c)*y的逐层交替排布方式的上半部分支架，c为成纤维细胞。该实施例中，x＝5，y＝5，x:y＝1:1。
[0064]
使用gam，2ss-gam，5ss-gam，10ss-gam四种梯度srsio3含量的无机-有机复合生物墨水分别进行打印。打印过程中生物墨水的挤出压力范围为230-280kpa，点样针头喷涂细胞悬液1、2时的频率为110hz。最终得到四种ss-gam无机-有机复合的活细胞支架，分别命名为为co-gam，co-2ss-gam，co-5ss-gam，co-10ss-gam。
[0065]
打印完毕后的支架使用含有一定量ca
2+
离子的ecm培养基进行交联固化。将交联固化后的支架置于六孔板中。每个支架需加入2ml的ecm培养基，将孔板放置在37℃恒温培养箱中进行体外培养，隔天换液。
[0066]
图3显示打印出的四种支架的外形，支架柔软可连续折叠三次不发生形状破坏。srsio3微米颗粒较为均匀地分散在支架内部不发生团聚。由于srsio3微米颗粒含量的不用，四种支架能够梯度释放不同浓度的sr、si离子。
[0067]
实施例4
[0068]
ss-gam无机-有机复合的活细胞支架的细胞分布
[0069]
步骤一：ss-gam无机-有机复合生物墨水的制备
[0070]
称取0.7g结冷胶粉体于广口瓶中，加入25ml去离子水，置于水浴锅中在90℃下搅
拌30min以上至粉体全部溶解；关闭加热开关，使溶液自然冷却降温；待溶液温度降至低于84℃时，称取0.4g高粘度海藻酸钠、0.7g甲基纤维素和一定量(0g-0.07g)的srsio3微米颗粒加入其中，连续搅拌使其充分混合；待混合完全的高粘度流体温度降至室温，在紫外光下照射约1h，即得到无菌的ss-gam无机-有机复合生物墨水。
[0071]
步骤二：荧光标记的细胞悬液1、2的制备
[0072]
将培养中的血管内皮细胞用绿色荧光标记，均匀分散于内皮细胞培养基ecm，细胞密度为10000个/μl，得到细胞悬液1(含绿色荧光)；将培养中的成纤维细胞均匀用红色荧光标记，分散于内皮细胞培养基ecm，细胞密度为10000个/μl，得到细胞悬液2(含红色荧光)。
[0073]
步骤三：打印ss-gam无机-有机复合的活细胞支架
[0074]
a.设置打印程序。打印支架为正六边形的多孔结构，孔形状为三角形。支架的半径8mm，厚度约1.5mm。
[0075]
b.微型压电点样针头使用无菌水清洗若干次后擦干备用，将制备好的ss-gam无机-有机复合生物墨水填入料筒，装入气压推动挤出式打印模块；将制备好的细胞悬液1、2分别加入96孔板的孔1、2备用。
[0076]
c.通过气压推动挤出式针头挤出复合生物墨水，再使用微型压电点样针头吸取细胞悬液1，喷涂在下层生物墨水上，如此循环，得到了呈现(a-b)*x的逐层交替排布方式的下半部分支架，b为血管内皮细胞；接着，再通过气压推动挤出式针头挤出复合生物墨水，使用微型压电点样针头吸取细胞悬液2，喷涂在上层生物墨水上，如此循环，得到了呈现(a-c)*y的逐层交替排布方式的上半部分支架，c为成纤维细胞。打印过程中生物墨水的挤出压力范围为230-280kpa，点样针头喷涂细胞悬液1、2时的频率为110hz。最终得到ss-gam无机-有机复合的活细胞支架。该实施例中，x＝5，y＝5，x:y＝1:1。
[0077]
d.打印完毕后的支架使用含有一定量ca
2+
离子的ecm培养基进行交联固化。将交联固化后的支架置于六孔板中。每个支架需加入2ml的ecm培养基，将孔板放置在37℃恒温培养箱中进行体外培养，隔天换液。
[0078]
e.将支架从中间切开，使用显微镜观察同一截面处的两种细胞分布情况。
[0079]
图4显示了带有绿色荧光的血管内皮细胞分布在支架下层，带有红色荧光的成纤维细胞分布在支架上层。这种分布情况能够从截面和正面同时观察到并且能至少保持到第5天。这再次证明了ss-gam无机-有机复合的活细胞支架内部的细胞分层结构。
[0080]
实施例5
[0081]
ss-gam无机-有机复合的活细胞支架的细胞活性
[0082]
步骤一：梯度ss-gam无机-有机复合生物墨水的制备
[0083]
称取0.7g结冷胶粉体于广口瓶中，加入25ml去离子水，置于水浴锅中在90℃下搅拌30min以上至粉体全部溶解；关闭加热开关，使溶液自然冷却降温；待溶液温度降至低于84℃时，称取0.4g高粘度海藻酸钠、0.7g甲基纤维素和一定量(0g，0.014g，0.035g，0.07g四种梯度含量)的srsio3微米颗粒加入其中，连续搅拌使其充分混合；待混合完全的高粘度流体温度降至室温，在紫外光下照射约1h，即得到无菌的gam，2ss-gam，5ss-gam，10ss-gam四种梯度srsio3含量的无机-有机复合生物墨水。
[0084]
步骤二：细胞悬液1、2的制备
[0085]
将培养中的血管内皮细胞均匀分散于内皮细胞培养基ecm，细胞密度为10000个/μ
l，得到细胞悬液1；将培养中的成纤维细胞均匀分散于内皮细胞培养基ecm，细胞密度为10000个/μl，得到细胞悬液2。
[0086]
步骤三：打印ss-gam无机-有机复合的活细胞支架
[0087]
a.设置打印程序。打印支架为正六边形的多孔结构，孔形状为三角形。支架的半径8mm，厚度约1.5mm。
[0088]
b.微型压电点样针头使用无菌水清洗若干次后擦干备用，将制备好的ss-gam无机—有机复合生物墨水填入料筒，装入气压推动挤出式打印模块；将制备好的细胞悬液1、2分别加入96孔板的孔1、2备用。
[0089]
c.通过气压推动挤出式针头挤出复合生物墨水，再使用微型压电点样针头吸取细胞悬液1，喷涂在下层生物墨水上，如此循环，得到了呈现(a-b)*x的逐层交替排布方式的下半部分支架，b为血管内皮细胞；接着，再通过气压推动挤出式针头挤出复合生物墨水，使用微型压电点样针头吸取细胞悬液2，喷涂在上层生物墨水上，如此循环，得到了呈现(a-c)*y的逐层交替排布方式的上半部分支架，c为成纤维细胞。该实施例中，x＝5，y＝5，x:y＝1:1。
[0090]
d.使用gam，2ss-gam，5ss-gam，10ss-gam四种梯度srsio3含量的无机-有机复合生物墨水分别进行打印。打印过程中生物墨水的挤出压力范围为230-280kpa，点样针头喷涂细胞悬液1、2时的频率为110hz。最终得到四种ss-gam无机-有机复合的活细胞支架，分别命名为为co-gam，co-2ss-gam，co-5ss-gam，co-10ss-gam。
[0091]
e.打印完毕后的支架使用含有一定量ca
2+
离子的ecm培养基进行交联固化。将交联固化后的支架置于六孔板中。每个支架需加入2ml的ecm培养基，将孔板放置在37℃恒温培养箱中进行体外培养，隔天换液。
[0092]
使用cck-8试剂盒测定支架上的细胞在1、4、7、10天的增殖活性。图5中的a和b表明支架上的细胞能够较长时间保持良好的增殖活性，细胞数量呈现稳定增长，第10天时除co-10ss-gam组外的三组都能够在保持支架形状的基础上支持细胞的增殖。仅从细胞增殖结果来看，四组支架中的细胞都能够保持良好的增殖情况。但是，从荧光显微照片能够看出，虽然co-10ss-gam组细胞数量在增加，但支架本身已经变得散碎，失去了规整的大孔形貌，显然这种情况下支架的结构稳定性相对较低(高含量ss造成的影响)，不能够在保持自身三角形孔结构的基础上支持细胞的长期活动，因此不利于支架在移植方面的应用。
[0093]
使用rt-pcr方法表征支架内细胞的成血管相关基因表达情况。具体为，支架培养5天后，用trizol法提取每组细胞的总rna，并用revertra ace-α试剂盒将rna逆转录为cdna，采用sybr green荧光实时定量pcr的方法探究两种细胞的基因表达情况。从rt-pcr结果可以看出，一定量的srsio3微米颗粒对支架细胞成血管相关基因的表达能够产生一定促进作用。综合来看，相比于对照组，co-2ss-gam能够同时促进四种成血管相关基因的表达(参见图5中的c-f)。由此，我们优选2％srsio3微米颗粒含量的co-2ss-gam复合支架。
[0094]
上述结果表明制备的ss-gam无机—有机复合的活细胞支架具有高生物活性和成血管特性，在促进真皮结构重建和加速创伤修复方面具有极大应用潜力。
[0095]
实施例6
[0096]
无机-有机复合的活细胞支架与细胞接种制备的支架性能对比
[0097]
步骤一：2ss-gam无机—有机复合生物墨水的制备
[0098]
称取0.7g结冷胶粉体于广口瓶中，加入25ml去离子水，置于水浴锅中在90℃下搅
拌30min以上至粉体全部溶解；关闭加热开关，使溶液自然冷却降温；待溶液温度降至低于84℃时，称取0.4g高粘度海藻酸钠、0.7g甲基纤维素和0.014g srsio3微米颗粒加入其中，连续搅拌使其充分混合；待混合完全的高粘度流体温度降至室温，在紫外光下照射约1h，即得到无菌的2ss-gam无机-有机复合生物墨水。
[0099]
步骤二：细胞悬液1、2的制备
[0100]
将培养中的血管内皮细胞均匀分散于内皮细胞培养基ecm，细胞密度为10000个/μl，得到细胞悬液1；将培养中的成纤维细胞均匀分散于内皮细胞培养基ecm，细胞密度为10000个/μl，得到细胞悬液2。
[0101]
步骤三：打印ss-gam无机-有机复合的活细胞支架
[0102]
a.设置打印程序。打印支架为正六边形的多孔结构，孔形状为三角形。支架的半径8mm，厚度约1.5mm。
[0103]
b.微型压电点样针头使用无菌水清洗若干次后擦干备用，将制备好的2ss-gam无机—有机复合生物墨水填入料筒，装入气压推动挤出式打印模块；将制备好的细胞悬液1、2分别加入96孔板的孔1、2备用。
[0104]
c.通过气压推动挤出式针头挤出复合生物墨水，再使用微型压电点样针头吸取细胞悬液1，喷涂在下层生物墨水上，如此循环，得到了呈现(a-b)*x的逐层交替排布方式的下半部分支架，b为血管内皮细胞；接着，再通过气压推动挤出式针头挤出复合生物墨水，使用微型压电点样针头吸取细胞悬液2，喷涂在上层生物墨水上，如此循环，得到了呈现(a-c)*y的逐层交替排布方式的上半部分支架，c为成纤维细胞。该实施例中，x＝5，y＝5，x:y＝1:1。
[0105]
d.打印过程中生物墨水的挤出压力范围为230-240kpa，点样针头喷涂细胞悬液1、2时的频率为110hz。最终得到生物打印的co-2ss-gam活细胞支架。
[0106]
e.打印完毕后的支架使用含有一定量ca
2+
离子的ecm培养基进行交联固化。将交联固化后的支架置于六孔板中。每个支架需加入2ml的ecm培养基，将孔板放置在37℃恒温培养箱中进行体外培养，隔天换液。
[0107]
步骤四：细胞接种方法制备的支架作为对照组
[0108]
a.设置打印程序。打印支架为正六边形的多孔结构，孔形状为三角形。支架的半径8mm，厚度约1.5mm。
[0109]
b.通过气压推动挤出式针头挤出2ss-gam复合生物墨水，打印过程中生物墨水的挤出压力范围为230-240kpa，最终得到2ss-gam纯材料支架。
[0110]
c.取相同体积的细胞悬液1和细胞悬液2，依次用移液枪接种于2ss-gam纯材料支架。得到细胞接种的co-2ss-gam支架。
[0111]
d.将接种完毕后的支架使用含有一定量ca
2+
离子的ecm培养基进行交联固化。将交联固化后的支架置于六孔板中。每个支架需加入2ml的ecm培养基，将孔板放置在37℃恒温培养箱中进行体外培养，隔天换液。
[0112]
体外培养5天后，从两组支架上的细胞增殖和成血管相关基因表达结果来看，生物3d打印技术都具有显著的优越性(参见图6中的a,b)。通过共聚焦显微镜拍摄的培养1,4,7天后支架上细胞分布(绿色荧光)照片能够直观看出，生物3d打印方法能够实现细胞在支架上的大量均匀和分散分布，而传统的细胞接种方法会导致细胞粘附量极低并且分布不均(参见图6中的c)。
[0113]
结果表明我们所采用的生物3d打印方法能够在控制细胞分布，增强细胞粘附的基础上为细胞增殖和基因表达提供空间。由于支架的主体是由水凝胶材料构成，含水量丰富的水凝胶材料通常呈现出较为光滑的表面形貌，这本身极不利于细胞的粘附。因此采用传统的在3d打印纯材料支架上接种细胞的方法时，由于所设计的支架具有网状大孔结构，大多数细胞都会因为重力作用沉积于孔板底部，仅仅只能依靠细胞自身对水凝胶的较弱的贴附能力，造成了支架表面上细胞粘附量极少并且极为不均匀的情况；而本发明中所采用的“细胞书写”方法，在打印时使用压电精密针头喷涂细胞悬液，定位精确定位于每一根水凝胶材料的中轴线上，喷出细密的液滴，能够极大提高细胞在水凝胶光滑表面的粘附率，同时保证细胞的高存活率。
[0114]
实施例7
[0115]
无机-有机复合的活细胞支架的皮下移植实验
[0116]
步骤一：gam、2ss-gam无机-有机复合生物墨水的制备
[0117]
称取0.7g结冷胶粉体于广口瓶中，加入25ml去离子水，置于水浴锅中在90℃下搅拌30min以上至粉体全部溶解；关闭加热开关，使溶液自然冷却降温；待溶液温度降至低于84℃时，称取0.4g高粘度海藻酸钠、0.7g甲基纤维素和一定量(0g，0.014g两种含量)的srsio3微米颗粒加入其中，连续搅拌使其充分混合；待混合完全的高粘度流体温度降至室温，在紫外光下照射约1h，即得到无菌的gam和2ss-gam无机-有机复合生物墨水。
[0118]
步骤二：细胞悬液1、2的制备
[0119]
将培养中的血管内皮细胞均匀分散于内皮细胞培养基ecm，细胞密度为10000个/μl，得到细胞悬液1；将培养中的成纤维细胞均匀分散于内皮细胞培养基ecm，细胞密度为10000个/μl，得到细胞悬液2。
[0120]
步骤三：打印ss-gam无机-有机复合的活细胞支架
[0121]
a.设置打印程序。打印支架为正六边形的多孔结构，孔形状为三角形。支架的半径5mm，厚度约2mm。
[0122]
b.微型压电点样针头使用无菌水清洗若干次后擦干备用，将制备好的ss-gam无机-有机复合生物墨水填入料筒，装入气压推动挤出式打印模块；将制备好的细胞悬液1、2分别加入96孔板的孔1、2备用。
[0123]
c.通过气压推动挤出式针头挤出复合生物墨水，再使用微型压电点样针头吸取细胞悬液1，喷涂在下层生物墨水上，如此循环，得到了呈现(a-b)*x的逐层交替排布方式的下半部分支架，b为血管内皮细胞；接着，再通过气压推动挤出式针头挤出复合生物墨水，使用微型压电点样针头吸取细胞悬液2，喷涂在上层生物墨水上，如此循环，得到了呈现(a-c)*y的逐层交替排布方式的上半部分支架，c为成纤维细胞。该实施例中，x＝10，y＝10，x:y＝1:1。
[0124]
d.使用gam和2ss-gam无机—有机复合生物墨水分别进行打印。打印过程中生物墨水的挤出压力范围为230-250kpa，点样针头喷涂细胞悬液1、2时的频率为110hz。最终得到2种ss-gam无机—有机复合的活细胞支架，分别命名为gam+cells，2ss-gam+cells。
[0125]
e.使用gam和2ss-gam无机—有机复合生物墨水分别进行纯材料支架的打印，形状大小以及厚度与上述活细胞支架相同。打印出的支架命名为gam和2ss-gam支架。
[0126]
f.打印完毕后的支架使用含有一定量ca
2+
离子的ecm培养基进行交联固化。将交联
固化后的支架置于十二孔板中。每个支架需加入1ml的ecm培养基，将孔板放置在37℃恒温培养箱中进行体外培养，隔天换液。
[0127]
步骤四：支架的皮下移植
[0128]
选择8周龄的雄性balb/c裸鼠(spf清洁级)。裸鼠经腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，棉球蘸取碘伏消毒背部皮肤，在背部正中线两旁各做一个纵形切口，用眼科镊钝性分离皮下筋膜，形成一个腔室。将上述四种支架对半切开，半个支架为一个样品。每只裸鼠植入两个不同组样品，切口用无菌手术线缝合并以碘伏消毒，裸鼠按组分笼饲养在spf环境中。移植四周后进行取材，对样品进行免疫组化分析。
[0129]
从he染色结果看出，活细胞支架样品内部细胞量远大于纯材料支架组(参见图7中的a)。cd31免疫组化染色结果显示了样品内血管数量(参见图7中的b)。对样品进行人源cd31的特异性染色，区分打印在支架上的人源血管内皮细胞和裸鼠自身血管内皮细胞。前两组未打印细胞因此不发生显色反应，后两组均有人源血管存在，这证明了生物3d打印活细胞支架在体内环境中能够在保证支架细胞长时间存活的基础上自发形成血管，且血管内已有血细胞存在，证明其与宿主血管系统的融合。在2ss-gam+cells组样品存在有比gam+cells组数量更多的人源血管，证明了srsio3微米颗粒的促成血管作用(参见图7中的c)。
[0130]
上述结果表明制备的2ss-gam无机-有机复合的活细胞支架在体内环境中具有高生物活性和成血管特性，能够保证支架内细胞的长期存活并支持内皮细胞形成功能性血管结构。
[0131]
实施例8
[0132]
无机-有机复合的活细胞支架的裸鼠创伤修复实验
[0133]
步骤一：gam、2ss-gam无机-有机复合生物墨水的制备
[0134]
称取0.7g结冷胶粉体于广口瓶中，加入25ml去离子水，置于水浴锅中在90℃下搅拌30min以上至粉体全部溶解；关闭加热开关，使溶液自然冷却降温；待溶液温度降至低于84℃时，称取0.4g高粘度海藻酸钠、0.7g甲基纤维素和一定量(0g，0.014g两种含量)的srsio3微米颗粒加入其中，连续搅拌使其充分混合；待混合完全的高粘度流体温度降至室温，在紫外光下照射约1h，即得到无菌的gam和2ss-gam无机-有机复合生物墨水。
[0135]
步骤二：细胞悬液1、2的制备
[0136]
将培养中的血管内皮细胞均匀分散于内皮细胞培养基ecm，细胞密度为10000个/μl，得到细胞悬液1；将培养中的成纤维细胞均匀分散于内皮细胞培养基ecm，细胞密度为10000个/μl，得到细胞悬液2。
[0137]
步骤三：打印ss-gam无机-有机复合的活细胞支架
[0138]
a.设置打印程序。打印支架为正六边形的多孔结构，孔形状为三角形。支架的半径7.5mm，厚度约1mm。
[0139]
b.微型压电点样针头使用无菌水清洗若干次后擦干备用，将制备好的ss-gam无机-有机复合生物墨水填入料筒，装入气压推动挤出式打印模块；将制备好的细胞悬液1、2分别加入96孔板的孔1、2备用。
[0140]
c.通过气压推动挤出式针头挤出复合生物墨水，再使用微型压电点样针头吸取细胞悬液1，喷涂在下层生物墨水上，如此循环，得到了呈现(a-b)*x的逐层交替排布方式的下半部分支架，b为血管内皮细胞；接着，再通过气压推动挤出式针头挤出复合生物墨水，使用
微型压电点样针头吸取细胞悬液2，喷涂在上层生物墨水上，如此循环，得到了呈现(a-c)*y的逐层交替排布方式的上半部分支架，c为成纤维细胞。该实施例中，x＝3，y＝3，x:y＝1:1。
[0141]
d.使用gam和2ss-gam无机-有机复合生物墨水分别进行打印。打印过程中生物墨水的挤出压力范围为230-250kpa，点样针头喷涂细胞悬液1、2时的频率为110hz。最终得到2种ss-gam无机-有机复合的活细胞支架，分别命名为gam+cells，2ss-gam+cells。
[0142]
e.使用gam和2ss-gam无机-有机复合生物墨水分别进行纯材料支架的打印，形状大小以及厚度与上述活细胞支架相同。打印出的支架命名为gam和2ss-gam支架。
[0143]
f.打印完毕后的支架使用含有一定量ca
2+
离子的ecm培养基进行交联固化。将交联固化后的支架置于十二孔板中。每个支架需加入1ml的ecm培养基，将孔板放置在37℃恒温培养箱中进行体外培养，隔天换液。
[0144]
步骤四：支架的裸鼠创面移植
[0145]
选择6-8周龄雄性balb/c裸鼠(spf清洁级)。裸鼠经腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，棉球蘸取碘伏消毒背部皮肤，在背部制造一个直径为15mm的圆形全层皮肤缺损创面，随机分成5组。将支架贴敷于创口部位，并用纱布和医用透明敷料(tegaderm tm，3m)固定。裸鼠按组分笼饲养在spf环境中。观察创面愈合情况并对新生皮肤进行组织学分析。
[0146]
从结果能够看出，相比blank组和纯水凝胶gam组，2ss-gam、gam+cells和2ss-gam+cells支架都能够加快创伤愈合速度(参见图8中的a,b)。7天时he染色能够看到移植在伤口部位的支架(黑色虚线)，15天时后三组都已经形成了完整的上皮，伤口愈合情况良好(参见图8中的d)。伤口部位cd31染色结果中2ss-gam+cells组有最多的血管生成，其次是2ss-gam组，这说明了ss对伤口愈合过程中的成血管具有促进作用(参见图8中的e)。
[0147]
上述结果表明在体内srsio3微米颗粒对血管再生具有积极作用，而制备的的活细胞支架能够加速创面愈合，在皮肤再生方面具有极大的应用潜力。
[0148]
实施例9
[0149]
无机-有机复合的活细胞支架的糖尿病小鼠创伤修复实验
[0150]
步骤一：gam、2ss-gam无机-有机复合生物墨水的制备
[0151]
称取0.7g结冷胶粉体于广口瓶中，加入25ml去离子水，置于水浴锅中在90℃下搅拌30min以上至粉体全部溶解；关闭加热开关，使溶液自然冷却降温；待溶液温度降至低于84℃时，称取0.4g高粘度海藻酸钠、0.7g甲基纤维素和一定量(0g，0.014g两种含量)的srsio3微米颗粒加入其中，连续搅拌使其充分混合；待混合完全的高粘度流体温度降至室温，在紫外光下照射约1h，即得到无菌的gam和2ss-gam无机-有机复合生物墨水。
[0152]
步骤二：细胞悬液1、2的制备
[0153]
将培养中的血管内皮细胞均匀分散于内皮细胞培养基ecm，细胞密度为10000个/μl，得到细胞悬液1；将培养中的成纤维细胞均匀分散于内皮细胞培养基ecm，细胞密度为10000个/μl，得到细胞悬液2。
[0154]
步骤三：打印ss-gam无机-有机复合的活细胞支架
[0155]
a.设置打印程序。打印支架为正六边形的多孔结构，孔形状为三角形。支架的半径7.5mm，厚度约1mm。
[0156]
b.微型压电点样针头使用无菌水清洗若干次后擦干备用，将制备好的ss-gam无机-有机复合生物墨水填入料筒，装入气压推动挤出式打印模块；将制备好的细胞悬液1、2
分别加入96孔板的孔1、2备用。
[0157]
c.通过气压推动挤出式针头挤出复合生物墨水，再使用微型压电点样针头吸取细胞悬液1，喷涂在下层生物墨水上，如此循环，得到了呈现(a-b)*x的逐层交替排布方式的下半部分支架，b为血管内皮细胞；接着，再通过气压推动挤出式针头挤出复合生物墨水，使用微型压电点样针头吸取细胞悬液2，喷涂在上层生物墨水上，如此循环，得到了呈现(a-c)*y的逐层交替排布方式的上半部分支架，c为成纤维细胞。该实施例中，x＝3，y＝3，x:y＝1:1。
[0158]
d.使用gam和2ss-gam无机-有机复合生物墨水分别进行打印。打印过程中生物墨水的挤出压力范围为230-250kpa，点样针头喷涂细胞悬液1、2时的频率为110hz。最终得到2种ss-gam无机-有机复合的活细胞支架，分别命名为gam+cells，2ss-gam+cells。
[0159]
e.使用gam和2ss-gam无机-有机复合生物墨水分别进行纯材料支架的打印，形状大小以及厚度与上述活细胞支架相同。打印出的支架命名为gam和2ss-gam支架。
[0160]
f.打印完毕后的支架使用含有一定量ca
2+
离子的ecm培养基进行交联固化。将交联固化后的支架置于十二孔板中。每个支架需加入1ml的ecm培养基，将孔板放置在37℃恒温培养箱中进行体外培养，隔天换液。
[0161]
步骤四：支架的糖尿病创面移植
[0162]
a.选择雄性7-8周龄c57bl/6小鼠，小鼠糖尿病模型通过腹腔注射链脲佐霉素(streptozocin，stz)诱导，具体操作过如下：
①
将stz溶于0.1mol/l柠檬酸钠缓冲液(ph＝4.5)中，现配现用，避光于冰上操作；
②
以50mg/kg的剂量经皮下注射到雄性c57bl/6实验鼠(7～8周)腹腔，每2天注射1次，连续注射10天；
③
4周后测血糖，血糖值升高的数值连续1周高于20mmol/l，同时具有多饮多食多尿、体重减轻的特点，说明小鼠被成功诱导为糖尿病模型，可用于后续实验。
[0163]
b.将小鼠背部区域的毛发剔除后，制造一个直径为15mm的圆形全层皮肤缺损创面，随机分成5组。将支架贴敷于创口部位，再用纱布和医用透明敷料(tegaderm tm，3m)固定。糖尿病小鼠按组分笼饲养在spf环境中。观察创面愈合情况并对新生皮肤进行组织学分析。
[0164]
从结果能够看出，2ss-gam+cells支架具有最好的创伤修复效果(参见图9中的b,c)。相比于其他组，15天时此组已经基本形成了完整上皮，并且已经有新的毛囊生成(参见图9中的d)。masson三色染色中2ss-gam+cells组蓝色面积占比最大(参见图9中的e，图10)，证明此组胶原纤维所占面积百分比最高。
[0165]
上述结果表明生物3d打印2ss-gam无机-有机复合的活细胞支架在修复糖尿病创面过程中具有突出的作用，在治疗慢性难愈合皮肤创伤方面具有极大的应用价值和广阔的应用前景。