基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明胶的方法
【专利摘要】基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明胶的方法，是采用HPLC-FTICR-MS，寻找猪皮明胶酶解混合物的特征性质谱峰；通过同位素标记技术对特征峰进行标记，实现质谱峰的质荷比偏移，以同位素标记后的特征性质谱峰为内标，借助特征峰偏移前后的峰强度的不同，准确计算猪皮明胶添加量。本发明FTICR-MS具有的高分辨率特性，能准确地判断可作为猪皮明胶定量检测的特征峰，提供了猪皮明胶定量检测的前提；利用同位素标记技术和HPLC-FTICR-MS能有效定量检测猪皮明胶添加量，误差范围在10%以内，可为相关部门监控食品提供依据；用胰蛋白酶酶解溶于H218O中的猪皮明胶，可一步完成蛋白质酶解过程和多肽的18O标记过程，缩短了猪皮明胶定量检测所需的时间。
【专利说明】基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明胶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种猪皮明胶的定量检测方法，具体涉及一种基于质谱和同位素标记 建立的定量检测猪皮明胶的方法。
【背景技术】
[0002] 明胶具有凝胶性、乳化性、起泡性、成膜性等多种功能特性，被广泛应用于食品、医 药、照相等领域。目前，商业上大约95%的明胶来源于哺乳动物，如猪皮、牛皮。然而，犹太 教和伊斯兰教人不吃与猪相关的食物，因此，为了鉴别食品中猪皮明胶的添加与否，数量多 少，需要寻找一种能够准确定量检测食品中猪皮明胶添加量的方法。
[0003] 本发明采用高效液相色谱-傅立叶变换离子回旋共振质谱（HPLC-FTICR-MS)，寻 找猪皮明胶酶解混合物的特征性质谱峰；通过同位素标记技术对特征峰进行标记，实现质 谱峰的质荷比偏移，以同位素标记后的特征性质谱峰为内标，借助特征峰偏移前后的峰强 度的不同，准确计算食品中的猪皮明胶添加量。本发明采用胰蛋白酶酶解、HPLC-FTICR-MS 和同位素标记技术确定猪皮明胶添加量，国内外未有文献进行相关报道。
[0004]
【发明内容】
： 本发明旨在提供一种猪皮明胶的定量检测方法，以猪皮明胶为对象，采用胰蛋白酶酶 解、同位素标记、HPLC-FTICR-MS检测，有效确定猪皮明胶的添加量。
[0005] 其具体工艺方案如下： 1、溶液的配制 (1) 碳酸氢氨溶液的配制：分别用H2160和H2180配制10-100mM的碳酸氢氨溶液； (2) 酶的配制：分别用H216(^PH2180配制0.01-1mg/ml的胰蛋白酶溶液； (3) 猪皮明胶溶液的配制：用112160和112180配制的10-100mM的碳酸氢氨溶液溶解猪皮 明胶，分别得到溶于H2160和H2180的0. 1-10mg/ml的猪皮明胶溶液。
[0006] 2、同位素标记 (1) 加酶：将H2160配制的胰蛋白酶加入H2160配制的猪皮明胶中，胰蛋白酶和猪皮明胶 质量比mg/mg为1:200-1:10，将H2180配制的胰蛋白酶加入H2180配制的猪皮明胶中，胰蛋白 酶和猪皮明胶质量比mg/mg为1:200-1:10; (2) 酶解和标记：酶解和标记过程同时进行，反应温度为15-50 °C，反应时间为4-30h； (3) 终止反应：将酶解液置于70-100 °C中5-30min。
[0007] 3、HPLC-FTICR-MS检测 (1) 标记物和未标记物的混合：以H2180中的猪皮明胶水解物为内标，与H2160中的猪皮 明胶水解物按照质量比mg/mg为1:50-50:1混合； (2) 上样检测：混合样品注射进入于FTICR-MS设备连接的HPLC中，对经过HPLC分离 的猪皮明胶水解物进行检测，上样量为〇. 5-20yg。
[0008]4、数据分析 (1) 根据氨基酸序列，寻找猪皮明胶的特征峰； (2) 分析并记录特征峰在标记前后的峰强度； (3) 定量方法的准确性分析：通过比较标记物/未标记物即180/160的计算值与实际混 合比例检验定量方法的准确性， 18〇/16〇按照如下公式计算：
【权利要求】
1. 一种基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明胶的方法，其特征是： A、 溶液的配制 (1) 碳酸氢氨溶液的配制：分别用H216O和H218O配制碳酸氢氨溶液； (2) 酶的配制：分别用H216O和H218O配制胰蛋白酶溶液； (3) 猪皮明胶溶液的配制：用H216O和H218O配制碳酸氢氨溶液溶解猪皮明胶，分别得到 溶于H216O和H218O的猪皮明胶溶液； B、 同位素标记 (1) 加酶：将4160配制的胰蛋白酶加入H216O配制的猪皮明胶中，将H218O配制的胰蛋白 酶加入H218O配制的猪皮明胶中； (2) 酶解和标记：酶解和标记过程同时进行； (3) 终止反应； C、HPLC-FTICR-MS检测 (1) 标记物和未标记物的混合：以H218O中的猪皮明胶水解物为内标与H216O中的猪皮明 胶水解物进行混合； (2) 上样检测：混合样品注射进入于FTICR-MS设备连接的HPLC中，对经过HPLC分离 的猪皮明胶水解物进行检测，上样量为〇. 5-20μg; D、 数据分析： (1) 根据氨基酸序列，寻找猪皮明胶的特征峰； (2) 分析并记录特征峰在标记前后的峰强度； (3) 定量方法的准确性分析：通过比较标记物/未标记物即180/160的计算值与实际混 合比例检验定量方法的准确性， 18CV16O按照如下公式计算：
其中，Itl,I2和I4分别代表未标记即16O的特征肽在实验中测得的单一同位素峰强度， 质量高2Da的峰强度和质量高4Da的峰强度；Mtl,M2和M4分别代表未标记即16O的特征肽 在理论上的单一同位素峰强度，质量高2Da的峰强度和质量高4Da的峰强度。
2. 根据权利要求1所述的一种基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明胶的方 法，其特征是： 所述配制的碳酸氢氨溶液为10-100mM; 所述配制的胰蛋白酶溶液为0. 01-1mg/ml; 所述猪皮明胶溶液的配制是用10-100mM的碳酸氢氨溶液溶解猪皮明胶，分别得到 0· 1-10mg/ml的猪皮明胶溶液。
3. 根据权利要求1所述的一种基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明胶 的方法，其特征是：所述同位素标记当中，H216O配制的胰蛋白酶和猪皮明胶的质量比为 1:200-1:10,H218O配制的胰蛋白酶和猪皮明胶的质量比为1:200-1:10 ; 所述酶解和标记反应温度为15-50 °C，反应时间为4-30h; 所述终止反应条件为将酶解液置于70-100°C中5-30min。
4. 根据权利要求1所述的一种基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明胶的方 法，其特征是：所述以H218O中的猪皮明胶水解物为内标与H216O中的猪皮明胶水解物按照质 量比mg/mg为1:50-50:1混合。
5. 根据权利要求1、2、3或4所述的一种基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明 胶的方法，其特征在于：所述实现特征性质谱峰的质荷比偏移，具体为： 未标记时，胰蛋白酶处理后的猪皮明胶酶解物中特征峰为925. 42212+_925. 46212+，相应 的氨基酸序列为GEPG*PTGVQGP*PGPAGEEGK，其中*表示P被羟基化，经18O标记后，特征峰 的质荷比变成927. 42212-927. 46212++'氨基酸序列GEPG*PTGVQGP*PGPAGEEGK中K的羧基末 端两个16O原子被18O代替。
6. 根据权利要求1、2、3或4所述的一种基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明 胶的方法，其特征在于：所述实现特征性质谱峰的质荷比偏移，具体为： 未标记时，胰蛋白酶处理后的猪皮明胶酶解物中特征峰为9 29 . 46 2 32+_929. 50232+，相应 的氨基酸序列为IG*P*PGPSGISGPPGP*PG*PAGK，其中*表示P被羟基化，经18O标记后，特征 峰的质荷比变成 931. 46232-931. 50232+，氨基酸序列IG*P*PGPSGISGPPGP*PG*PAGK中K的羧 基末端两个16O原子被18O代替。
【文档编号】G01N30/88GK104458989SQ201410718314
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月1日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】涂宗财, 沙小梅, 肖辉, 王辉, 段邓乐, 陈媛, 刘光宪 申请人:江西师范大学